Abstract
心血管疾患は世界的に1死亡の主要な原因である。心臓組織工学は、心臓再生だけでなく、in vitroスクリーニングアッセイのための機能的な組織を開発する目的で画期的な医療発見を実現するために多くの可能性を秘めています。しかしながら、心臓組織の高忠実度のモデルを作成することが困難であることが証明されている。心臓の細胞外マトリックス（ECM）は、マイクロナノメートルスケールの2に至るまでの生化学的および生体力学的信号の両方からなる複合構造体である。ローカル機械的負荷条件及び細胞-ECM相互作用は、最近、心臓組織工学3-5の重要なコンポーネントとして認識されている。
心臓ECMの大部分は有意に組織構造および電気機械結合に影響を与える2ナノスケールの直径を有する整列されたコラーゲン繊維から構成されている。残念ながら、いくつかのメソッドは、HAVEナノメートルスケールまでECM繊維の組織を模倣することができた。ナノファブリケーション技術の最近の進歩は、しかし、心の6-9でのECMのin vivoでの構造と基板の剛性の手がかりを模倣する、スケーラブルな足場の設計および製造を可能にした。
ここでは、の開発に存在する二つの再現可能な、費用対効果、および生体適合性ポリマーであるポリ（ラクチド-コ-グリコリド）（PLGA）8およびポリウレタン（PU）系ポリマーを用いて心臓細胞の機能的な位置合わせのためのスケーラブルなナノパターニングプロセス。これらの異方nanofabricated基層（ANFS）はよく組織化、整列の組織の根本的なECMを模倣し、細胞の形態と機能10から14にナノトポの役割を調査するために使用できます。
鋳型としてナノパターン（NP）シリコンマスターを使用して、ポリウレタンアクリレート（PUA）モールドが作製される。このPUAモールドは、その後、PAに使用されているそれぞれ、UV支援または溶媒媒介毛細管力リソグラフィー（CFL）、15,16を経由して、PUまたはPLGAヒドロゲルをttern。簡潔には、PUまたはPLGAプレポリマーは、ドロップガラスカバースリップ上に分注し、PUAモールドを上に置くである。 UVアシストCFLの場合、PUは、次いで硬化させるためのUV照射（λ= 250〜400 nm）に露光される。溶媒媒介性CFLについては、PLGAを、熱（120℃）および圧力（100kPaで）を用いてエンボス加工される。硬化後、PUAモールドを細胞培養のためのANFS残して、剥離される。例えば、新生仔ラット心室筋細胞、ならびにヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞のような初代細胞は、ANFS 2上に維持することができる。
Introduction
心血管疾患は、世界における罹患率および死亡率の主要な原因であり、すでに緊張した世界的な保健システム1,17上の重い社会経済的な負担を提示する。 （1）in vitroでの薬物スクリーニングまたは疾患のモデリングのための心臓の高忠実度モデルを作成する虚血性疾患又は心筋症又は（2）の後に損傷した心筋を再生する：心臓組織工学は、2つの異なる目標を有している。
心臓は体に血液を供給するために常に働かなければならない複雑な器官である。心筋細胞および支持組織の密集した層構造は、心臓壁18,19を通して螺旋パターンで配置されている。心臓はまた、電気機械的に効率的に本体21に血液を排出する高度に配位様式20に結合される。自然の複雑なデザインを確実vitroでで要約することができる前に、いくつかの主要なハードルは、しかし、対処されていない。ロバストな心筋細胞分化方法22開発され続けているが、まず、HPSC-CMはまだかなり未成熟表現型を示す。彼らの電気機械特性および形態は、最も密接に胎児のレベルを23に一致する。従来の培養条件で維持さときに、第2、幹細胞由来の心筋細胞および一次両方は、天然、組織様構造に組み立てることができない。むしろ、細胞がランダムに配向となり、大人の心筋24のバンド棒状の外観を示さない。
細胞が相互作用する細胞外マトリックス（ECM）環境では、多数の細胞プロセス11,13,25において重要な役割を果たしている。 ECMは、細胞を有意に6,26の構造及び機能に影響を与える複雑な、明確に定義された分子及び地形手がかりからなる。心の中では、携帯の位置合わせは、密接に、基礎となるナノメートルスケールのECM繊維2に従います。これらnanotopographの影響細胞および組織の機能上のiCalの手がかりは、しかし、完全には理解遠くからである。ナノメートルスケール細胞生体材料の相互作用の予備的研究は、成長31、接着28〜30、27細胞シグナル伝達のためにサブミクロン地形手がかりの潜在的な重要性と影響力を示し、分化32,33。しかし、再現性のあるスケーラブルなnanofabricated基板を開発することが困難であるため、このような研究は、 生体内のECM環境での複合体のマルチスケール細胞効果を再現することができませんでした。このプロトコルでは、天然の心臓ECM繊維の配向を模倣する細胞培養足場を製造する簡単で費用効果の高いナノファブリケーション技術は、心筋細胞、生体材料の相互作用の新規な調査の広い範囲を可能にする、記載されている。心筋細胞は、ナノスケールのECM環境とどのように相互作用するか理解することは、より密接に模倣天然組織の機能に細胞挙動を制御する能力のために可能性がありますTiONから。さらに、細胞単層は、3D構造に比べて簡略化された実験系であるが、それでも洞察に満ちた調査と機能的スクリーニング2,34-36ための複雑な多細胞挙動を示す。最後に、このような足場は、再生目的のために心臓37内に埋め込 まれた際の細胞移植片の機能を改善するために使用することができる。
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Protocol
特に断りのない限り、全ての手順を室温（〜23℃）で行われる。
シリコンマスターの1。作製
- O 2 / N 2ガ ス下で100％エタノール、キシレン、ドライクリーンなシリコンウェーハ。
- 0.3〜0.5ミクロン厚のフィルムを製造するために2000〜4000回転の回転速度でスピンコーターでシリコンウエハを置く。
- フォトリソグラフィシステムを使用して、正しい寸法を有するパターンをフォトレジスト膜
- 完全にフォトレジスト現像液の適切な量のパターン化されたフォトレジストでコーティングされたシリコンウエハを浸す。
- 脱イオン水で現像されたフォトレジストでコーティングされたシリコンウエハーを洗浄します。
- ほぼ垂直な側壁を有するサブミクロンスケールのリッジのアレイを形成するために、ディープ反応性イオンエッチング装置を用いて露出したシリコンをエッチングする。
- プラズマアッシャーシステムにおいてシリコンウェハを配置することによって、残りのフォトレジストを除去する。
- Wシリコンをカットその後のレプリカ成形に適したサイズのシリコンマスターズへのダイヤモンドが先端に付いたカッターでafers。
シリコン·マスターからのPUA型の2。作製
注：ナノファブリケーションのためのシリコンマスターに追加されるボリュームは、ポリウレタンアクリレート（PUA）溶液の粘度ならびに複製されるナノパターンマスタの面積に応じて変化する。
- 100％エタノール又はO 2 / N 2ガ ス下、キシレン、ドライクリーンなシリコンマスタ面。
- シャーレにシリコンマスターパターン側を上に置きます。
- 2センチメートル×2センチメートル表面パターン、パターン面への不要と思われるアプリケーションのピペット40μlのシリコンマスターのため。
- 4センチメートル注し、PUA上のX 4センチメートル透明なポリエステル（PET）フィルムのシートを配置します。
- ダウンPETシートを押して、そのように（カードなど）ローラーまたはフラットエッジの表面を用いたパターン面を横切るシートの下に不要と思われるアプリケーションを広める全体パターンは、PUAプレポリマーで覆われている。
- 50秒間約10cm 20ワット（115 V）のUV光（λ= 365 nm）を下回るシリコンマスター、プレポリマー、およびPETを配置します。効果的にするために、UV光の波長は310〜400nmの間の任意の場所とすることができる。光の強度は、基板表面の10〜15ミリワット/ cm 2である。
- 硬化後、ピンセットでゆっくりとPETフィルムを除去します。 PUAは、シリコンマスターナノパターンの負のPETフィルムに添付してください。
- 使用前に少なくとも12時間のUVで硬化PUA / PETナノパターン。露出オーバーは問題ではありません。
- シリコンマスターをクリーニングするには、不要と思われるアプリケーションを追加することなく、マスターの上にPETの別のフィルムを配置し、50秒間UV光（λ= 365 nm）に公開し、PETフィルムを除去します。これは、任意の未反応モノマーを除去します。
- O 2 / N 2ガ ス下で100％エタノール、キシレン、乾燥してシリコンマスターを洗浄します。
図3（a）。ナノパターニングポリウレタンポリマー
図3（b）。ナノパターニングポリ（ラクチド - コ - グリコリド）ヒドロゲル
- 激しく10:1の比でシリコーンエラストマーベース及びシリコーンエラストマー硬化剤を混合することにより、平坦なPDMSモールドを作成する。
- PDMS前駆体は皿（ すなわち、PDMSを厚さ5mmになるように）の縁5mmまで到達するようにペトリ皿に混合PDMS前駆体溶液を注ぐ。
- 脱ガスに1時間デシケーター中でペトリ皿とPDMS前駆体を配置します。
- 治すために、少なくとも2時間、65℃のオーブンにペトリ皿とPDMS前駆体を移動します。
- PDMSを硬化させた後は3センチ×3センチメートルの正方形の部分に平らなPDMSをカットするかみそりを使用しています。これらは、パターニングプロセスの後半で使用されるフラットなPDMSモールドとなります。
- PLによるクリーンな直径25mmの円形のガラススライド水中超音波処理装置での30分間イソプロピルアルコールでacing。
- O 2 / N 2ガ ス下で乾燥した清浄なガラススライド。
- 液滴をガラススライド上にPLGA溶液100μl（クロロホルム中/ vのPLGA 15重量％）を分注する。
- 溶剤を吸収し、平らなPLGA表面を得るに分注し、PLGAの上に平らなPDMSモールドを配置します。 5分間PDMSの上に200グラムの重量を配置することによって、光の圧力（〜10キロパスカル）を適用します。
- ゆっくりと平坦なPDMSモールドを剥離し、残留溶媒を除去し、PLGAとカバーガラスとの密着性を高めるために5分間予熱したプレート（120°C）でカバーガラスを配置する。
- フラットPLGAの上のNP PUAモールドを配置し、15分間の加熱プレート上にある間、PUAモールドの上に1kgの重りを配置することによって、一定の圧力（〜100キロパスカル）と熱（120℃）を適用する。
- PLGAカバースライドから重量を除去し、基質を室温まで冷却する。基層がされるまで、PUAモールドを削除しないでください冷却した。
- 基質が十分に冷却した後、慎重にNPのPLGA基層を明らかにし、NP PUAモールドをはがす。 NPのPLGA基層は、虹色の外観を持っている必要があります。
- 限りの月のようにストレージのためにデシケーターに仕上がったサンプルを置きます。
4。細胞播種および培養
注：このプロトコルは、新生児ラット心室筋細胞（NRVMs）およびH7ヒト胚性幹細胞由来の心筋細胞（hESCの-CMS）が、他の細胞源の文化を説明して使用することができる。
- 35mmの組織培養ポリスチレン皿にANFSカバースリップ（PUまたはPLGA）を取り付けます。ピペットノーランド光学接着剤（NOA83H）20μlの皿の底に、ゆっくりとNOAの上にANFSカバースリップを配置。接着剤が広がって全体のカバーガラス底をカバーすることができます。 10分間UVに料理を暴露することによりNOAを治す。
- 二回、5分間、70％エタノール水溶液2mlですすぐことによりANFSを滅菌する。 Eを削除吸引によりthanol。 ANFSは生物学的安全キャビネット内のUV殺菌ランプ（λ= 200から290ナノメートル）の下で〜1時間、完全に空気乾燥させます。
- 細胞接着を一晩フィブロネクチンでANFSを被覆することによって強化される。 5μg/ mlのDI水にフィブロネクチンを希釈する。皿にフィブロネクチン溶液をピペット2ミリリットル。 37℃のインキュベーター中に置き、5％CO 2で一晩（少なくとも6時間）。
- 以前プロトコル22に従ってNRVMs、ヒトES細胞-CMS、または関心のある他の心臓細胞を得る。
- 細胞をペレットに3分間1,000 rpmで遠心分離細胞サンプル。
- 慎重に吸引して上清を除去。ペレットを乱さないように注意してください。
- 4.6×10 6細胞/ mlの濃度になるように適切な培養培地中で細胞を再懸濁。
- 慎重に滅菌ANFS上に細胞懸濁液200μlをピペットで。細胞懸濁液は、カバーガラス上に残っていることを確認してください。
- 37℃、5％のインキュベーター中で細胞を置き細胞はANFSにアタッチできるようにする4時間のCO 2。
- 同じ条件で培養器で細胞を皿に代わる暖かい培養培地の2ミリリットルを追加します。
- 24時間後、培地を除去し、余分な細胞を除去するために二度のDPBS 2ミリリットルで洗浄する。
- 同じ条件で培養器で細胞を皿に代わる暖かい培養培地の2ミリリットルを追加します。文化細胞が密集するまで。一日おきにメディアを交換してください。
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Representative Results
図1は、2つの製造方法の製造工程の概略図である。によりナノスケールの地形に起因する光の回折に、ナノパターニングはANFSに虹色の表面をもたらすはずである。 図2は、800 nmの稜線と溝とよくパターン化された25ミリメートルのNP-PUカバースリップ（図2A）に、この虹色の表面を示している幅（図2B）。 ANFSの虹色の外観は、畝と溝の幅によって多少異なります。
ANFS上に細胞を播種した後、細胞を基板の稜線と平行な方向に整列させるために開始されます。位置合わせは、播種後の最初の24時間以内に明らかになるべきであり、培養期間の全体のために維持する必要があります。 図3は、培養48時間後の培養とのhESC-CMの7日後にNRVMsの代表明視野像を示す。 NRVMs A番目のhESC-CMのNP表面上にパターン化されていない表面上での心筋細胞がランダムに配向しているのに対して（ 図3Aおよび3C）自明構造異方性とアライメント（ 図3Bおよび3D）を示す。免疫組織化学的分析は、細胞の細胞骨格の整列にナノトポの影響を強調しています。アクチンミクロフィラメント（F-アクチン）とナノ尾根に沿って整列しますが、ランダムにパターン化されていない基質上の細胞（ 図4）で配布されたままになってANFS上で培養した細胞中のα-アクチニン筋節。心臓細胞は、培養の24〜48時間後に自発的な打撃を呈する。
図1。 ナノファブリケーション回路図 - 2ナノ加工PROCのダイアグラムesses。 （B - D）を示すUVアシスト毛細管力リソグラフィー（CFL）しながら（E - H）溶媒媒介CFLを示す。 （A）は、PUAの負シリコンマスターから作られる。 （B）PUプレポリマーは、ドロップ注さガラススライド上にあり、PUAモールドは上部に配置されている。 （C）A PUAモールドとPUカバースリップを、次いで、PUを硬化させるUV光に露光される。 （E）PLGAポリマー溶液は、ドロップ注さスライドガラス上にあり、平坦なPDMSモールドをPLGA平坦な表面を作成するために使用される。 （F）PUAモールドは平坦PLGAの上に配置され、（G）一定の熱および圧力がPLGAにホット·エンボス加工NPに適用される。 （D、H）PUAモールドを剥離する後、NP-PUまたはPLGA基板が置き去りにされている。心臓細胞を細胞の整列配列を作成するには、このNP表面に播種することができる。
図2 NP-PU基板（A）大面積NP表面の写真。カバースリップの虹色の外観は、ナノトポグラフィーが原因で発生します。 （B）下にあるナノトポグラフィの断面のSEM像。
図3培養物（C、D）の2日後の心筋細胞培養の7日後NRVMs 10Xの明視野像（A、B）としたhESC-CMをアライン 。フラットPU基板（A）の上NRVMsがランダムに並んでいる、一方のNP-PU基板（B）の上で培養NRVMsは明白構造アラインメントを示す。 （B）および（D）中の矢印は、NP異方性の方向を示す。 = 100ミクロンスケールバー。
図4免疫蛍光共焦点イメージング細胞の細胞骨格のアライメントおよび条線。;筋節α-アクチニン（赤）、細胞核（青色）、およびF-アクチン（緑色）。平らな基質上で培養された細胞がランダムに繊維を指向たが、NP基板上に培養した細胞は、α-アクチニン筋節とF-アクチン繊維を揃えています。赤、α-アクチニン筋節チャネル上の挿入図は、はっきりと横紋筋節を示しています。
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Discussion
機能的に成熟した心臓組織は、 生体内および心臓組織工学のインビトロ適用の両方のために欠けている。ここで説明するのCFLナノ加工法は、細胞の位置合わせを実現し、システムの拡張性に起因する巨視的組織機能に影響を与えるための堅牢な技術である。大きな面積を容易にパターニングし、細胞培養のために使用することができる。巨視的セルラアラインメントは生体模倣、それは心筋38の機械的および電気的特性の両方に影響を与えるような機能的な組織を生成するために、心臓組織工学において必須である。
ここでの方法は、心臓組織工学内の広範囲の用途に適用することができる。これは、先に、ナノスケールの手がかりは、心臓幹細胞ニッチを作成し、再生14を促進するために役立つことが実証されている。従って、例えばPLGAなどの生分解性ポリマーを用いて、ナノパターン「パッチ」は、促進するために作ることができる心臓発作の後に治癒。あるいは、天然の心臓と同様の弾性率とのヒドロゲルを用いて、心筋細胞ECM相互作用は、単純化された、再現可能なシステムにおいて研究することができる。
例えば、マイクロコンタクトプリンティング、エレクトロスピニング、および微地形などの様々な他の方法は、予めマイクロスケール39-41に操作された心臓組織の構造を制御するために使用されてきた。これらの技術は細胞の配向を得ることに成功することが証明されたが、それはin vivoで心臓組織の構造および機能は、ECMのはるかに小さい、nanotopographical合図によって支配され、したがって、我々のNP基板は有利証明するべきであると考えられる。さらに、これらのマイクロパターニング技術は、我々の異方nanofabricated基板に比べて固有の欠点を持っている。例えば、我々のナノパターニング方法は、より費用対効果のエレクトロスピニングより制御可能である。マイクロコンタクトプリンティングは、一方では、相対構造異方性を得るために、特定のレーンに付着した細胞にIES。機能性単分子膜を作成するために、次に細胞を増殖しなければならない一方またはタイトジャンクションを形成するために、これらのレーンから移動。これは、新生児心筋細胞などの無増殖能をほとんど持つ細胞のためにはるかに困難である。微地形も密結合細胞単層を作成することができないことによって制限されます。原因微地形と比較した細胞のスケールに、細胞はマイクロリッジのか、内側上に常駐します。これは、細胞 - 細胞相互作用の量を制限し、細胞 - 細胞結合を減少させる。私たちの方法では、細胞がバイオインスパイアードナノスケールの地形を経由して位置合わせになり、形状サイズは、少なくとも細胞自体よりも小さい大きさのオーダーであるとして自由に隣接する細胞と相互作用することができる。これは、密結合、細胞単層を作成する、より多くのバイオミメティックが可能になります。
NP-PUで最適な結果を得るには、我々は強くグラム以下の示唆小娘カバースリップの前処理段階。これらのステップは、ガラス表面へのポリマーの接着性を増加させる。これだけではないでしょう製造中の不要と思われるアプリケーションのマスターのクリーン除去を助けるだけでなく、実験中にガラスから外れるパターン化されたポリマーを防ぐ。前処理工程の効果を試験するために、水中の1 NP-PU基板を配置し、ポリマーがガラスに付着したままであるかどうかを観察。
PLGAは、 生体内装置および薬物送達の両方のために開発されたグリコール酸と乳酸との共重合体である。このように、この基質は、細胞のための良い、生体適合性のECMを提供します。 PLGAの剛性が乳酸にグリコール酸の比率を調整することのいずれかにより、またはクロロホルム中のPLGA収縮を変えることによって調節することができる。
種々のパラメータを容易に最適化または治験の目的のためにこのシステムに変化し、調整することができる。様々なPU系ポリマーの広い範囲で使用可能です機械的性質。したがって、異なるPUプレポリマーを用いることにより、種々の基材の剛性は、同じプロトコルによって作製することができる。ユーザはまた、基板トポグラフィーを変化させることができる。基板のナノトポは、シリコンマスターの設計に依存している。従って、リッジと溝の幅、並びに様々な幾何学的形状の様々な仕様を満たすためにシリコンマスターの設計を変更することによってパターン化することができる。
ナノ隆起部の大きさはまた、細胞および組織の行動に影響を与えるであろう。小さ い溝幅は、溝に少ない細胞浸透を可能にし、エンジニアリング·ナノトポ2と細胞との相互作用を制限する。これは次に、心臓の細胞単層の異方性挙動の程度を変える。さらに、提示されたプロトコルは、2次元（2D）細胞培養および配置に限定される。明らかに、真にバイオミメティックであるためには、エンジニアリング心臓組織は、3Dである必要がある。今後の作業はdesigninのために必要とされているGは、緻密で整列心臓組織をfunctional3D。ここで紹介するプロトコルは、しかし、心臓の細胞形態の優れた制御を提供し、ナノスケールの手がかりに基づく巨視的心臓組織機能の制御を可能にします。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25 mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500 g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
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