Summary
Cilt dövme intradermal teslimat DNA aşısı için güçlü ve güvenli bir yoldur. Burada, bir DNA plazmid kodlama EGFP bir laboratuvar fare cilt dövme tarafından teslim edilir ve cilt hücrelerinde EGFP ifadesi ardından konfokal mikroskopi tarafından denetlenir.
Abstract
Nükleik asit tabanlı aşılamanın artan ilgi bir konu, immünolojik önemli antijenleri kodlayan özellikle plazmid DNA (pDNA) 'dir. Mühendislik pDNA aşılar uygulandı sonra, transkripsiyonu ve bağışıklık sistemi tepkiler olabilir immünojen proteinler tercüme edilmiştir. DNA aşıları sunma Birçok yönden araştırılmıştır, ancak her teslimat rotayı kendi avantajları ve tuzaklar vardır. Cilt dövme, güvenli maliyet-etkin ve uygun bir roman tekniğidir. Buna ek olarak, iğne tarafından uygulanan delikler de güçlü bir yardımcı madde olarak hizmet edebilir. Burada, a) plazmid DNA kodlama intradermal teslimat göstermek gelişmiş yeşil flüoresan konfokal mikroskopi kullanılarak cilt hücrelerinde EGFP etkili ifade onaylayın dövme cihazı ve b) kullanılarak bir fare modelinde protein (fK-EGFP).
Protocol
1. Plazmid DNA Saflaştırma
- DH5α E.coli yetkili hücrelere ökaryotik plazmid DNA kodlaması EGFP (fK-EGFP) Transform. FK boş vektör ayrıca, bir negatif kontrol olarak da kullanılabilir.
- Kültür ve hasat DH5α E.coli hücreleri ve Qiagen EndoFree Plazmid Arıtma Handbook göre pDNA arındırmak.
- Filtre pDNA 0.22 mikron PVDF steril filtre ile çözüm ve kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın.
2. Dövme Sistem Hazırlama
- Üreticinin talimatlarına göre güç kaynağı birimi için el ünitesi ve kontrol pedalı bağlayın.
- Yaklaşık 100 Hz iğne salınım frekansı ayarlayın. Biz (Stealth Rotary Dövme Sistemi) seçti dövme cihazı için, güç kaynağı üzerindeki kadranı 4 volt olarak ayarlanması gerekir. Kullanım kılavuzu veya diğer dövme sistemleri için teknik desteğe başvurun.
- Iğne ar sterilizeKullanmadan önce ray. Biz hayvan başına bir iğne dizisi kullanmanızı öneririz. Iğneler sabunlu su ile temizlenmeli ve otoklav edildikten sonra tekrar kullanılabilir.
- El ünitesi içine iğne dizi takın ve gevşek plastik kavrama takın.
- Yukarı veya aşağı plastik kavrama hareket ettirerek uygun bir ayara iğne derinliğini ayarlayın. Biz fare deney için, yaklaşık 0.5 mm bir derinlik iğne kullanılmaktadır.
- Iğne derinliği doğru ayarlanmış olduğundan plastik kavrama sıkın ve dövme sistem kullanıma hazırdır.
3. Hayvan Tıraş
- Dövme tedavisinde sitesi seçin. Site, nispeten sert, düz ve etli deri alanı, örneğin, hayvanın hindleg yan olmalıdır.
- Hayvanın vücut ağırlığına göre ketamin (90 mg / kg) ve ksilazin (5 mg / kg) oluşan bir karışım ile bir BALB / C fare anestetize. Diğer hayvanlar için, kurumun anestezi yönergelere bakın.
- Girişhayvan onaylamak için onun ayak kısma hayvanın refleksleri düzgün anestezi olduğunu.
- Yavaş ve dikkatli hayvanın hindlegs de saç kesmek için elektrik düzeltici kullanın. Planlanan dövme site ve çevredeki saç çıkarın.
- Tek permatik ile rezidüel kısa saç çıkarın. Hayvanın deri kesmek için dikkatli olun. Tüy dökücü krem, alternatif bir saç giderme yöntemi olarak kullanılabilir dikkat ediniz; ancak, tüy dökücü krem üzerine tıraş tercih ederim.
- Basınçlı hava Gerekirse deriden sokak kesim tüyleri temizleyin.
4. Dövme ile Plazmid DNA Teslim
- , Bir aşılama protokol daha önce belirlenmiş olması durumunda, doz ve uygulanacak olan DNA çözelti hacminin buna göre hesaplanır. Biz dövme işlemi daha kolay yönetilebilir hale getirmek için pratik olduğu kadar küçük bir birim olarak kullanmanızı öneririz. Bu EGFP gösteri, biz con de DNA çözeltisi 7.5 ul kullanılıryaklaşık 1 cm 2 lik bir alan üzerine tatbik dövme 0.25 mg / ml, ve konsantrasyon. Aşılama deneyleri için, daha yüksek konsantrasyonlarda kuvvetli pDNA bağışıklık yanıtlarını 1,2 indüklemek için gerekli olabilir.
- Dövme sitede doğrudan pipetleme DNA solüsyonu uygulayın. Alternatif olarak, pipetleme ile plastik kavrama içine DNA çözelti yük, yani sıvı iğne ve plastik kavrama ucu arasında bekletilir. Bir gösteri için video bakın. Biz iki yöntem arasında hissedilir bir fark gözlemledim. Bununla birlikte, plastik kavrama içine çözelti yükleme, örneğin dikey deri yüzeyleri üzerinde avantajlı olabilir.
- İğne salınım başlatın ve dövme yerinde hayvanın cilt üzerinde hafif basınç ile iğne dizi yerleştirir. Sonra tüm dövme alana plazmid DNA teslim etmek için lineer bir şekilde ve yavaşça titreşen iğne hareket ettirin. İğne ve önlemek için cilt arasındaki 90 derecelik açı koruyuncilt yaralanmalarını.
- Cilt gözlemleyin. Aşınma ve inflamasyon normaldir. Kanama olursa, dövme işlemi durdurmak ve iğne derinliğini azaltmak.
- Yaklaşık 1 dk için iğne hareketi devam edilmesi ve daha sonra dövme işlemi durdurun.
- Dövme sitede topikal analjezik ince bir tabaka uygulamak için temiz bir pamuklu bez kullanın. Böyle Silver Sulfadiazine Krem (SSD Krem) veya Neosporin merhem gibi Topikal analjezik hayvanların ağrı veya sıkıntı hafifletmeye yardımcı olabilir ve bu nedenle anestezi kapalı giyer önce bunları uygulamak için tavsiye edilir. Ağrı veya sıkıntı (yürüme, hareketsizlik değişim) belirtileri için ertesi gün hayvanları gözlemleyin. Belirtileri devam ederse analjezik krem yeniden uygulayın.
5. Antijen İfade Onayı
- Dövme tedavisi (farklı pDNA yapıları farklı anlatım kez gerektirdiğini unutmayın) sonra 48 saat, fare CO 2 narkoz tarafından ötenazi edilir. Diğer içinhayvanlar, kurumunuzun ötanazi yönergelere bakın.
- Dövme sahada deri teşrih ve 4 ° C'da gece boyunca% 4 paraformaldehit içinde doku düzeltmek.
- % 70 etanol ile doku durulayın ve görüntüleme için 1X PBS içine aktarın.
- EGFP sinyalleri kontrol etmek için bir konfokal mikroskop kullanarak tüm doku inceleyin. Alternatif olarak, cilt dokusu parafin içine gömülmüş ve bir floresan mikroskop altında bölümlerde incelenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
509 nm 488 nm ve emisyon zirvesinde bir uyarma zirve ile EGFP ifadesi fare deri hücreleri görülebilir. Yaklaşık 3 × içeren bir DNA 1.875 mikrogram doz, 10 Gönderen plazmid 17 kopya, biz genellikle 2 alana dövme 1 cm 10-20 EGFP sinyalleri görülmektedir. Transfekte edilmiş hücrelerin Bu, nispeten az sayıda bir önceki çalışmada, 3 sonuçları ile uyum içindedir. EGFP ifade (Şekil 1) plazmid EGFP DNA dövme tekniği kullanarak hayvanın deri hücrelerine teslim edildiğini kanıtlar sunmaktadır.
48 saat bir konfokal mikroskop ile izlendi bir BALB / c fare hindleg üzerinde dövme tedaviden sonra cilt hücrelerindeki Şekil 1. EGFP ifadesi. Birden fazla odak düzlemi gelen EGFP sinyalleri A) projeksiyon. Bir şarkı B) EGFP ifadesile hücre.
Sorun Giderme
1. Hayır antijen ekspresyonu (hayır EGFP pozitif kontrol sinyalleri gibi) tespit edilir.
- 2 plazmid DNA çözeltisinin konsantrasyonu arttırmak - 5-misli. Biz, 0.2 mg / ml 'lik bir başlangıç konsantrasyonu önerilir. 5 gibi yüksek konsantrasyonları mg / ml Deneyler 3 dövme DNA için rapor edilmiştir.
- Dövme yerinde fare cilt kolayca jilet ve iğneler tarafından kesilir gibi, cildin ciddi zarar kaçının.
- DNA yapısı, denemeniz için uygun olduğundan emin olun.
- Plazmid DNA çoğunluğu, süper veya kapalı bir dairesel biçimde olduğundan emin olmak için jel elektroforezi gerçekleştirin.
2. Şiddetli kanama veya deriye zarar dövme yerinde meydana gelmektedir.
- Iğne derinliği azaltır.
- Iğne dizi ve cilt arasında 90 derecelik bir açı koruyun.
- Sırasında uygulanan kuvvet azaltırtedavi dövme.
- Dövme hareketin hızını düşürün.
3. Arka plan sinyali çekerken EGFP çok yüksek.
- Dövme önce mümkün olduğunca çok saç kaldırmak için yepyeni bir tek güvenlik jilet kullanın. Bazen disseksiyon önce tekrar tıraş için gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bunun manipülasyon gerektiren, ya canlı veya zayıflatılmış patojen 4 aşılar göstermiyor gibi DNA aşılama geleneksel aşılama stratejileri daha güvenli olarak kabul edilir. Ancak DNA aşılama sonucu teslimat güzergahı üzerinde büyük ölçüde bağlıdır. Deri gibi Langerhans Hücreleri ve dendritik hücreler 1, ve böylece immunojenite ve erişim 5,6 kolaylığı açısından bağışıklama için ideal bir site olarak antijen sunan hücreler, bol miktarda bulunur. Sonuç olarak, deri içi aşılama stratejisi DNA aşıları için en popüler seçenek biridir. Olarak bu videoyu gösterildiği, DNA dövme intradermal bir DNA aşı yönetmek için basit ama umut verici bir yoldur. İlginçtir, dövme işlemi nedeniyle inflamatuvar yanıtları aynı zamanda doğal ve güçlü adjuvan 1,2 olarak hizmet verebilir. Bu DNA dövme maymun T-hücresi yanıtı olan 100 kat kadar artış olduğunu ortaya çıkarabilir rapor edilmiştir gibi hayvanlarda imm içinde T-hücresi yanıtı ile karşılaştırıldığındaintramusküler yolla 7,8 ile unized. Bu tür gen tabancası gibi diğer dermal teslimat yöntemleri ile karşılaştırıldığında, DNA dövme çeşitli avantajlar tutar. İlk olarak, DNA dövme pahalı ekipman ve taşıyıcılar, örneğin, altın parçacıkları gerektirmez. Bu özellikle gelişmekte olan ülkeler için, aşı dağıtımı açısından büyük bir avantaj olacaktır. İkincisi, bu yüksek basınçlı hava antijen ifade seviyesini azaltmak olabilir kesme kuvvetine bağlı olarak pDNA hasara neden olduğu bilinmektedir. Bir çalışmada toplam pDNA 9 DNA dövme zararları olduğu az% 3 göstermiştir. Sonunda, yapılan DNA dövme potansiyel güçlü bir bağışıklık yanıtı verebilecek cilt geniş bir alanı kapsayabilir. Dövme cihazları da peptid / protein aşı sağlamak için de kullanılabilir, ve humoral ve hücre aracılı immün cevaplar her ikisi de 10 indüklemek için kanıtlanmıştır. Şimdi deri bir DNA bizim hayvan deneylerinde rutin dövme kullanabilirsiniz prime-protein artırmak aşılama protokolünü (üç DNA asal izlediiki protein ile), 16 haftalık bir süre boyunca artırır ve başarılı bir şekilde HIV-1 gp120 karşı farelerde, güçlü bir bağışıklık yanıtları uyarmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz onların yardım ve teknik destek için İşbirlikçi Bilim, NYUMC Mikroskopisi Core Ofisi'nde Kong Lab ve Dr Yan Deng tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma AIDS Araştırma için New York Üniversitesi Merkezi (CFAR, NIH hibe AI027742) adlı bir pilot hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCX-EGFP plasmid DNA | Clontech | ||
| STEALTH Rotary Tattoo System | Worldwide Tattoo Supply | STEALTH-L | |
| Tattoo needles | Worldwide Tattoo Supply | 1207RSB | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| 0.22 μm PVDF sterile filter | Millipore | SLGV013SL | |
| electrical hair trimmer | Commercially available | ||
| disposable safety razors | Commercially available | ||
| Silver Sulfadiazine Cream | Watson | NDC 0591-0810-55 | |
| Ketamine HCL | NDC 0856-2012-01 | ||
| Zylazine Sterile Solution | NADA 139-236 |
References
- Bins, A. D. A rapid and potent DNA vaccination strategy defined by in vivo monitoring of antigen expression. Nat Med. 11, 899-904 (2005).
- Pokorna, D., Rubio, I., Muller, M. DNA-vaccination via tattooing induces stronger humoral and cellular immune responses than intramuscular delivery supported by molecular adjuvants. Genet. Vaccines Ther. 6, 4 (2008).
- van den Berg, J. H. Optimization of intradermal vaccination by DNA tattooing in human skin. Hum. Gene Ther. 20, 181-189 (2009).
- Liu, M. A.
- Koide, Y., Nagata, T., Yoshida, A., Uchijima, M.
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Verstrepen, B. E. Improved HIV-1 specific T-cell responses by short-interval DNA tattooing as compared to intramuscular immunization in non-human primates. Vaccine. 26, 3346-3351 (2008).
- Potthoff, A. Immunogenicity and efficacy of intradermal tattoo immunization with adenoviral vector vaccines. Vaccine. 27, 2768-2774 (2009).
- Quaak, S. G. DNA tattoo vaccination: effect on plasmid purity and transfection efficiency of different topoisoforms. J. Control Release. 139, 153-159 (2009).
- Pokorna, D. Vaccination with human papillomavirus type 16-derived peptides using a tattoo device. Vaccine. 27, 3519-3529 (2009).
