Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kapillarkraft Litografi for Cardiac Tissue Engineering

Published: June 10, 2014 doi: 10.3791/50039
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1, 2, 1
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Department of Pathology, University of Washington

Abstract

Hjerte-kar-sygdom er fortsat den førende dødsårsag på verdensplan 1. Cardiac tissue engineering holder meget løfte om at levere banebrydende medicinske opdagelser med målene at udvikle funktionelle væv til hjerte-regeneration samt in vitro-screening-assays. Imidlertid har evnen til at skabe high-fidelity modeller hjertevæv vist sig vanskeligt. Hjertets ekstracellulære matrix (ECM) er en kompleks struktur, der består af både biokemiske og biomekaniske signaler fra mikro-til nanometer skala 2. Lokal mekanisk belastningsforhold og celle-ECM interaktioner er for nylig blevet anerkendt som vitale komponenter i hjertets tissue engineering 3-5.

En stor del af hjertets ECM består af aligned collagenfibre med nano-skala diameter, der væsentligt påvirker vævsarkitektur og elektromekaniske kobling 2. Desværre få metoder HAVe været i stand til at efterligne organiseringen af ​​ECM fibre ned til nanometer skala. Nylige fremskridt i nano-teknikker har dog gjort det muligt for design og fabrikation af skalerbare stilladser, der efterligner in vivo strukturelle og substrat stivhed tidskoder af ECM i hjertet 6-9.

Her præsenterer vi udviklingen af to reproducerbar, omkostningseffektive og skalerbare nanopatterning processer for den funktionelle tilpasning af hjerteceller ved hjælp af biokompatible polymer poly (lactid-co-glycolid) (PLGA) 8 og en polyurethan (PU) baseret polymer. Disse anisotropt nanofabricated substrata (ANFS) efterligner den underliggende ECM af velorganiserede, opstillet væv og kan bruges til at undersøge den rolle nanotopography celle morfologi og funktion 10-14.

Ved hjælp af en nanopatterned (NP) silicium mester som en skabelon, der er en polyurethanacrylat (PUA) mug fabrikeret. Denne PUA støbeform anvendes derefter til pattern PU eller PLGA hydrogel via UV-assisteret eller opløsningsmiddel-medieret kapillarkraft litografi (CFL), henholdsvis 15,16. Kort fortalt, PU eller PLGA præpolymer er drop dispenseret på et dækglas og PUA formen er placeret på toppen. For UV-assisteret CFL, er PU udsættes derefter for UV-stråling (λ = 250-400 nm) til hærdning. Til opløsningsmiddel-medieret CFL, er PLGA præget ved hjælp af varme (120 ° C) og tryk (100 kPa). Efter hærdning er PUA skimmel skrælles, efterlader en ANFS for cellekultur. Primære celler, såsom neonatal rotte ventrikelmyocytter, såvel som humane pluripotente stamceller afledt cardiomyocytter, kan opretholdes på ANFS 2.

Introduction

Hjerte-karsygdomme er den hyppigste årsag til sygelighed og dødelighed i verden og præsentere en vægtig samfundsøkonomisk byrde på et allerede anspændt globale sundhedssystem 1,17. Hjertevæv teknik har to forskellige mål: (1) at regenerere beskadiget myocardium efter iskæmisk sygdom eller kardiomyopati eller (2) at skabe et high fidelity model af hjertet til in vitro drug screening eller sygdom modellering.

Hjertet er et komplekst organ, der skal arbejde hele tiden at levere blod til kroppen. Tætpakkede laminare strukturer cardiomyocytes og støttende væv er arrangeret i spiralformede mønstre hele hjerte væg 18,19. Hjertet er også elektromekanisk koblet 20 i en meget koordineret måde til effektivt at skubbe blod til kroppen 21. Flere store hurdler, der skal løses, men før naturens indviklede design pålideligt kan sammenfattet in vitro.Først, selvom robuste cardiomyocyte differentiering metoder fortsat udvikles 22. hPSC CMS stadig udviser temmelig umodne fænotyper. Deres elektromekaniske egenskaber og morfologi bedst svarer føtalniveauerne 23. For det andet, når det opbevares i traditionelle dyrkningsbetingelser, både stamcelle-afledt og primære cardiomyocytes undlader at samle ind indfødte, vævs-lignende strukturer. Snarere bliver cellerne tilfældigt orienteret og udviser ikke den stribede stang-formede udseende voksen myokardiet 24.

Den ekstracellulære matrix (ECM) miljø med hvilke celler interagerer spiller en væsentlig rolle i talrige cellulære processer 11,13,25. ECM består af komplekse, veldefinerede molekylære og topografiske signaler, der væsentligt påvirker struktur og funktion af celler 6,26. I hjertet, cellulære tilpasning nøje følger de underliggende nanometer skala ECM fibre 2. Virkningen af ​​disse nanotopographiCal tidskoder på celler og væv funktion, er dog langt fra helt forstået. Foreløbige studier af nanometer skala interaktion celle-biomateriale angive den potentielle betydning og konsekvenser af sub-micron topografiske signaler for celle signalering 27, vedhæftning 28-30, vækst 31 og differentiering 32,33. Men på grund af vanskeligheden ved at udvikle reproducerbare og skalerbare nanofabricated substrater, er disse undersøgelser ikke kunne reproducere de flerskalamodeller cellulære virkninger af komplekset in vivo ECM miljø. I denne protokol, er en enkel og omkostningseffektiv nanofabrikation teknik til at producere cellekultur stilladser efterligne indfødte hjerte-ECM fiber tilpasning beskrevet, giver mulighed for en bred vifte af nye undersøgelser af cardiomyocyte-biomateriale interaktioner. Forstå, hvordan cardiomyocytes interagerer med nanoskala ECM miljø kunne give mulighed for evnen til at kontrollere cellulære adfærd til mere nøje efterligner native væv funktion. Desuden cellemonolagene er en forenklet eksperimentelle system i forhold til 3D-strukturer, men stadig udviser komplekse flercellede adfærd for indsigtsfulde undersøgelser og funktionel screening 2,34-36. Endelig kan sådanne stilladser anvendes til at forbedre cellulær transplantatfunktion når implanteret i hjertet for regenerative formål 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer udføres ved stuetemperatur (~ 23 ° C), medmindre andet er angivet.

1.. Fabrikation af Silicon Master

  1. Ren siliciumskive med 100% ethanol eller xylen og tør under O 2 / N 2-gas.
  2. Placer silicium wafer i spin-coater ved rotations hastigheder på 2.000-4.000 omdrejninger i minuttet til en 0,3-0,5 um tyk film.
  3. Mønster af fotoresistfilm med de korrekte dimensioner ved hjælp af en fotolitografisk-system
  4. Fuldt ud at fordybe mønstrede fotoresistbelagte-belagt silicium wafers i en passende mængde fotoresistbelagte udvikle løsning.
  5. Skyl de udviklede fotoresistbelagte-belagt silicium wafers med demineraliseret vand.
  6. At danne arrays af sub-micron skala kamme med nær lodrette sidevægge, dyb reaktiv ion etch den eksponerede silicium ved hjælp af en radering system.
  7. Fjern de resterende fotoresist ved anbringelse af silicium wafer i et plasma asher system.
  8. Skær silicium wAfers med en diamant spids kniv ind i de passende størrelse silicium mestre til efterfølgende replika støbning.

2.. Fabrikation af PUA Mold fra Silicon Master

BEMÆRK: Volume der skal lægges til silicium master for nanofabrikation vil variere afhængigt af det område af nanopatterned mester skal gentages, samt viskositet polyurethanacrylat (PUA) løsning.

  1. Ren silicium mester overflade med 100% ethanol eller xylen og tør under O 2 / N 2-gas.
  2. Placer silicium mester mønstrede side op i en petriskål.
  3. For en silicium mester med en 2 cm x 2 cm overflade mønster, pipette 40 ul PUA til mønstret overflade.
  4. Placer et ark af 4 cm x 4 cm transparent polyester (PET) film over dispenseret PUA.
  5. Tryk ned på PET-arket og spredes PUA under arket over mønsteret ansigt ved hjælp af en rulle eller flad kantet overflade (såsom et kort), således at helemønster er omfattet af PUA præpolymer.
  6. Placer silicium mester, prepolymer, og PET cirka 10 cm under en 20 Watt (115 V) UV-lys (λ = 365 nm) for 50 sek. For at være effektiv, kan UV-lys bølgelængde være et sted mellem 310 til 400 nm. Intensiteten af lyset er 10-15 mW / cm 2 på overfladen af substratet.
  7. Efter hærdning fjernes PET-folie langsomt med en pincet. PUA bør knytte til PET-folie med et negativ af silicium mester nanopattern.
  8. Cure PUA / PET nanopatterns under UV mindst 12 timer før brug. Overeksponering er ikke et problem.
  9. For at rengøre silicium mestre, placere en anden film af PET på toppen af ​​master uden tilsætning af PUA og udsættes for UV-lys (λ = 365 nm) for 50 sek og fjerne PET-folie. Dette vil fjerne enhver reagerede monomerer.
  10. Skyl silicium master med 100% ethanol eller xylen og tør under O 2 / N 2-gas.

3a. Nanopatterning polyurethanpolymer

  • Forbered 25 mm diameter cirkulære objektglas ved at placere i en ozon behandling kammer i 10 min.
  • Placer ozonbehandlede glasslides på lille PDMS blok for nem håndtering.
  • Påfør et tyndt lag af overfladen hæfteformidler med pensel til objektglas. Lufttørre objektglas i 30 min.
  • Anbring objektglasset på et stykke printerpapir.
  • Drop dispensere 10 ul af polyurethan (PU) præ-polymer (NOA 76) til centrum af objektglas. Sørg for, at ingen bobler er til stede efter tilsætning.
  • Place PUA skimmel, mønster nedad, på objektglas. Dispergere PU ensartet over overfladen af ​​objektglasset ved at rulle en gummicylinder rulle langs PUA formen. Printer papir vil absorbere polymer overløb.
  • Watt UV-lampe. Polymerisation cirka PU er afhængig af strømmen af ​​UV-kilde.
  • Fjern prøven fra UV-lyskilde og omhyggeligt skrælle PUA mug fra PU-belagt objektglas. Polymerisation af PU betragtes complete når PUA skimmel peels rent væk fra prøven og PU glas slide har en iriserende udseende.
  • Placer færdige prøver i ekssikkator til opbevaring, så længe en måned.

    • 3b. Nanopatterning Poly (lactid-co-glycolid) Hydrogel

    1. Opret en flad PDMS formen ved kraftig blanding siliconeelastomer og base silikoneelastomer hærder i en 10:1.
    2. Hæld blandede PDMS præcursoropløsning i en petriskål, så PDMS forløber når 5 mm op i kanten af fadet (dvs. så PDMS er 5 mm tyk).
    3. Placer petriskål og PDMS forløber i en ekssikkator i 1 time til afgasse.
    4. Flyt petriskål og PDMS forløber ind i en 65 ° C varm ovn i mindst 2 timer til at helbrede.
    5. Efter PDMS er hærdet, skal du bruge en barbermaskine til at skære de flade PDMS i 3 cm x 3 cm firkantede sektioner. Disse vil være de flade PDMS forme, der anvendes senere i mønstret processen.
    6. Diameter Clean 25 mm cirkulær objektglas ved placing i isopropylalkohol i 30 minutter i en vand-sonikator.
    7. Renses glasslides under O 2 / N 2 gas.
    8. Drop dispensere 100 pi PLGA opløsning (15% w / v PLGA i chloroform) på objektglas.
    9. Anbring en flad PDMS mug på toppen af ​​doseret PLGA at absorbere opløsningsmiddel og få en flad PLGA overflade. Påfør et let tryk (~ 10 kPa) ved at placere en 200 g vægt på toppen af ​​PDMS i 5 min.
    10. Langsomt skræl væk flad PDMS mug og placere dækglasset på en forvarmet plade (120 ° C) i 5 minutter for at fjerne resterende opløsningsmiddel og øge vedhæftning mellem PLGA og dækglasset.
    11. Placer NP PUA mug på toppen af ​​den flade PLGA og anvende konstant tryk (~ 100 kPa) og varme (120 ° C) ved at placere en 1 kg vægt oven på PUA formen mens den varme plade i 15 min.
    12. Fjern vægten fra PLGA dækglas og lad substrater til at afkøle til stuetemperatur. Fjern ikke PUA mug indtil substrater har væretafkølet.
    13. Når undergrund har tilstrækkeligt afkølet, forsigtigt skræl væk NP PUA skimmel, afslører NP PLGA undergrund. NP PLGA substrat bør have en iriserende udseende.
    14. Placer færdige prøver i ekssikkator til opbevaring, så længe en måned.

    4.. Cellepodning og kultur

    BEMÆRK: Denne protokol beskriver kulturen i neonatal rotte ventrikelmyocytter (NRVMs) og H7 humane embryonale stamceller afledt cardiomyocytes (embryonale-CMS), men andre celle-kilder kan anvendes.

    1. Fastgør ANFS dækglas (PU eller PLGA) til et 35 mm vævskulturpolystyren fad. Pipetter 20 ul Norland Optical Adhesive (NOA83H) til bunden af ​​skålen og forsigtigt placere ANFS dækglas oven på NOA. Lad limen til at sprede ud og dække hele dækglas bund. Cure NOA ved at udsætte fad for UV i 10 min.
    2. Steriliser ANFS ved skylning med 2 ml 70% vandig ethanolopløsning i 5 minutter, to gange. Fjern ethanol ved aspiration. Tillad ANFS helt lufttørre for ~ 1 time under UV sterilisering lampe (λ = 200-290 nm) i den biologiske sikkerhed kabinet.
    3. Cellulær adhæsion er forbedret ved at overtrække ANFS i fibronectin natten over. Fortyndet fibronectin i demineraliseret vand til 5 mg / ml. Afpipetteres 2 ml fibronektin løsning i fad. Placer i inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 natten over (mindst 6 timer).
    4. Opnå NRVMs, embryonale-CMS eller andre hjerteceller af interesse i henhold til tidligere protokoller 22.
    5. Centrifuge celleprøve ved 1.000 rpm i 3 minutter for at pelletere cellerne.
    6. Fjern forsigtigt supernatanten ved aspiration. Sørg for ikke at forstyrre bundfaldet.
    7. Resuspender celler i passende dyrkningsmedier til en koncentration på 4,6 x 10 6 celler / ml.
    8. Omhyggelig pipettering 200 pi cellesuspension på steriliserede ANFS. Sørg for, at celle suspensionen forbliver på dækglasset.
    9. Placer celler i inkubator ved 37 ° C og 5%CO 2 i 4 timer for at tillade celler til at knytte til ANFS.
    10. Tilsæt 2 ml varmt dyrkningsmedier til fad og erstatte celler i inkubator under de samme betingelser.
    11. Efter 24 timer, fjerne medier og vask med 2 ml DPBS to gange for at fjerne overskydende celler.
    12. Tilsæt 2 ml varmt dyrkningsmedier til fad og erstatte celler i inkubator under de samme betingelser. Dyrke cellerne til konfluens. Udskift medier hver anden dag.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Figur 1 er en skematisk oversigt af fremstillingsprocessen for de to fremstillingsmetoder. På grund af diffraktion af lys forårsaget af nanoskala topografi bør nanopatterning resultere i en iriserende overflade til den ANFS. Figur 2 afbilder dette iriserende overflade på et godt mønstret 25 mm NP-PU dækglas (figur 2A) med 800 nm højderyg og not bredde (fig. 2B). Den iriserende udseende ANFS vil variere lidt afhængig af rygning og notbredder.

    Efter podning af cellerne på ANFS bør celler begynder at tilpasse i retningen parallelt med ryggene af substratet. Justering bør blive synlige indenfor de første 24 timer efter såning og bør forblive for hele dyrkningsperioden. 3 viser repræsentative lyse felt billeder af NRVMs efter 7 dages kultur og embryonale CMS efter 48 timers kultur figur. NRVMs ennd hESC-CMS på NP overflader viser indlysende strukturelle anisotropi og tilpasning (figur 3B og 3D), mens kardiomyocytter på unpatterned overflader tilfældigt orienteret (3A og 3C). Immunhistokemisk analyse fremhæver virkningen af ​​nanotopography celle cytoskeletal tilpasning. Actin mikrofilamenter (F-actin) og α-sarcomerisk actinin i celler dyrket på ANFS bliver rettet ind langs nano-kamme, men forbliver tilfældigt fordelt i celler på unpatterned substrater (figur 4). Hjerteceller udviser spontan prygl efter 24-48 timers kultur.

    Figur 1
    Figur 1.   Nanofabrikation skematisk - diagram over to nanofabrikation proccesser. (B - D) skildre UV-assisteret kapillarkraft litografi (CFL), mens (E - H) skildrer solvent-medieret CFL. (A) PUA negativ er lavet af en silicium master. (B) PU præpolymer er drop-dispenseret på et objektglas og PUA formen er placeret på toppen. (C) En PUA mug og PU dækglas udsættes derefter for UV-lys for at hærde PU. (E) PLGA polymer løsning er drop-dispenseret på en glasplade og en flad PDMS støbeform bruges til at skabe en flad PLGA overflade. (F) En PUA formen er placeret på toppen af den flade PLGA og (G) konstant varme og tryk påføres hot-prægning NP i PLGA. (D, H) Efter skrælning væk PUA formen, er et NP-PU eller PLGA substrat efterladt. Hjerteceller kan derefter podes på denne NP overflade for at skabe aligned arrays af celler.


    Figur 2. NP-PU substrat. (A) Fotografi af stort område NP overflade. Iriserende udseende dækglasset er forårsaget af nanotopography. (B) SEM billede af tværsnittet af den underliggende nanotopography.

    Figur 3
    Figur 3.. Alliancefri cardiomyocytes. 10X lyse felt billeder af NRVMs efter 7 dages kultur (A, B) og embryonale CMS efter 2 dages kultur (C, D). NRVMs dyrket på NP-PU substrater (B) udviser indlysende strukturel tilpasning, mens NRVMs på flade PU substrater (A) er tilfældigt Aligned. Pile i (B) og (D) angiver retningen af NP anisotropi. Målestok = 100 um.

    Figur 4
    .. Figur 4 Immunfluorescens konfokal imaging Cell cytoskeletal tilpasning og riller; α-sarcomerisk actinin (rød), cellekerner (blå), og F-actin (grøn). Celler dyrket på NP substrater har tilpasset α-sarcomerisk actinin og F-actin fibre, mens celler dyrket på flade substrater tilfældigt har orienterede fibre. Inset på rød α-sarcomerisk actinin kanal viser tydeligt tværstribede sarcomeres.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Funktionelt modne hjertevæv mangler både in vivo og in vitro anvendelser af hjertevæv engineering. CFL nanofabrikation her beskrevne metoder er robuste teknikker til at opnå cellulære tilpasning og påvirke makroskopisk væv funktion på grund af skalerbarheden af ​​systemet. Store områder kan let mønstret og anvendes til cellekultur. Makroskopisk cellulære tilpasning er afgørende i hjertevæv teknik for at skabe biomimetisk, funktionelle væv som det påvirker både mekaniske og elektriske egenskaber af myokardiet 38..

    Fremgangsmåderne her kan anvendes til en lang række anvendelser inden for hjertevæv engineering. Det er tidligere blevet påvist, at nanoskala stikord til at skabe en hjerte-stamceller niche og fremme regenerering 14. Således ved hjælp af bionedbrydelige polymerer, såsom PLGA, kan nanopatterned "lapper" gøres for at fremmeheling efter hjerte-fornærmelse. Alternativt ved hjælp af hydrogeler med lignende elasticitetsmoduler som indfødte hjerte, cardiomyocyte-ECM interaktioner kan studeres i en forenklet, reproducerbar system.

    Forskellige andre metoder, såsom microcontact trykning, electrospinning og microtopography, har tidligere været anvendt til at styre strukturen af manipuleret hjertevæv på mikroskala 39-41. Selv om disse teknikker har vist sig gode til at få cellulær tilpasning, er det sandsynligt, at struktur og funktion af in vivo hjertevæv er underlagt langt mindre, nanotopographical tidskoder af ECM og dermed vores NP substrat skulle vise sig fordelagtig. Derudover disse mikroskala mønster teknikker har iboende ulemper i forhold til vores anisotropt nanofabricated substrater. For eksempel vores nanopatterning metode er mere omkostningseffektiv og kontrollerbar end electrospinning. Microcontact trykning, på den anden side, relerne på celler klæber til særlige baner for at få strukturel anisotropi. For at skabe et funktionelt monolag, celler derefter enten formere sig eller flytte ud af disse baner til at danne tætte forbindelser. Dette er meget mere vanskeligt for celler med lidt eller ingen proliferativ kapacitet som neonatale cardiomyocytter. Microtopography er også begrænset af den manglende evne til at skabe tætkoblede cellemonolagene. På grund af omfanget af de celler, sammenlignet med microtopography celler opholde sig på oven på eller inde i microridges. Dette begrænser mængden af ​​celle-celle interaktion og nedsætter celle-celle-kobling. Med vores metode, bliver celler rettet via bioinspired nanoskala topografi og kan frit interagere med omkringliggende celler som funktion størrelser er mindst en størrelsesorden mindre end selve cellerne. Dette giver mulighed for mere biomimetisk, tætkoblede celler monolag skal oprettes.

    For optimale resultater med NP-PU anbefaler vi at følge glass dækglas forbehandling trin. Disse skridt vil øge polymer vedhæftning til glasoverfladen. Dette vil ikke kun støtte i ren fjernelse af PUA mester under fabrikation, men også forhindre mønstrede polymer fra løsrive fra glasset under forsøgene. For at teste effektiviteten af ​​de præ-behandlingstrin, placeres en NP-PU substrat i vand og observere, hvis polymeren forbliver levet op til glasset.

    PLGA er en co-polymer af glycolsyre og mælkesyre, der blev udviklet for både enheden og drug delivery in vivo. Således er denne substrat giver en god, biokompatibel ECM for cellerne. Stivheden af ​​PLGA kan moduleres ved enten tuning forholdet mellem glycolsyre til mælkesyre eller ved ændring sammentrækning af PLGA i chloroform.

    Forskellige parametre kan nemt varieres og justeres i dette system til optimering eller undersøgelse. Forskellige PU-baserede polymerer er tilgængelige med en lang rækkemekaniske egenskaber. Således ved hjælp af forskellige PU prepolymerer kan forskellige substrat stivheder fremstilles ved den samme protokol. Brugeren kan også ændre substratets topografi. Den nanotopography af substratet er afhængig af udformningen af ​​silicium master. Derfor er en række ridge og notbredder, samt forskellige geometrier, kan mønstret ved at ændre silicium mester design til at opfylde specifikationerne.

    Størrelsen af ​​nano-kamme, også påvirke celler og væv adfærd. Mindre notbredder giver mulighed for mindre celle penetration ind i rillerne og begrænse interaktionen cellens med ingeniørfirmaet nanotopography 2. Dette vil igen ændre omfanget af anisotrop adfærd hjertets cellemonolaget. Derudover er præsenteret protokol begrænset til todimensional (2D) cellekultur og tilpasning. Det er klart, at være virkelig biomimetiske ville engineering hjertevæv skal være 3D. Der er behov for fremtidig arbejde for designing tætte og tilpasset functional3D hjertevæv. Protokollen præsenteres her, tilbyder dog overlegen kontrollen af ​​hjertets celle morfologi og giver mulighed for kontrol af makroskopiske hjertevæv funktion baseret på nanoskala signaler.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fibronectin BD Biosciences 354008
    NOA 76 Norland Products, Inc. 7606B
    Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) Minuta Tech
    PUA Minuta Tech MINS-311RM
    Soft Rubber Roller Speedball
    Silicon Wafers NOVA Electronic Materials FA01-9900
    Photoresist Shipley SPRT510
    Photoresist Developer Shipley MF320
    Electron-Beam Lithography System JEOL JBX-9300FS
    Etching System Surface Technology Systems NP10 8UJ
    Plasma Asher System BMR Technology Co. DSF-200
    Ozone Cure System Minuta Tech MT-UV-O- 08
    Fusion Cure System Minuta Tech MT-UV-A 11
    NOA 83H Norland Products, Inc. 8301
    Spin Coater Laurel Technology WS-400-6NPP
    Skyrol PET Film SKC Co., Ltd. 23038-59-9
    25 mm Glass Slides Corning 2948
    Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 6/5/2553
    Poly(D,L-lactide-co-glycolide) Sigma-Aldrich P2191-1G
    Chloroform Sigma-Aldrich 372978-1L
    500 g Weights Global Insustrial T9FB503120
    Isopropyl Alcohol EMD Millipore PX1835-2
    Hot Plate Corning PC-420D
    Sonicator Branson B2510MTH

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
    2. Kim, D. -H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 565-570 (2010).
    3. Tulloch, N. L., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
    4. Bursac, N., Parker, K., Irvanian, S., Tung, L. Cardiomyocyte Cultures With Controlled Macroscopic Anisotropy: A Model for Functional Electrophysiological Studies of Cardiac Muscle. Circulation Research. 91, (2002).
    5. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
    6. Stevens, M. M. Exploring and Engineering the Cell Surface Interface. Science. 310, (2005).
    7. Mark, K., Park, J., Bauer, S., Schmuki, P. Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix. Cell Tissue Res. 339, 131-153 (2009).
    8. Lü, J. -M., Wang, X., Marin-Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., Chen, C. Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology. Expert. Rev. Mol. Diagn. 9, 325-341 (2009).
    9. Kim, H. N., et al. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Ann Biomed Eng. 40, 1339-1355 (2012).
    10. Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of Cell Biology. 197, 351-360 (2012).
    11. Park, J., Kim, H. -N., Kim, D. -H., Levchenko, A., Kahp-Yang, S. Quantitative Analysis of the Combined Effect of Substrate Rigidity and Topographic Guidance on Cell Morphology. IEEE Trans.on Nanobioscience. 11, 28-36 (2012).
    12. Kim, D. -H., Lee, H., Lee, Y. K., Nam, J. -M., Levchenko, A. Biomimetic Nanopatterns as Enabling Tools for Analysis and Control of Live Cells. Adv. Mater. 22, 4551-4566 (2010).
    13. Kim, D. -H., Wong, P. K., Park, J., Levchenko, A., Sun, Y. Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 203-233 (2009).
    14. Kim, D. -H., et al. Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration. Integr Biol. 4, 1019 (2012).
    15. Kim, P., et al. Fabrication of nanostructures of polyethylene glycol for applications to protein adsorption and cell adhesion. Nanotechnology. 16, 2420-2426 (2005).
    16. Hwang, S. Y., et al. Adhesion Assays of Endothelial Cells on Nanopatterned Surfaces within a Microfluidic Channel. Anal. Chem. 82, 3016-3022 (2010).
    17. Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the Future of Cardiovascular Disease in the United States: A Policy Statement From the American Heart Association. Circulation. 123, 933-944 (2011).
    18. Legrice, I. J., et al. Laminar structure of the heart: ventricular myocyte arrangement and connective tissue architecture in the dog. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 269, 1-12 (2002).
    19. Sosnovik, D. E., Wang, R., Dai, G., Reese, T. G., Wedeen, V. J. Diffusion MR tractography of the heart. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 47 (2009).
    20. Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circulation Research. 87, 275-281 (2000).
    21. Mohrman, D. E., Heller, L. J. Cardiovascular Physiology. , McGraw Hill Medical. (2010).
    22. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
    23. Zhang, J., et al. Functional Cardiomyocytes Derived From Human Induced Pluripotent Stem Cells. Circulation Research. 104, (2009).
    24. Qian, J. -Y., Guo, L. Altered cytosolic Ca2+ dynamics in cultured Guinea pig cardiomyocytes as an in vitro model to identify potential cardiotoxicants. Toxicology in Vitro. 24, 960-972 (2010).
    25. You, M. -H., et al. Synergistically Enhanced Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Culture on Nanostructured Surfaces with Induction Media. Biomacromolecules. 11, 1856-1862 (2010).
    26. Kim, H. N., et al. Nanotopography-guided tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 536-558 (2013).
    27. Mannix, R. J., et al. Nanomagnetic actuation of receptor-mediated signal transduction. Nature Nanotech. 3, 36-40 (2007).
    28. Karuri, N. W., et al. Biological length scale topography enhances cell-substratum adhesion of human corneal epithelial cells. J Cell Sci. 117, 3153-3164 (2007).
    29. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92, 2964-2974 (2007).
    30. Koo, L. Y., Irvine, D. J., Mayes, A. M., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G. Co-regulation of cell adhesion by nanoscale RGD organization and mechanical stimulus. J Cell Sci. 115, 1-11 (2002).
    31. Yim, E. K. F., et al. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26, 5405-5413 (2008).
    32. Dalby, M. J., et al. The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder. Nat Mater. 6, 997-1003 (2007).
    33. Park, J., Bauer, S., Mark, von der K., Schmuki, P. Nanosize and Vitality: TiO 2Nanotube Diameter Directs Cell Fate. Nano Lett. 7, 1686-1691 (2007).
    34. Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92, 232-257 (2006).
    35. Tung, L., Zhang, Y. Optical imaging of arrhythmias in tissue culture. Journal of Electrocardiology. 39, (2006).
    36. Himel, H. D., Bub, G., Lakireddy, P., El-Sherif, N. Optical imaging of arrhythmias in the cardiomyocyte monolayer. Heart Rhythm. 9, 2077-2082 (2012).
    37. Kim, J., Hayward, R. C. Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture. Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).
    38. Henderson, D. J., Anderson, R. H. The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart. Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).
    39. Badie, N., Bursac, N. Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure. Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).
    40. Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning. Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).
    41. Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).

    Tags

    Bioteknik Nanotopography Anisotropisk Nanofabrikation Cell Culture Cardiac Tissue Engineering
    Kapillarkraft Litografi for Cardiac Tissue Engineering
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Macadangdang, J., Lee, H. J.,… More

    Macadangdang, J., Lee, H. J., Carson, D., Jiao, A., Fugate, J., Pabon, L., Regnier, M., Murry, C., Kim, D. H. Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (88), e50039, doi:10.3791/50039 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter