Summary
Skin tatovering er en potent og trygg måte å levering DNA-vaksine intradermalt. Her er en DNA-plasmid som koder for EGFP levert av tatovering til huden av et laboratorium mus, og ekspresjon av EGFP i hudcellene deretter inspisert av konfokal mikroskopi.
Abstract
Nukleinsyre-basert vaksinasjon er et tema av økende interesse, spesielt plasmid DNA (pDNA) koding immunologisk viktige antigener. Etter den utviklet pDNA administreres til vaksiner, er det transkriberes og oversatt til immunogen proteiner som kan fremkalle reaksjoner fra immunsystemet. Mange måter å levere DNA-vaksiner er undersøkt, men hver leveranse rute har sine egne fordeler og fallgruver. Skin tatovering er en ny metode som er trygg, kostnadseffektiv og praktisk. I tillegg kunne de punkteringer påført av nålen også tjene som et potent adjuvans. Her har vi a) demonstrere intradermal levering av plasmid DNA-koding forbedret grønt fluorescerende protein (PCX-EGFP) i en mus modell med en tatovering enhet og b) bekrefte effektiv uttrykk for EGFP i hudcellene ved hjelp konfokalmikroskopi.
Protocol
1. Plasmid DNA Rensing
- Transformere eukaryote plasmid DNA-koding EGFP (PCX-EGFP) i DH5α E.coli kompetente celler. Den tomme PCX vektoren kan også bli brukt som en negativ kontroll.
- Kultur og høste DH5α E.coli celler og rense pDNA henhold til Qiagen EndoFree Plasmid Rensing Handbook.
- Filter pDNA løsningen gjennom et 0,22 um PVDF sterilt filter, og lagre det ved -20 ° C inntil bruk.
2. Tattoo System Forberedelse
- Koble den håndholdte enheten og pedal til strømforsyningsenheten per produsentens instruksjoner.
- Still nålen svingning frekvens til omtrent 100 Hz. For tatovering enheten vi valgte (Stealth Rotary Tattoo System), skal skiven på strømforsyningen settes til 4 volt. Referere til brukerhåndbøker eller teknisk støtte for andre tatovering systemer.
- Nålen array før bruk. Vi anbefaler å bruke en nål rekke per dyr. Nålene kan brukes på ny etter å være renset med såpevann og autoklaveres.
- Sett inn nålen rekke inn i håndholdt enhet og løst feste plast grep.
- Justere nålens dybde til en passende innstilling ved å bevege plastikk grep opp eller ned. Vi brukte en nål dybde på ca 0,5 mm for vår mus eksperiment.
- Stram plast grep når nålen dybde er riktig innstilt, og tatoveringen systemet er klart til bruk.
3. Animal Barbering
- Velg stedet for tatovering behandling. Området bør være en relativt fast, flat og kjøttfulle område av huden, for eksempel på siden av dyrets bakben.
- Anesthetize en BALB / c mus med en blanding av ketamin (90 mg / kg) og xylazin (5 mg / kg) i henhold til dyrets kroppsvekt. For andre dyr, kan du se anestesi retningslinjer institusjonen.
- Sjekkdyr reflekser ved å knipe foten for å bekrefte at dyret er riktig bedøvet.
- Bruk den elektriske trimmer for å trimme ned håret på dyrets bakbena sakte og forsiktig. Fjerne hår fra den planlagte tatovering området og området rundt.
- Fjerne rester kortere hår med disponibel barberhøvel. Vær forsiktig så du ikke å kutte dyrets hud. Merk at Hårfjerningskrem kan brukes som en alternativ hår-fjerning metoden, men foretrekker vi shaving enn Hårfjerningskrem.
- Fjern bortkommen snitt hår fra huden med trykkluft hvis det er nødvendig.
4. Produksjonstid av plasmid DNA ved Tatovering
- Hvis en immunisering protokoll er etablert tidligere, bør dosen og volum av DNA-løsningen som skal anvendes beregnes deretter. Vi anbefaler å bruke så lite volum som mulig for å gjøre tatovering prosessen mer håndterlig. I denne EGFP demonstrasjonen, brukte vi 7,5 ul DNA løsning til en conkonsentrasjonen av 0,25 mg / ml, som ble påført på en tatovering område på omtrent 1 cm 2. For immunisering eksperimenter, kan høyere pDNA konsentrasjoner bli pålagt å indusere sterke immunreaksjoner 1,2.
- Påfør DNA-løsningen ved å pipettere direkte på tatovering nettstedet. Alternativt, laster DNA-løsningen inn i plast grep ved pipettering, slik at væsken er suspendert mellom nålen og spissen av plast grep. Henvis til videoen for en demonstrasjon. Vi har observert ingen merkbar forskjell mellom de to metodene. Imidlertid kan lasting løsningen inn i plast grep være fordelaktig på vertikale hudoverflater, for eksempel.
- Start nålen oscillasjon og plasser nålen array med lett trykk på dyrets hud ved tatovering nettstedet. Deretter flytter oscillerende nålen langsomt og forsiktig på en lineær måte for å levere plasmid DNA over hele tatovering området. Opprettholde en 90-graders vinkel mellom nålen og huden for å unngåflenger i huden.
- Observere huden. Slitasje og betennelser er normalt. Hvis blødningen skjer, stopp tatovering prosessen og redusere nålen dybde.
- Fortsett nålen bevegelse i ca 1 min, og deretter stoppe tatovering prosessen.
- Bruk en ren bomullspinne å påføre et tynt lag med aktuell smertestillende på tatovering nettstedet. Aktuelle analgesi som sølvsulfadiazin Cream (SSD Cream) eller Neosporin salve kan bidra til å lindre smerte eller ubehag av dyrene, og derfor er det anbefalt å bruke dem før bedøvelsen slites av. Observere dyrene neste dag etter tegn på smerte eller ubehag (endring av gangart, inaktivitet). Påfør smertestillende krem hvis skiltene vedvarer.
5. Bekreftelse på antigenuttrykk
- 48 timer etter den tatovering behandling (merk at ulike pDNA konstruerer kan kreve ulike uttrykk ganger), er musen avlives av CO 2 narkose. For andredyr, kan du se eutanasi retningslinjer institusjonen.
- Dissekere huden på tatovering området, og fikse vevet i 4% paraformaldehyd ved 4 ° C over natten.
- Skyll vevet med 70% etanol, og overføre den til 1X PBS for avbilding.
- Undersøke hele vev ved hjelp av en confocal mikroskop for å se etter EGFP signaler. Alternativt, kan huden vev være innebygd i parafinvoks og undersøkt i seksjoner under et fluorescerende mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uttrykk for EGFP med en eksitasjon topp på 488 nm og utslipp topp på 509 nm kan observeres i mus hudceller. Fra en 1.875 mikrogram dose av DNA, som inneholder ca 3 × 10 17 eksemplarer av plasmidet, vi vanligvis observert 10-20 EGFP signaler i 1 cm 2 tatovert området. Dette relativt lave antall transfekterte celler er konsistent med resultatene av en tidligere undersøkelse 3. Den EGFP uttrykk (figur 1) gir bevis for at EGFP plasmid ble levert inn i dyrets hud celler ved hjelp av DNA tatovering teknikk.
Figur 1. EGFP uttrykk i hudcellene 48 hr etter tatovering behandling på bakben av en BALB / c mus sett med en confocal mikroskop. A) En fremskrivning av EGFP signaler fra flere kontaktpunkter fly. B) EGFP uttrykk i en single celle.
Feilsøking
1. Ingen antigen uttrykk oppdages (f.eks ingen EGFP positive styresignaler).
- Øke konsentrasjonen av plasmid DNA-løsningen av 2 - til 5-ganger. Vi anbefaler en utgangskonsentrasjon på 0,2 mg / ml. Konsentrasjoner så høye som 5 mg / ml er blitt rapportert for DNA tatovering eksperimenter 3.
- Unngå alvorlig skade på huden, som mus huden på tatovering nettstedet er enkelt skjære av barberhøvler og nåler.
- Kontroller at DNA konstruksjon er egnet for eksperimentet.
- Utfør gelelektroforese for å kontrollere at flertallet av plasmid DNA er i supercoil eller lukket sirkulær form.
2. Alvorlig blødning eller skade på huden skjer på tatovering nettstedet.
- Redusere nålen dybde.
- Opprettholde en 90-graders vinkel mellom nålen array og huden.
- Reduser kraften undertatovering behandling.
- Redusere hastigheten tatovering bevegelsen.
3. Bakgrunnen signalet er for høy når bildebehandling EGFP.
- Bruk en splitter ny disponibel barberhøvel for å fjerne så mye hår som mulig før tatovering. Noen ganger er det nødvendig å barbere igjen før disseksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA-vaksinering anses tryggere enn tradisjonelle vaksinasjonsstrategier som det ikke krever manipulasjon av, eller utsett vaksiner til, live eller dempes patogener 4. Imidlertid avhenger resultatet av DNA-vaksinering tungt på levering ruten. Skin er rik på antigen-presentasjon celler, for eksempel Langerhans celler og dendrittiske celler 1, og dermed et ideelt område for immunisering i form av immunogenitet og enkel tilgang 5,6. Som et resultat, er intradermal vaksinasjon strategi en av de mest populære valgene for DNA-vaksiner. Som vist i denne videoen, er DNA tatovering en enkel, men lovende måte å administrere en DNA-vaksine intradermalt. Interessant, kan de inflammatoriske responser som forårsakes av tatovering prosessen også tjene som et naturlig og potent adjuvant 1,2. Det har blitt rapportert at DNA tatovering kan fremkalle opptil en 100-gangers økning i T-celle responser i aper, sammenlignet med T-celle-responser i dyr immunized via intramuskulært 7,8. Sammenlignet med andre dermal leveringsmetoder, for eksempel genet gun, innehar DNA tatovering flere fordeler. Først, DNA tatovering ikke krever dyrt utstyr og bærere, dvs. gull partikler. Dette ville være en stor fordel i forhold til vaksine distribusjon, spesielt for utviklingsland. Dernest er det kjent at høyt lufttrykk kan forårsake skade på grunn av pDNA skjærkraft, noe som kan redusere antigenuttrykk nivå. En studie har vist at DNA tatovering skader mindre enn 3% av total pDNA 9. Endelig kan DNA tatovering dekke et stort område av huden, noe som potensielt kan bringe frem en sterkere immunrespons. Tatoveringsprodukter enheter kan også brukes til å levere peptid / protein vaksiner, og har vist seg å indusere både humorale og celle-mediert immunrespons 10. Vi bruker nå huden tatovering rutinemessig i våre dyreforsøk i en DNA prime-protein boost vaksinasjon protokollen (tre DNA primtall fulgtetter to protein øker over en periode på 16 uker), og vi har hell indusert i mus sterke immunresponser mot HIV-1 gp120.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke alle medlemmer av Kong Lab og Dr. Yan Deng på Mikroskopi Core, Office of Collaborative Science, NYUMC for deres assistanse og teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av en pilot stipend fra New York University Center for AIDS Research (CFAR, NIH stipend AI027742).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCX-EGFP plasmid DNA | Clontech | ||
| STEALTH Rotary Tattoo System | Worldwide Tattoo Supply | STEALTH-L | |
| Tattoo needles | Worldwide Tattoo Supply | 1207RSB | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| 0.22 μm PVDF sterile filter | Millipore | SLGV013SL | |
| electrical hair trimmer | Commercially available | ||
| disposable safety razors | Commercially available | ||
| Silver Sulfadiazine Cream | Watson | NDC 0591-0810-55 | |
| Ketamine HCL | NDC 0856-2012-01 | ||
| Zylazine Sterile Solution | NADA 139-236 |
References
- Bins, A. D. A rapid and potent DNA vaccination strategy defined by in vivo monitoring of antigen expression. Nat Med. 11, 899-904 (2005).
- Pokorna, D., Rubio, I., Muller, M. DNA-vaccination via tattooing induces stronger humoral and cellular immune responses than intramuscular delivery supported by molecular adjuvants. Genet. Vaccines Ther. 6, 4 (2008).
- van den Berg, J. H. Optimization of intradermal vaccination by DNA tattooing in human skin. Hum. Gene Ther. 20, 181-189 (2009).
- Liu, M. A.
- Koide, Y., Nagata, T., Yoshida, A., Uchijima, M.
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Verstrepen, B. E. Improved HIV-1 specific T-cell responses by short-interval DNA tattooing as compared to intramuscular immunization in non-human primates. Vaccine. 26, 3346-3351 (2008).
- Potthoff, A. Immunogenicity and efficacy of intradermal tattoo immunization with adenoviral vector vaccines. Vaccine. 27, 2768-2774 (2009).
- Quaak, S. G. DNA tattoo vaccination: effect on plasmid purity and transfection efficiency of different topoisoforms. J. Control Release. 139, 153-159 (2009).
- Pokorna, D. Vaccination with human papillomavirus type 16-derived peptides using a tattoo device. Vaccine. 27, 3519-3529 (2009).
