Summary
Tatuagem pele é um modo poderoso e seguro para a entrega de vacinas de ADN por via intradérmica. Aqui, um DNA que codifica EGFP plasmídeo é entregue por tatuagem na pele de um rato de laboratório, e a expressão de GFP em células da pele é então inspeccionado por microscopia confocal.
Abstract
Vacinação à base de ácido nucléico é um tema de interesse crescente, especialmente DNA plasmídeo (pDNA) codificando antígenos imunologicamente importantes. Após o pDNA engenharia é administrado às vacinas, é transcrita e traduzida em proteínas de imunogénio, que pode eliciar respostas do sistema imunológico. Muitas formas de entrega de vacinas de DNA têm sido investigados, mas cada rota de entrega tem suas próprias vantagens e armadilhas. Tatuagem da pele é uma nova técnica que é seguro, eficaz e conveniente. Além disso, as perfurações provocadas pela agulha pode também servir como um adjuvante potente. Aqui, a) demonstrar a entrega intradérmica de codificação de ADN do plasmídeo melhorada da proteína verde fluorescente (EGFP-PCX) num modelo de ratinho utilizando um dispositivo de tatuagem e b) confirmar a expressão eficaz de GFP em células da pele, utilizando microscopia confocal.
Protocol
1. A purificação do ADN plasmídico
- Transformar o plasmídeo de DNA eucariótico que codifica EGFP (PCX-EGFP) em células de E. coli DH5a competentes. O vector PCX vazio pode também ser usado como um controlo negativo.
- Cultura e colheita das células de E. coli DH5a e purifica-se o pDNA de acordo com o Qiagen EndoFree Plasmid Purification Handbook.
- Filtrar através de uma solução de pDNA PVDF de 0,22 um filtro esterilizado, e armazená-lo a -20 ° C até à sua utilização.
2. Preparação do Sistema tatuagem
- Ligar a unidade portátil e o pedal de controlo para a unidade de fonte de alimentação com as instruções do fabricante.
- Definir a freqüência de oscilação da agulha para cerca de 100 Hz. Para o dispositivo de tatuagem que escolhemos (Stealth Sistema Tattoo Rotary), a marcação sobre o fornecimento de energia deve ser definido para 4 volts. Consulte o manual do usuário ou suporte técnico para sistemas de tatuagem outros.
- Esterilizar o ar agulharay antes do uso. Recomendamos o uso de uma matriz de agulhas por animal. As agulhas podem ser reutilizadas após a limpeza com água e sabão e autoclavados.
- Instale o conjunto agulha na unidade portátil e vagamente anexar a pega de plástico.
- Ajustar a profundidade da agulha para uma definição adequada, movendo a pega de plástico para cima ou para baixo. Nós usamos uma profundidade agulha de aproximadamente 0,5 mm para o nosso experimento mouse.
- Apertar a pega de plástico, quando a profundidade da agulha está correctamente ajustado, e o sistema de tatuagem está pronto para uso.
3. Raspar animais
- Escolher o local para o tratamento de tatuagem. O local deve ser uma área relativamente firme e plana, e carnuda da pele, por exemplo, o lado da perna traseira do animal.
- Anestesiar um ratinho BALB / c com uma mistura de cetamina (90 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) de acordo com o peso corporal do animal. Para outros animais, consulte as diretrizes de anestesia da sua instituição.
- Verifique oreflexos animal por beliscar o seu pé para confirmar que o animal é anestesiado adequadamente.
- Use o cortador elétrico para aparar o cabelo em posteriores do animal devagar e com cuidado. Remova o cabelo a partir do site tatuagem planejada e área circundante.
- Remover o cabelo mais curto residual com o aparelho de barbear descartável. Tenha cuidado para não cortar a pele do animal. Note-se que o creme depilatório pode ser utilizada como um método de remoção de pêlos alternativa, no entanto, preferimos barbear sobre o creme depilatório.
- Remover pêlos cortados dispersos a partir da pele com ar comprimido, se necessário.
4. Entrega de ADN plasmídico por Tattooing
- Se um protocolo de imunização foi estabelecido anteriormente, a dose e volume de solução de DNA a ser aplicado deve ser calculada em conformidade. Recomendamos utilizando um volume tão pequeno quanto prático para tornar o processo mais controlável tatuagem. Nesta demonstração EGFP, utilizou-se 7,5 uL de solução de ADN a uma concentração de 0,25 mg / ml, o qual foi aplicado sobre uma área de cerca de 1 a tatuagem cm 2. Para as experiências de imunização, as concentrações mais elevadas pDNA pode ser necessária para induzir respostas imunes fortes a 1,2.
- Aplicar a solução de DNA através de pipetagem directamente sobre o local de tatuagem. Em alternativa, carregue a solução de ADN para a pega de plástico por pipetagem, de modo que o líquido é suspensa entre a agulha e a ponta de aperto de plástico. Consulte o vídeo para uma demonstração. Temos observado nenhuma diferença notável entre os dois métodos. No entanto, carregar a solução para o aperto de plástico pode ser vantajoso em superfícies verticais da pele, por exemplo.
- Iniciar a oscilação da agulha e colocar a matriz de agulha com uma leve pressão sobre a pele do animal no local de tatuagem. Em seguida, passar a agulha de oscilação suave e lentamente de uma forma linear para entregar o ADN do plasmídeo durante a área inteira tatuagem. Manter um ângulo de 90 graus entre a agulha e a pele para evitarlacerações da pele.
- Observe a pele. Abrasão e inflamação são normais. Se o sangramento acontece, pare o processo de tatuagem e diminuir a profundidade da agulha.
- Continue o movimento agulha por cerca de 1 minuto, e depois parar o processo de tatuagem.
- Usar um cotonete de algodão limpo para aplicar uma fina camada de analgésico tópico no local de tatuagem. Analgésicos tópicos, como a sulfadiazina de prata (SSD creme) ou pomada Neosporin pode ajudar a aliviar a dor ou o sofrimento dos animais, e, portanto, recomenda-se aplicá-los antes da anestesia desgasta fora. Observar os animais no dia seguinte para sinais de dor ou sofrimento (mudança de inatividade marcha). Reaplicar o creme analgésico se os sinais persistirem.
5. A confirmação da expressão do antigénio
- 48 horas após o tratamento tatuagem (note que as construções diferentes pDNA pode exigir tempos de expressão diferentes), o mouse é sacrificados por CO 2 narcose. Por outroanimais, consulte as diretrizes de eutanásia de sua instituição.
- Dissecar a pele no local da tatuagem, e fixar o tecido em paraformaldeído a 4% a 4 ° C durante a noite.
- Enxaguar o tecido com 70% de etanol, e transferi-lo em 1X PBS para imagiologia.
- Examine todo o tecido usando um microscópio confocal para procurar sinais EGFP. Alternativamente, o tecido da pele pode ser embebido em cera de parafina e examinado em secções com um microscópio fluorescente.
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Representative Results
A expressão de EGFP, com um pico de excitação a 488 nm e pico de emissão a 509 nm pode ser observado nas células da pele do rato. A partir de uma dose de 1,875 ug de DNA, contendo cerca de 3 x 10 17 cópias do plasmídeo, que tipicamente observada 10-20 sinais EGFP em de 1 cm 2 área tatuada. Este número relativamente baixo de células transfectadas é consistente com os resultados de um estudo anterior 3. A expressão de EGFP (Figura 1) proporciona a evidência de que o plasmídeo EGFP foi entregue nas células da pele do animal utilizando a técnica de DNA tatuagem.
Figura 1. Expressão EGFP nas células da pele 48 horas após o tratamento de tatuagem na perna traseira de um ratinho BALB / c visto com um microscópio confocal. A) Uma projecção de sinais de EGFP de múltiplos planos focais. B) a expressão de uma EGFP singcélula le.
Solução de problemas
1. Nenhuma expressão de antigénio é detectada (por exemplo, não EGFP sinais de controlo positivo).
- Aumentar a concentração de uma solução de DNA do plasmídeo de 2 - a 5-vezes. Recomenda-se uma concentração inicial de 0,2 mg / ml. Concentrações tão elevadas como 5 mg / ml foram relatados por DNA tatuagem experiências 3.
- Evitar danos graves para a pele, como a pele do rato no local de tatuagem é facilmente cortado pelo navalhas e agulhas.
- Certifique-se a construção de ADN é apropriado para a sua experiência.
- Realizar a electroforese em gel para se certificar de que a maioria do ADN de plasmídeo super-enrolado é em forma circular ou fechada.
2. Hemorragia grave ou danos na pele ocorre no local de tatuagem.
- Diminuir a profundidade da agulha.
- Manter um ângulo de 90 graus entre o conjunto da agulha e da pele.
- Diminuir a força aplicada durante atatuagem tratamento.
- Diminuir a velocidade do movimento de tatuagem.
3. O sinal de fundo é demasiado alto quando imaging EGFP.
- Use um novo aparelho de barbear descartável para remover cabelo, tanto quanto possível antes de tatuar. Às vezes é necessário fazer a barba de novo antes da dissecação.
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Discussion
Vacinação de DNA é considerada mais segura do que as estratégias de vacinação tradicional, uma vez que não requer manipulação de, ou expor as vacinas, agentes patogénicos vivos ou atenuados 4. No entanto, o resultado da vacinação de DNA depende fortemente da via de administração. A pele é abundante em células apresentadoras de antigénio, tais como células de Langerhans e células dendríticas 1, e, portanto, um local ideal para a imunização em termos de imunogenicidade e facilidade de acesso 5,6. Como resultado, a estratégia de vacinação intradérmica é uma das opções mais populares para vacinas de DNA. Como mostrado neste vídeo, DNA tatuagem é uma maneira simples e promissora para administrar uma vacina de DNA por via intradérmica. Curiosamente, as respostas inflamatórias causadas pelo processo de tatuagem poderia também servir como um adjuvante natural, 1,2 e potente. Tem sido relatado que a tatuagem DNA pode provocar um aumento de até 100 vezes em respostas das células T em macacos, quando comparada com respostas de células T em animais immunized por via intramuscular 7,8. Em comparação com outros métodos de entrega dérmica, tais como a pistola de genes, a tatuagem DNA contém várias vantagens. Primeiro, a tatuagem DNA não requer equipamento caro e portadores, ou seja, partículas de ouro. Isso seria uma grande vantagem em termos de distribuição da vacina, especialmente para os países em desenvolvimento. Em segundo lugar, sabe-se que a pressão de ar elevada pode causar danos pDNA devido à força de cisalhamento, o que pode diminuir o nível de expressão do antigénio. Um estudo mostrou que os danos do ADN tatuagem menos de 3% do total de pDNA 9. Finalmente, a tatuagem DNA pode cobrir uma grande área de pele, o que pode, potencialmente, provocar uma forte resposta imunitária. Dispositivos de tatuagem também pode ser usado para entregar péptido / proteína vacinas, e tem sido provado para induzir tanto humorais como mediadas por células respostas imunes 10. Vamos agora usar a pele tatuagem rotineiramente em nossos experimentos com animais em uma proteína DNA prime-boost de vacinação de protocolo (três primos de DNA seguidopor duas proteínas aumenta ao longo de um período de 16 semanas), e com sucesso em ratos induzida fortes respostas imunes contra o HIV-1 gp120.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a todos os membros do Laboratório Kong e Yan Dr. Deng no Gabinete de Microscopia Core, da Ciência Colaborativa, NYUMC por sua assistência e suporte técnico. Este trabalho foi financiado por uma doação de piloto da New York University Center for AIDS Research (CFAR, NIH concessão AI027742).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCX-EGFP plasmid DNA | Clontech | ||
| STEALTH Rotary Tattoo System | Worldwide Tattoo Supply | STEALTH-L | |
| Tattoo needles | Worldwide Tattoo Supply | 1207RSB | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| 0.22 μm PVDF sterile filter | Millipore | SLGV013SL | |
| electrical hair trimmer | Commercially available | ||
| disposable safety razors | Commercially available | ||
| Silver Sulfadiazine Cream | Watson | NDC 0591-0810-55 | |
| Ketamine HCL | NDC 0856-2012-01 | ||
| Zylazine Sterile Solution | NADA 139-236 |
References
- Bins, A. D. A rapid and potent DNA vaccination strategy defined by in vivo monitoring of antigen expression. Nat Med. 11, 899-904 (2005).
- Pokorna, D., Rubio, I., Muller, M. DNA-vaccination via tattooing induces stronger humoral and cellular immune responses than intramuscular delivery supported by molecular adjuvants. Genet. Vaccines Ther. 6, 4 (2008).
- van den Berg, J. H. Optimization of intradermal vaccination by DNA tattooing in human skin. Hum. Gene Ther. 20, 181-189 (2009).
- Liu, M. A.
- Koide, Y., Nagata, T., Yoshida, A., Uchijima, M.
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Verstrepen, B. E. Improved HIV-1 specific T-cell responses by short-interval DNA tattooing as compared to intramuscular immunization in non-human primates. Vaccine. 26, 3346-3351 (2008).
- Potthoff, A. Immunogenicity and efficacy of intradermal tattoo immunization with adenoviral vector vaccines. Vaccine. 27, 2768-2774 (2009).
- Quaak, S. G. DNA tattoo vaccination: effect on plasmid purity and transfection efficiency of different topoisoforms. J. Control Release. 139, 153-159 (2009).
- Pokorna, D. Vaccination with human papillomavirus type 16-derived peptides using a tattoo device. Vaccine. 27, 3519-3529 (2009).
