Abstract
心血管疾病仍然是全世界死亡1的首要原因。心脏组织工程拥有许多承诺能够提供突破性的医学发现与开发用于心脏再生和体外筛选分析功能组织的目标。但是，要创建心脏组织的高保真模型的能力已经证明，很难。心脏的细胞外基质（ECM）是一种复杂的结构，包括生物化学和生物力学信号从微至纳米尺度2。局部机械负载条件和细胞-细胞外基质相互作用的最近被确认为在心脏组织工程3-5关键部件。
心脏ECM的很大一部分是由排列的胶原纤维与纳米级直径的显著影响组织结构和机电耦合2。不幸的是，很少有甲肝病毒方法Ë能够模仿的ECM纤维的组织下来到纳米尺度。在纳米材料制备技术的最新发展，但是，已经启用了模仿的心脏6-9 ECM的体内结构和基底刚度线索可伸缩支架的设计和制造。
这里，我们提出的发展2再现的，具有成本效益且可扩展的纳米图案的过程，使用生物相容的聚合物的聚（丙交酯-共-乙交酯）（PLGA）8和聚氨酯（PU）基聚合物心肌细胞的功能对应。这些各向异性nanofabricated基质（ANFS）模仿的良好组织，对准组织相关的ECM，并且可以用于研究纳米形貌对细胞的形态和功能10-14中的作用。
使用nanopatterned（NP）硅原型为模板，聚氨酯丙烯酸酯（PUA）的模具制造。这PUA模具，然后用PA通过紫外线辅助或溶剂介导的毛细管力光刻（CFL），分别为15,16 ttern聚氨酯或PLGA水凝胶。简要地，PU或PLGA的预聚物是滴分配到一个玻璃盖玻片和PUA模具被放置在顶部。用于UV辅助CFL，拾音器，然后暴露于UV辐射（λ= 250-400纳米）进行固化。对于溶剂介导的节能灯相比，PLGA是用热（120℃）和压力（100千帕）压花。固化后，将模具中的PUA被剥离，留下一个ANFS用于细胞培养。主细胞，如新生大鼠心室肌细胞，以及人多能干细胞衍生的心肌细胞，可以维持在ANFS 2。
Introduction
心血管疾病是发病率和死亡率在世界上领先的原因，并提出对已经紧张的全球卫生系统1,17一个沉重的社会经济负担。心脏组织工程有两个不同的目标：（1）缺血性疾病或心肌病后的再生受损心肌或（2）创建的心脏进行体外药物筛选或疾病模型的高保真度模型。
心脏是一个复杂的器官，必须不断地努力提供血液到身体。心肌细胞和组织的支持密密麻麻的层状结构在整个心脏壁18,19排列成螺旋状图案。心脏是机电也以高度协调的方式有效地排出血液输送到全身21加上20。几个主要障碍仍有待解决，但是，之前巧夺天工的设计，能够可靠体外概括。首先，尽管强劲的心肌细胞分化的方法继续发展22，HPSC-CMS仍然表现出相当不成熟的表现型。其机电性能和形态最接近胎儿的水平23。其次，当保持在传统的培养条件下，无论是干细胞衍生和初级心肌不能组装成原生，组织样结构。相反，细胞变得随机取向，并没有表现出成人的心肌24的带状杆形外观。
细胞外基质（ECM）的环境中与细胞相互作用中起着许多细胞过程11,13,25显著作用。细胞外基质组成的复杂的，定义良好的分子和地形线索显著影响细胞6,26的结构和功能。内部的心脏，细胞排列紧密遵循的基本纳米尺度的ECM纤维2。这些nanotopograph的影响对细胞和组织的功能iCal的线索，然而，还远远没有完全理解。纳米尺度的细胞的生物材料相互作用的初步研究表明，亚微米，沟槽宽度为细胞信号27，粘附28-30，生长31和分化32,33的潜在重要性和影响。然而，由于在显影重现的和可扩展的nanofabricated基板的难度，这样的研究不能再现复杂的体内细胞外基质环境中的多尺度的细胞效应。在这个协议中，一个简单和具有成本效益的纳米加工技术生产的细胞培养支架模仿原生心脏细胞外基质纤维排列进行了描述，从而为广泛的心肌生物材料相互作用的新调查。了解心肌细胞与细胞外基质的纳米级环境如何相互作用可能允许控制细胞行为更加紧密地模仿天然组织功能的能力化。此外，单层细胞是一种简化的实验系统相比，三维结构，但仍然表现出对有见地的调查和功能性筛选2,34-36复杂的多细胞行为。最后，这样的支架可以用于改善细胞的移植物功能时进行再生的目的37植入到心脏。
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Protocol
所有过程都是在室温（〜23℃）下进行，除非另有说明。
1，硅制作的大师
- 清洁硅晶片下的O 2 / N 2气的100％乙醇或二甲苯和干燥。
- 将硅片在旋涂机在2,000-4,000转的转速，产生0.3-0.5微米厚的薄膜。
- 通过使用光刻系统模式与正确的尺寸的光致抗蚀剂膜
- 完全浸入所述图案化光致抗蚀剂涂覆硅晶片中的光致抗蚀剂显影溶液的适当体积。
- 冲洗显影光致抗蚀剂涂覆的硅晶片，用去离子水。
- 以形成亚微米尺度的脊与接近垂直的侧壁，深反应离子蚀刻使用蚀刻系统中暴露的硅的阵列。
- 通过将硅晶片等离子灰系统中移除剩余的光刻胶。
- 切硅瓦特afers用金刚石尖的刀插入适当大小的硅大师为后续副本成型。
2，从硅谷大师制作的PUA模具的
注意：要添加到主硅纳米加工量将取决于nanopatterned师傅被复制，以及聚氨酯丙烯酸酯（PUA）的溶液的粘度的地区而异。
- 清洁硅主表面用100％乙醇或下的O 2 / N 2气二甲苯和干燥。
- 放置硅主图案的一面朝上在培养皿中。
- 对于一个硅主用2厘米×2厘米的表面图案，移液管加入40μlPUA的到图案表面。
- 放置4厘米×4厘米的透明聚酯（PET）薄膜在分配PUA片。
- 向下按PET片材和使用辊或边缘平坦的表面（如卡），以便传播PUA整个图案面片材下方的整个图案覆盖的PUA预聚物。
- 将长约10厘米低于20瓦（115伏）UV光（λ= 365 nm）的硅高手，预聚物和PET为50秒。为了有效，紫外光波长可以310-400纳米之间的任何地方。的光的强度为10-15毫瓦/厘米2在基板的表面上。
- 固化后，用血管钳取出PET薄膜慢。 PUA应该附加到PET膜与硅主纳米图案的负极。
- 治愈PUA / PET奈米紫外光下的，使用前至少12小时。过度曝光是不是一个问题。
- 清洁硅的主人，将PET的另一部影片在主的顶部不加PUA和暴露于UV光（λ= 365 nm）的为50秒，除去PET膜。这将除去未反应的单体。
- 冲洗硅师傅用100％乙醇或二甲苯和干下的O 2 / N 2气体。
3A。纳米图案聚氨酯聚合物
图3b。纳米图案聚（乳酸 - 乙醇酸）水凝胶
- 大力混炼硅橡胶基地和有机硅弹性体固化剂的比例为10:1创建一个平面的PDMS模具。
- 倒混合的PDMS前体的溶液注入到培养皿中，以使PDMS前体达到5毫米高的盘的边缘（ 即 ，以使PDMS为5毫米厚）。
- 放置培养皿和PDMS前体在干燥器中进行1小时脱气。
- 移动培养皿和PDMS前体到一个65℃的烘箱中至少2小时固化。
- PDMS固化后，用剃刀切平的PDMS成3厘米×3厘米见方的部分。这些将在后面的图案形成方法中使用的平坦PDMS模具。
- 干净的直径为25 mm的圆形玻璃片由PL约占新交在异丙醇中超声波仪水30分钟。
- 根据O 2 / N 2气体干燥清洁玻片。
- 滴分配100μl的PLGA溶液（15％w / v的PLGA的氯仿溶液）到载玻片上。
- 放置在所分配的PLGA的顶部平坦PDMS模具以吸收溶剂，将获得一个平坦的PLGA表面。通过在PDMS 5分钟的顶部放置200克的重量施加轻微压力（〜10千帕）。
- 慢慢剥离平坦PDMS模具和放置在预热的板（120℃）的玻璃盖5分钟，以除去残留的溶剂和增加PLGA和盖玻璃之间的粘合。
- 将NP PUA模具上的平面的PLGA的顶部，并通过对PUA模具的顶部放置1千克的重量施加恒定的压力（〜100千帕），并加热（120℃），同时在加热板上15分钟。
- 从PLGA盖玻片除去重量，并允许基质冷却至室温。请勿移除PUA模具，直到基质已冷却。
- 一旦基质充分冷却，小心地撕下NP PUA模具，揭示了NP PLGA基质。对NP PLGA基质应该有一个闪光的外观。
- 将成品样品干燥器中储存长达一个月。
4，细胞种植与文化
注：本协议描述可用于新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）和H7人类胚胎干细胞衍生的心肌细胞（胚胎干细胞-CMS），但其他细胞来源的文化。
- 装上ANFS盖玻片（PU或PLGA）为35 mm组织培养聚苯乙烯菜。吸取20μL诺兰光学胶（NOA83H）到培养皿的底部，轻轻将ANFS盖玻片上的NOA的顶部。让胶水散开并覆盖整个盖玻片底部。治愈NOA暴露菜紫外线10分钟。
- 消毒ANFS通过用2ml的5分钟，70％含水乙醇溶液漂洗两次。删除Ë通过THANOL愿望。让ANFS彻底风干〜1下的紫外线杀菌灯（λ= 200-290纳米）在生物安全柜小时。
- 细胞黏附是由隔夜涂ANFS中纤维连接蛋白增强。在去离子水稀释至纤连蛋白5微克/毫升。移液管加入2ml纤维连接蛋白溶液放入盘中。放置在培养箱中在37℃和5％CO 2中过夜（至少6小时）。
- 获得NRVMs，人类胚胎干细胞的CM，或其他感兴趣的心肌细胞，根据先前的协议22。
- 在1,000 rpm离心3分钟，以沉淀细胞离心细胞样品。
- 通过抽吸小心去除上清。确保不打扰颗粒。
- 重悬的细胞在适当的培养基，以4.6×10 6细胞/ ml的浓度。
- 小心吸取200微升细胞悬液到消毒ANFS。确保细胞悬液保持在盖玻片。
- 在37℃和5％的细胞放置在孵化器CO 2 4小时，以允许细胞附着到ANFS。
- 加入2毫升温培养基的相同的条件下，以菜和替换细胞培养箱中培养。
- 24小时后，取出介质并用2ml的DPBS洗两次，以除去多余的细胞。
- 加入2毫升温培养基的相同的条件下，以菜和替换细胞培养箱中培养。培养细胞至汇合。更换媒体隔日。
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Representative Results
图1是在生产过程的两个制造方法的示意图。由于由纳米级形貌光的衍射，纳米图案应导致虹彩表面到ANFS 图2描述了这种虹彩表面上形成良好的图案25毫米NP-PU盖玻片（图2A）与800nm 的脊和槽宽度（图2B）。该ANFS的彩虹外观会有所不同略有不同的脊和沟槽宽度。
接种细胞到ANFS后，细胞应该开始在与基板的凸条平行的方向上对齐。走线应播种后的第一个24小时内变得明显，并应保持在培养期间的全部。 图3显示NRVMs有代表性的明场图像后7天的文化和人类胚胎干细胞CM的48小时培养后。 NRVMs一个ND人类胚胎干细胞的CM的NP表面上表现出明显的结构各向异性和对齐方式（ 图3B和3D），而在无图案表面的心肌细胞被随机取向（ 图3A和3C）。免疫组化分析，突出了纳米形貌对细胞骨架排列的影响。肌动蛋白微丝（F-肌动蛋白）和α-横纹肌辅肌动蛋白在细胞上的ANFS成为沿所述纳米脊对齐，但仍随机分布在上无图案的基质细胞（ 图4）中培养。心肌细胞24-48小时培养后，自发地跳动。
图1。 纳米加工原理 -两个纳米加工进程内的图S弯。 （B - D）描绘紫外线辅助毛细管力光刻（CFL），而（E-H） -描绘溶剂介导的节能灯。 （ 一 ）PUA负是由硅制成高手。 （B）的聚氨酯预聚物是滴分配到载玻片上，并在PUA模具被放置在顶部。 （C）PUA模具及PU盖玻片，然后暴露在紫外线光固化聚氨酯。 （E）的 PLGA聚合物溶液滴分配到载玻片和平坦PDMS模具被用来创建一个平坦的PLGA表面。 （F）一种PUA模具被放置在平坦的PLGA的顶部和（G）的恒定热和压力被施加到热压印的NP进PLGA。 （D，H）剥离掉PUA模具后，NP-PU或PLGA基质掉队。心肌细胞可以被接种到这个NP表面以产生细胞的对齐阵列。
图2：NP-PU底物（A）大面积的NP表面的照片。盖玻片的虹彩外观由纳米形貌引起的。底层的纳米形貌的横截面（B）的SEM图像。
NRVMs 图3。对齐心肌细胞。10X亮场图像后7天的文化（A，B）和人类胚胎干细胞的CM后培养2天（C，D）。 NRVMs培养上的NP-PU底物（B）表现出明显的结构排列，而在平坦的聚氨酯基体（A）NRVMs是随机排列。在（B）和（D）的箭头表示的NP各向异性的方向。比例尺= 100微米。
。图4免疫荧光共聚焦成像细胞骨架排列和条纹; α-横纹肌辅肌动蛋白（红色），细胞核（蓝色），以及F-肌动蛋白（绿色）。细胞培养上的NP基板对准了α-横纹肌辅肌动蛋白和F-肌动蛋白纤维细胞的同时对培养基质平板有随机取向的纤维。插图红色的α-横纹肌辅肌动蛋白通道清晰地显示横纹肌肌节。
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Discussion
功能上成熟的心脏组织都在体内和心脏组织工程的体外应用缺乏供。这里所描述的紧凑型荧光灯的纳米加工方法是健壮的技术可以实现蜂窝对准与影响宏观组织的功能，由于该系统的可伸缩性。大区域可以很容易地被图案化，并用于细胞培养。宏观蜂窝对准是在心脏组织工程必要的，以便建立仿生的，因为它影响着心肌38的机械和电气性能的功能组织。
这里的方法可应用于广泛的心脏组织工程中的应用。以前已经证明了纳米级的线索有助于创造一个心脏干细胞小生境，促进肝细胞再生14。因此，通过使用可生物降解的聚合物如PLGA，nanopatterned“补丁”，可以为促进心脏损伤后愈合。另外，通过使用水凝胶具有类似的弹性模量为原生心脏，心肌细胞外基质的相互作用可以研究一个简化的，可复制的系统。
各种其它方法，如微接触印刷，静电纺丝，和微结构，以前被用来控制在39-41微米设计的心脏组织的结构。虽然这些技术已被证明是成功地获得蜂窝对准，它很可能是体内心脏组织的结构和功能是由ECM的小得多，nanotopographical线索管，并因而我们的NP基板应证明是有利的。此外，相比于我们的各向异性nanofabricated基板这些微观图案化技术有其固有的缺点。例如，我们的纳米图案的方法更符合成本效益的和可控的比静电。微接触印刷，另一方面，RELIES对细胞附着到特定的通道来获得结构各向异性。为了创建一个功能单层，细胞必须那么无论增殖或迁移这些车道，形成紧密连接。这是更困难的细胞几乎没有增殖能力，如新生儿心肌细胞。微结构也受到无法建立紧密耦合的细胞单层。由于相比于微结构的细胞的比例，细胞存在于顶部或微嵴内侧。这限制了细胞 - 细胞相互作用的量和减少细胞间的耦合。用我们的方法中，细胞变得通过仿生纳米级形貌一致，并且可以自由地与邻近的细胞相互作用的特征尺寸是至少一个数量级，比细胞本身小。这允许更仿生，要创建的紧密耦合的细胞单层。
对于使用NP-PU最佳效果，我们强烈建议以下的G姑娘盖玻片前处理步骤。这些步骤将增加聚合物粘附到玻璃表面。这不仅有助于清洁去除PUA主的制造过程中还要防止图案的聚合物从实验过程中从玻璃分离。要测试的预处理步骤的有效性，放置1 NP-PU基质中的水和观察，如果聚合物仍粘附在玻璃上。
PLGA是乙醇酸和被两个装置和体内的药物递送开发乳酸的共聚物。因此，该基体提供了良好的，生物相容的ECM的细胞。 PLGA的刚性可以通过调整乙醇酸的比例，乳酸或通过改变PLGA的收缩在氯仿中进行调制。
各种参数可以很容易地改变和调整，在这个系统进行优化或调查目的。各种聚氨酯基聚合物可具有宽范围的机械性能。因此，通过使用不同的PU预聚物，各种基板的刚性可以通过相同的协议来制造。用户还可以改变底物的形貌。在衬底的纳米形貌是依赖于该硅原型的设计。因此，各种脊和槽的宽度，以及各种几何形状的，可以通过改变该硅原型设计，以满足规格的图案化。
纳米脊的大小也将影响细胞和组织的行为。较小的槽宽允许更少的细胞渗透到凹槽并限制细胞的相互作用与工程纳米形貌2。反过来，这将改变的心肌细胞单层各向异性行为的程度。此外，所提出的协议被限制在二维（2D）细胞培养和对准。显然，要真正仿生，工程心脏组织将需要3D。今后的工作是需要designin克致密，排列functional3D心脏组织。这里介绍的协议，但是，提供心肌细胞形态控制良好，使得宏观心脏组织功能的基础上纳米线索的控制。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25 mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500 g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
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