Summary
Skin tatovering er en potent og sikker måde at levering DNA vaccine intradermalt. Her er et DNA-plasmid koder for EGFP leveret af tatoveringer på huden af et laboratorium mus, og ekspressionen af EGFP i hudceller derpå inspiceret ved konfokal mikroskopi.
Abstract
Nukleinsyre-baseret vaccination er et emne af stigende interesse, især plasmid-DNA (pDNA), som koder immunologisk vigtige antigener. Efter det konstruerede pDNA administreres til vacciner er det transkriberes og translateres til immunogene proteiner, som kan fremkalde reaktioner fra immunsystemet. Mange måder at levere DNA-vacciner er blevet undersøgt, men hver leverance rute har sine egne fordele og faldgruber. Skin tatovering er en ny teknik, der er sikker, omkostningseffektiv og praktisk. Desuden kunne de punkteringer påført af nålen også tjene som en kraftigt virkende adjuvans. Her har vi a) viser den intradermale leveringsanordning af plasmid-DNA der koder for forstærket grønt fluorescerende protein (pCX-EGFP) i en musemodel ved anvendelse af en tatovering enhed og b) bekræfter den effektive ekspression af EGFP i hudceller ved hjælp af konfokal mikroskopi.
Protocol
1. Plasmid DNA Purification
- Omdanne eukaryotisk plasmid-DNA der koder for EGFP (pCX-EGFP) ind i DH5a E. coli kompetente celler. Den tomme pCX vektor kan også anvendes som en negativ kontrol.
- Kultur og høst af DH5a E. coli-celler og oprense pDNA ifølge Qiagen EndoFree Plasmid Purification Handbook.
- Filter pDNA løsning gennem et 0,22 um PVDF sterilt filter, og opbevar det ved -20 ° C indtil brug.
2. Tattoo System Preparation
- Tilslut den håndholdte enhed og kontrol pedal til strømforsyningen ifølge producentens anvisninger.
- Indstille nålen oscillationsfrekvens til ca 100 Hz. For den tatovering anordning vi valgte (Stealth Rotary Tattoo System), bør skiven på strømforsyningen sættes til 4 volt. Der henvises til brugsanvisninger eller teknisk support for andre tatovering systemer.
- Steriliser nålen array før brug. Vi anbefaler at bruge en nål vifte per dyr. Nålene kan genbruges efter rengøring med sæbevand og autoklaveret.
- Sæt nålen array i den håndholdte enhed og løst vedhæfte plast greb.
- Juster nålen dybde til en passende ved at flytte plastgreb op eller ned. Vi anvendte en nål dybde på cirka 0,5 mm for vores mus eksperiment.
- Spænd plastik greb, når nålen dybde er korrekt indstillet, og tatoveringen systemet er klar til brug.
3. Animal Barbering
- Vælg websted for tatovering behandling. Stedet bør være en forholdsvis fast, flad, og kødfulde område af huden, for eksempel den side af dyrets bagben.
- Bedøve en BALB / c mus med en blanding af ketamin (90 mg / kg) og xylazin (5 mg / kg) i henhold til dyrets kropsvægt. For andre dyr, henvises til anæstesi retningslinjer for din institution.
- Kontrollerdyrs reflekser ved at knibe sin fod for at bekræfte dyret er korrekt bedøvet.
- Brug den elektriske trimmer til at trimme ned hårene på dyrets bagben langsomt og forsigtigt. Fjern hår fra den planlagte tatovering websted og det omkringliggende område.
- Fjerne resterende kortere hår med den disponible sikkerhedsbarberapparatsystemet. Vær forsigtig med ikke at skære dyrets hud. Bemærk, at hårfjerningsmiddel kan anvendes som alternativ hår-metode til fjernelse, men foretrækker vi barbering end hårfjerningsmiddel.
- Fjern omstrejfende afklippede hår fra huden med trykluft om nødvendigt.
4. Levering af plasmid-DNA ved Tatovering
- Hvis en immuniseringsprotokol er blevet etableret tidligere, skal dosis og omfanget af DNA-opløsning, der skal anvendes, beregnes i overensstemmelse hermed. Vi anbefaler at bruge så lille et volumen som praktisk at gøre tatovering processen mere overskuelig. I denne EGFP demonstration, brugte vi 7,5 pi DNA-opløsning på en contration af 0,25 mg / ml, som blev påført en tatovering areal på ca 1 cm2. For immuniseringsforsøg, kan højere pDNA koncentrationer være forpligtet til at inducere kraftige immunresponser 1,2.
- Påfør DNA-opløsningen ved pipettering direkte på tatovering site. Alternativt kan indlæse DNA-opløsningen i plasten greb ved pipettering, og væsken er suspenderet mellem nålen og spidsen af plast greb. Se videoen for en demonstration. Vi har observeret nogen bemærkelsesværdig forskel mellem de to metoder. Dog kan indlæse opløsningen i plastgreb være fordelagtigt på lodrette hudoverflader, f.eks.
- Start nålen svingning og placere nålen array med let tryk på dyrets hud ved tatovering site. Flyt derefter den oscillerende nål forsigtigt og langsomt på en lineær måde at levere plasmid-DNA over hele tatovering området. Oprethold en 90-graders vinkel mellem nålen og huden for at undgårifter på huden.
- Overhold huden. Slid og inflammation er normal. Hvis blødningen sker, stoppe tatovering proces og mindske nålen dybde.
- Fortsæt nålen bevægelse i ca 1 min, og derefter stoppe den tatovering proces.
- Brug en ren vatpind til at anvende et tyndt lag af topisk analgetikum på den tatovering site. Topiske analgetika såsom sølv sulfadiazin Cream (SSD Cream) eller Neosporin salve kan hjælpe med at lindre smerte eller lidelse for dyrene, og derfor anbefales det at anvende dem, før bedøvelsen aftager. Observere dyrene den næste dag for tegn på smerte eller lidelse (ændring af gangart, inaktivitet). Genanvende smertestillende creme, hvis tegnene fortsætter.
5. Bekræftelse af antigenekspression
- 48 timer efter den tatovering behandling (bemærk, at forskellige pDNA-konstruktioner kan kræve forskellige ekspressionssystemer gange), er musen aflivet ved CO2 narkose. For andredyr, henvises til eutanasi retningslinjer for din institution.
- Dissekere huden på tatovering site, og fiksere vævet i 4% paraformaldehyd ved 4 ° C natten over.
- Skyl vævet med 70% ethanol, og anbringes i 1X PBS for billeddannelse.
- Undersøge hele vævet med et konfokalt mikroskop for at kontrollere for EGFP-signaler. Alternativt kan hudvævet være indlejret i paraffin og behandlet i sektioner under et fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ekspressionen af EGFP med en excitations-top ved 488 nm og emission top ved 509 nm kan observeres i mus hudceller. Fra en 1,875 ug dosis af DNA, der indeholder ca 3 x 10 17 kopier af plasmidet, vi typisk set 10-20 EGFP signaler i 1 cm 2 tatoverede område. Dette relativt lave antal af transficerede celler er i overensstemmelse med resultaterne af en tidligere undersøgelse 3. EGFP ekspression (figur 1) tilvejebringer bevis for, at EGFP plasmid blev leveret ind i dyrets hud celler under anvendelse af DNA tatovering teknikken.
Figur 1.. EGFP-ekspression i de hudceller 48 timer efter tatovering behandling på bagbenene af en BALB / c mus vist med et konfokalt mikroskop. A) Et fremspring af EGFP signaler fra flere fokusplan. B) EGFP udtryk i et single celle.
Fejlfinding
1. Ingen antigen ekspression afsløres (f.eks ingen EGFP positive styresignaler).
- Forøge koncentrationen af plasmid-DNA-opløsning med 2 - til 5-fold. Vi anbefaler en udgangskoncentration på 0,2 mg / ml. Koncentrationer så høje som 5 mg / ml er blevet rapporteret for DNA tatovering forsøg 3.
- Undgå alvorlige skader på huden, som musehud på tatovering websted let skæres af barbermaskiner og nåle.
- Sørg for, at DNA-konstruktionen er passende for dit eksperiment.
- Udføre gelelektroforese for at sikre, at størstedelen af plasmid-DNA i supersnoet eller lukket cirkulær form.
2. Svær blødning eller beskadigelse af huden forekommer ved tatovering site.
- Formindsk nålen dybde.
- Oprethold en 90-graders vinkel mellem nålen array og huden.
- Mindsker kraft anvendt itatovering behandling.
- Reducer hastigheden af tatovering bevægelse.
3. Baggrundssignalet er for højt, når billeddannende EGFP.
- Brug en helt ny engangs sikkerhedsbarberapparatsystemet at fjerne så meget hår som muligt før tatovering. Undertiden er det nødvendigt at barbere igen før dissektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA vaccination anses sikrere end de traditionelle vaccinationsstrategier da det ikke kræver manipulation af eller udsætte vaccinerne til, levende eller svækkede patogener 4. Men resultatet af DNA vaccination afhænger i høj grad om levering rute. Hud er rigelige i antigenpræsenterende celler, såsom Langerhanske celler og dendritiske celler 1, og således et ideelt sted til immunisering med hensyn til immunogenicitet og lette adgang 5,6. Som følge heraf er intradermal vaccinationsstrategi en af de mest populære valg for DNA-vacciner. Som vist i denne video, DNA tatoveringer er en enkel, men lovende måde at administrere en DNA-vaccine intradermalt. Interessant nok kunne den inflammatoriske responser forårsaget af tatovering fremgangsmåde også tjene som en fysisk og potent adjuvans 1,2. Det er blevet rapporteret, at DNA tatovering kan fremkalde op til en 100 gange stigning i T-celle-reaktioner i aber, sammenlignet med T-celle-responser i dyr immunized intramuskulært 7,8. Sammenlignet med andre dermale leveringsmetoder, såsom genkanonen, besidder DNA tatovering adskillige fordele. Det første er DNA tatovering ikke kræver dyrt udstyr og bærere, dvs guldpartikler. Dette ville være en kæmpe fordel i form af vaccine distribution, især for udviklingslandene. For det andet er det kendt, at højt lufttryk kan forårsage pDNA skader som følge af forskydningskraft, hvilket kunne nedsætte antigen ekspressionsniveauet. En undersøgelse har vist, at DNA-tatovering skader mindre end 3% af den samlede pDNA 9. Endelig kan DNA tatovering dække et stort område af huden, som vil kunne fremkalde en stærkere immunrespons. Tatoveringen indretninger kan også anvendes til at afgive peptid / protein vacciner, og har vist sig at inducere både humorale og cellemedierede immunresponser 10. Vi bruger nu hud tatovering rutinemæssigt i vores dyreforsøg i et DNA prime-protein boost vaccinationsprotokol (tre DNA-primtal fulgteaf to protein øger over en periode på 16 uger), og vi har med succes induceret i mus kraftige immunresponser mod HIV-1 gp120.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke alle medlemmer af Kong Lab og Dr. Yan Deng på Mikroskopi Core, Office of Collaborative Science, NYUMC for deres bistand og teknisk support. Dette arbejde blev støttet af en pilot tilskud fra New York University Center for AIDS Research (CFAR, NIH tilskud AI027742).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCX-EGFP plasmid DNA | Clontech | ||
| STEALTH Rotary Tattoo System | Worldwide Tattoo Supply | STEALTH-L | |
| Tattoo needles | Worldwide Tattoo Supply | 1207RSB | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| 0.22 μm PVDF sterile filter | Millipore | SLGV013SL | |
| electrical hair trimmer | Commercially available | ||
| disposable safety razors | Commercially available | ||
| Silver Sulfadiazine Cream | Watson | NDC 0591-0810-55 | |
| Ketamine HCL | NDC 0856-2012-01 | ||
| Zylazine Sterile Solution | NADA 139-236 |
References
- Bins, A. D. A rapid and potent DNA vaccination strategy defined by in vivo monitoring of antigen expression. Nat Med. 11, 899-904 (2005).
- Pokorna, D., Rubio, I., Muller, M. DNA-vaccination via tattooing induces stronger humoral and cellular immune responses than intramuscular delivery supported by molecular adjuvants. Genet. Vaccines Ther. 6, 4 (2008).
- van den Berg, J. H. Optimization of intradermal vaccination by DNA tattooing in human skin. Hum. Gene Ther. 20, 181-189 (2009).
- Liu, M. A.
- Koide, Y., Nagata, T., Yoshida, A., Uchijima, M.
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Verstrepen, B. E. Improved HIV-1 specific T-cell responses by short-interval DNA tattooing as compared to intramuscular immunization in non-human primates. Vaccine. 26, 3346-3351 (2008).
- Potthoff, A. Immunogenicity and efficacy of intradermal tattoo immunization with adenoviral vector vaccines. Vaccine. 27, 2768-2774 (2009).
- Quaak, S. G. DNA tattoo vaccination: effect on plasmid purity and transfection efficiency of different topoisoforms. J. Control Release. 139, 153-159 (2009).
- Pokorna, D. Vaccination with human papillomavirus type 16-derived peptides using a tattoo device. Vaccine. 27, 3519-3529 (2009).
