Abstract
A doença cardiovascular continua a ser a principal causa de morte em todo o mundo 1. Engenharia de tecidos cardíacos muito promissora para entregar descobertas médicas inovadoras com os objectivos de desenvolvimento de tecidos funcionais para regeneração cardíaca, bem como ensaios in vitro de triagem. No entanto, a capacidade de criar modelos de alta fidelidade de tecido cardíaco tem sido difícil. Matriz extracelular do coração (ECM) é uma estrutura complexa composta de ambos os sinais bioquímicos e biomecânicos que variam a partir do micro-à escala nanométrica 2. Local condições de carga mecânica e interações célula-ECM foram recentemente reconhecidos como componentes vitais em engenharia de tecido cardíaco 3-5.
Uma grande parte do ECM cardíaco é composto por fibras de colágeno alinhados com diâmetros em escala nano que influenciam significativamente a arquitetura do tecido e acoplamento eletromecânico 2. Infelizmente, alguns métodos have foram capazes de imitar a organização das fibras de ECM para baixo para a escala nanométrica. Os recentes avanços em técnicas de nanofabricação, no entanto, permitiram o projeto e fabricação de andaimes escaláveis que imitam os sinais in vivo de rigidez estrutural e substrato do ECM no coração 6-9.
Aqui apresentamos o desenvolvimento de duas reprodutíveis, os processos de microusinagem escaláveis para o alinhamento funcional das células cardíacas usando o poli biocompatível polímero (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) 8 e um poliuretano (PU) de polímero a base de custo-benefício, e. Estes substratos anisotropicamente nanofabricated (ANFS) imitar o ECM subjacente bem organizados, tecidos alinhados e pode ser utilizado para investigar o papel de nanotopografia na morfologia e função das células 10-14.
Usando um mestre de silício nanopatterned (NP), como um modelo, um acrilato de poliuretano (PUA) molde é fabricado. Este molde PUA é então utilizado para pattern o hidrogel PU ou PLGA via assistida por UV ou litografia força capilar mediada por solvente (CFL), respectivamente 15,16. Resumidamente, PU ou PLGA de pré-polímero é gota dispensada para uma lamela de vidro e o molde PUA é colocada em cima. Para CFL assistida por UV, a UP é então exposto à radiação ultravioleta (λ = 250-400 nm) para a cura. Para mediada por solvente CFL, o PLGA é gravado utilizando calor (120 ° C) e pressão (100 kPa). Após a cura, o molde PUA é retirado, deixando para trás um ANFS para cultura de células. Pilhas, como miócitos ventriculares de ratos neonatos, bem como cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas, pode ser mantido no ANFS 2.
Introduction
A doença cardiovascular é a principal causa de morbidade e mortalidade no mundo e apresentar um peso sócio-econômico importante em uma 1,17 já tenso sistema de saúde global. Engenharia de tecidos cardíacos tem dois objetivos distintos: (1) para regenerar miocárdio danificado após doença isquêmica ou cardiomiopatia ou (2) para a criação de um modelo de alta fidelidade do coração para a triagem de drogas in vitro ou modelagem doença.
O coração é um órgão complexo que deve trabalhar constantemente para fornecer sangue para o corpo. Estruturas laminares densamente embalado de cardiomiócitos e tecidos de suporte são dispostos em padrões helicoidais em toda a parede do coração 18,19. O coração também é eletromecanicamente acoplada 20 em uma forma altamente coordenada para ejetar o sangue eficientemente para o corpo 21. Vários grandes obstáculos ainda precisam ser abordados, no entanto, antes de desenho intrincado da natureza pode ser reproduzido de forma confiável in vitro.Em primeiro lugar, embora os métodos de diferenciação de cardiomiócitos robustas continuam a ser desenvolvidos 22, HPSC-CMs ainda exibem fenótipos bastante imaturos. Suas propriedades eletromecânicas e morfologia mais se aproximam os níveis fetais 23. Em segundo lugar, quando mantidos em condições de cultivo tradicionais, tanto com células-tronco derivadas e cardiomiócitos primários não conseguem montar em, estruturas de tecido-como nativas. Pelo contrário, as células tornam-se orientadas aleatoriamente e não apresentam a aparência em forma de haste em faixas de miocárdio adulto 24.
O ambiente da matriz extracelular (ECM) com os quais interagem as células desempenha um papel importante em numerosos processos celulares 11,13,25. A ECM é composto por sinais moleculares e topográficos complexos, bem definidas, que influenciam de forma significativa a estrutura e função das células de 6,26. Dentro do coração, o alinhamento celular segue de perto as fibras ECM escala nanométrica subjacente 2. O impacto destes nanotopographpistas icas em células e a função do tecido, no entanto, está longe de ser completamente entendido. Estudos preliminares de interação célula-biomaterial escala nanométrica indicam a potencial importância eo impacto da sub-mícron sugestões topográficas para sinalização celular 27, adesão 28-30, crescimento de 31, e de diferenciação 32,33. No entanto, devido à dificuldade no desenvolvimento de substratos nanofabricated reprodutíveis e expansíveis, tais estudos podem não reproduzir os efeitos celulares multi-escala do complexo em ambiente de ECM in vivo. Neste protocolo, uma técnica de nanofabricação simples e de baixo custo para a produção de scaffolds de cultura celular que imita fibra de alinhamento ECM cardíaca nativa é descrito, permitindo uma ampla gama de novas investigações de interações cardiomiócitos-biomaterial. Entender como cardiomiócitos interagir com o ambiente ECM nanoescala pode permitir a capacidade de controlar o comportamento celular para mais de perto imitar func tecido nativoção. Além disso, as monocamadas de células são um sistema experimental simplificado em comparação com estruturas 3D, mas ainda apresentam um comportamento multicelular complexo para investigações criteriosas e triagem funcional 2,34-36. Finalmente, tais suportes pode ser usada para melhorar a função do enxerto celular quando implantado no coração para efeitos de regeneração 37.
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Protocol
Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente (~ 23 ° C) a menos que indicado de outra forma.
1. Fabricação de Silicon Mestre
- Pastilha de silício Limpe com etanol ou xileno e seco de 100% em O 2 / N 2 gás.
- Coloque bolacha de silício em spin-coater a velocidades de rotação de 2.000-4.000 rpm para produzir um filme de espessura de 0,3-0,5 um.
- Padrão do filme foto-resistente com as dimensões correctas, usando um sistema de fotolitografia
- Totalmente mergulhar as pastilhas de silício revestido de fotossensíveis estampados em um volume adequado de solução photoresist desenvolvimento.
- Lavar as lâminas de silício revestido de fotossensíveis desenvolvidos com água deionizada.
- Para formar matrizes de sub-mícron cumes escala com perto de paredes laterais verticais, profundo etch iônica reativa o silício exposto usando um sistema de ataque.
- Remover o fotorresistente remanescente colocando a bolacha de silício em um sistema de incinerador do plasma.
- Corte o silício wAfers com um cortador em mestres de silício dimensionadas adequadamente com ponta de diamante para moldagem réplica posterior.
2. Fabricação de PUA molde de silicone Mestre
Nota: O volume a ser adicionado ao mestre de silício para nanofabrication irá variar, dependendo da área do mestre nanopatterned a ser replicado como também a viscosidade da solução (PUA) acrilato de poliuretano.
- Limpe a superfície mestre de silício com 100% de etanol ou xileno e seco sob O 2 / N 2 gás.
- Coloque padrão mestre de silício lado em uma placa de Petri.
- Para um mestre de silício com de 2 cm x 2 cm da superfície do teste padrão, pipeta 40 ul de PUA para a superfície do padrão.
- Colocar uma folha de 4 cm x 4 cm transparente de poliéster (PET) de película sobre o PUA dispensado.
- Pressione para baixo sobre a folha de PET e espalhar o PUA debaixo da folha em toda a face padrão, usando um rolo ou de superfície plana com arestas (tal como uma placa), de modo que a totalidadepadrão é coberto pelo pré-polímero PUA.
- Coloque mestre de silício, pré-polímero, e PET aproximadamente 10 cm abaixo de uma luz de 20 watts (115 V) UV (λ = 365 nm) por 50 segundos. Para ser eficaz, o comprimento de onda de luz ultravioleta pode ser em qualquer lugar entre 310-400 nm. A intensidade da luz é de 10-15 mW / cm 2, na superfície do substrato.
- Após a cura, remova filme PET lentamente com uma pinça. PUA deve anexar ao filme PET com uma negativa do mestre nanopattern silício.
- Cure nanopatterns PUA / PET sob UV, durante pelo menos 12 horas antes de usar. Superexposição não é um problema.
- Para limpar mestres de silício, coloque outro filme de PET em cima do mestre, sem a adição de PUA e expor à luz UV (λ = 365 nm) por 50 segundos e retire películas PET. Isto irá remover todos os monômeros não reagidos.
- Enxágüe mestre de silício com 100% de etanol ou xileno e seco sob O 2 / N 2 gás.
3-A. Microusinagem poliuretano Polímero
3b. Microusinagem Poli (láctido-co-glicólido) Hidrogel
- Criar um molde PDMS plana por vigorosa mistura silicone base de elastômero de silicone e agente de cura de elastômero em uma proporção de 10:1.
- Despeje PDMS mistos solução precursora em uma placa de Petri de modo a que o precursor de PDMS atingir 5 mm até a borda do prato (isto é, de modo que o PDMS tem 5 mm de espessura).
- Colocar uma placa de Petri e PDMS precursor num exsicador durante 1 hora para desgaseificar.
- Mover uma placa de Petri e PDMS precursor num forno a 65 ° C durante pelo menos 2 horas para curar.
- Depois de PDMS é curado, use uma navalha para cortar os PDMS planas em três centímetros x 3 cm seções quadrados. Estes serão os PDMS planas moldes utilizados mais tarde no processo de modelação.
- Limpo 25 mm de diâmetro lâminas de vidro circular por plrastreio em álcool isopropílico, durante 30 min num sonicador de água.
- Lâminas de vidro limpo a seco com menos de O 2 / N 2 gás.
- Gota dispensar 100 ul de uma solução de PLGA (15% w / v de PLGA em clorofórmio) na lâmina de vidro.
- Coloque um molde PDMS plana no topo do PLGA dispensado para absorver o solvente e obter uma superfície plana de PLGA. Aplicar uma ligeira pressão (~ 10 kPa), colocando um peso de 200 g na parte superior do PDMS de 5 min.
- Lentamente descascar molde PDMS plana e colocar a tampa de vidro sobre um prato pré-aquecido (120 ° C) durante 5 minutos para remover o solvente residual e aumentar a aderência entre o PLGA e o vidro de cobertura.
- Coloque o molde NP PUA no topo do PLGA plana e aplicar pressão constante (~ 100 kPa) e de calor (120 ° C) colocando um peso de 1 kg, em cima do molde de PUA, enquanto na placa de aquecimento durante 15 min.
- Remover o peso de PLGA a tampa deslizante e permitir que o substrato arrefecer até à temperatura ambiente. Não retire o molde PUA até os substratos foramarrefecida.
- Uma vez que os substratos tenham esfriado o suficiente, cuidadosamente descascar o molde NP PUA, revelando o substrato NP PLGA. O substrato NP PLGA deve ter uma aparência iridescente.
- Coloque amostras terminados em dessecador para o armazenamento durante o tempo que um mês.
4. Sementeira e Cultura de Células
NOTA: Este protocolo descreve a cultura de miócitos ventriculares de rato neonatal (NRVMs) e derivados de células humanas cardiomiócitos H7 estaminais embrionárias (hESC-MC), mas outras fontes de células podem ser utilizados.
- Anexar as lamelas ANFS (PU ou PLGA) para de 35 mm de cultura de tecidos de poliestireno prato. Pipetar 20 l de Norland Optical Adhesive (NOA83H) para o fundo do prato e colocar suavemente a lamela ANFS no topo da NOA. Permitir cola para se espalhar e cobrir todo fundo lamela. Cure NOA expondo prato a UV por 10 min.
- Esterilizar ANFS lavando com 2 ml de solução aquosa de etanol a 70% durante 5 min, duas vezes. Remover eThanol por aspiração. Permitir ANFS para secar completamente ar por ~ 1 hora sob a esterilização lâmpada UV (λ = 200-290 nm) na cabine de segurança biológica.
- Adesão celular é aumentada por revestimento do ANFS em fibronectina durante a noite. Dilui-se a fibronectina em água Dl a 5 ug / ml. Pipetar 2 ml da solução de fibronectina no prato. Colocar na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 durante a noite (pelo menos 6 horas).
- Obter NRVMs, hESC-CMs, ou outras células cardíacas de juros de acordo com os protocolos anteriores 22.
- Centrífuga amostra de células a 1000 rpm durante 3 min para sedimentar as células.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento.
- Ressuspender as células em meio de cultura adequado a uma concentração de 4,6 x 10 6 células / ml.
- Pipetar cuidadosamente 200 mL de suspensão de células para ANFS esterilizados. Certifique-se de suspensão de células permanece na lamela.
- Colocar as células em estufa a 37 ° C e 5%CO 2 para 4 horas para permitir que as células para anexar ao ANFS.
- Adicionar 2 ml de meio de cultura quente para prato e substituir as células em estufa nas mesmas condições.
- Após 24 h, retirar o suporte e lava-se com 2 mL de DPBS duas vezes para remover o excesso de células.
- Adicionar 2 ml de meio de cultura quente para prato e substituir as células em estufa nas mesmas condições. Cultura as células a confluência. Substituir mídia todos os dias.
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Representative Results
A Figura 1 é uma vista geral esquemática do processo de produção para os dois métodos de fabrico. Devido à difracção da luz causada pela topografia nanoescala, microusinagem deve resultar numa superfície iridescente ao ANFS. Figura 2 representa essa superfície iridescente num bem modelado 25 milímetros NP-PU lamela (Figura 2A) com rebordo 800 nm e ranhura largura (Figura 2B). A aparência iridescente do ANFS vai variar um pouco dependendo do cume e sulco larguras.
Após sementeira das células sobre o ANFS, as células começam a alinhar na direcção paralela com os cumes do substrato. O alinhamento deve tornar-se evidente nas primeiras 24 horas após a semeadura e deve permanecer para a totalidade do período de cultivo. Figura 3 mostra imagens representativas de campo brilhantes de NRVMs após 7 dias de cultura e hESC-CMs após 48 horas de cultura. NRVMs umnd hESC-CMs nas superfícies NP mostram anisotropia estrutural óbvia e alinhamento (Figuras 3B e 3D), enquanto que os cardiomiócitos em superfícies unpatterned são orientadas aleatoriamente (figuras 3A e 3C). Análise imunohistoquímica destaca o impacto da nanotopografia no alinhamento do citoesqueleto celular. Filamentos de actina (actina F) e actinina sarcomérica-α em células cultivadas sobre as ANFS ficam alinhadas ao longo das nano-sulcos, mas permanecem distribuídas aleatoriamente em células sobre substratos unpatterned (Figura 4). Células cardíacas apresentam surra espontânea após 24-48 horas de cultura.
Figura 1. Nanofabricação esquemático - diagrama do proc dois nanofabricaçãosos. (B - D) Depict UV-assistida força capilar litografia (CFL), enquanto que (E - H) retratam CFL mediada por solvente. (A) PUA negativa é feita a partir de um mestre de silício. (B) PU pré-polímero é em uma lâmina de vidro e o molde PUA dispensado-gota é colocada em cima. (C) A PUA molde e PU lamela são então expostas a luz UV para curar a PU. Solução de polímero (E) é de PLGA em uma lâmina de vidro dispensado-gota e um molde PDMS plana é utilizada para criar uma superfície plana de PLGA. (F) Um molde PUA é colocado no topo do PLGA plana e (G) de calor e de pressão constante é aplicado a quente para gravar o NP no PLGA. (D, H) Depois de descascar o molde PUA, um substrato NP-PU ou PLGA é deixado para trás. Células cardíacas podem ser semeados em esta superfície NP para criar matrizes de células alinhadas.
Substrato Figura 2. NP-PU. (A) Fotografia do NP superfície grande área. A aparência iridiscente da lamela é causada pela nanotopografia. (B) Imagem SEM da secção transversal da nanotopografia subjacente.
Figura 3. Cardiomiócitos alinhadas. 10X imagens de campo brilhante da NRVMs após 7 dias de cultura (A, B) e células estaminais embrionárias humanas-CMs após 2 dias de cultura (C, D). NRVMs cultivadas em substratos NP-PU (B) exibem alinhamento estrutural óbvio enquanto NRVMs em substratos PU plana (A) são aleatoriamente alinhado. As setas em (B) e (D) indica o sentido de NP anisotropia. Barra de escala = 100 pm.
.. Figura 4 imunofluorescência confocal imagens de células alinhamento e estrias do citoesqueleto; actinin α-sarcomérica (vermelho), núcleos de células (azul), e F-actina (verde). As células cultivadas em substratos NP ter alinhado actinin sarcomérica-α e fibras F-actina, enquanto as células cultivadas em substratos planos têm orientado aleatoriamente fibras. Inserção no canal actinin sarcomérica-α vermelho mostram claramente sarcômeros estriados.
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Discussion
Tecidos cardíacos funcionalmente maduros faltam para tanto in vivo e in vitro em aplicações de engenharia de tecido cardíaco. Os métodos de nanofabricação CFL aqui descritas são técnicas robustas para alcançar o alinhamento celular e influenciando a função do tecido macroscópico devido à escalabilidade do sistema. Grandes áreas podem ser facilmente modelado e usado para a cultura de células. Alinhamento celular macroscópica é essencial em engenharia de tecido cardíaco, a fim de criar biomimético, tecido funcional, pois influencia tanto as propriedades mecânicas e elétricas do miocárdio 38.
Os métodos aqui pode ser aplicado a uma ampla gama de aplicações no âmbito da engenharia de tecido cardíaco. Já foi demonstrado que as pistas em nanoescala ajudar a criar um nicho de células-tronco cardíacas e promover a regeneração 14. Assim, através da utilização de polímeros biodegradáveis como o PLGA, "patches" nanopatterned poderia ser feito para promovercicatrização após insulto cardíaco. Em alternativa, utilizando os hidrogéis com módulos elásticos semelhantes como o coração nativo, interacções cardiomiócitos-ECM pode ser estudado num sistema simplificado, reprodutível.
Vários outros métodos, tais como a impressão microcontact, electrospinning, e microtopografia, foram previamente utilizados para controlar a estrutura do tecido cardíaco de engenharia em microescala 39-41. Embora estas técnicas têm sido bem sucedidos na obtenção de alinhamento celular, é provável que a estrutura e função do tecido cardíaco in vivo é regulada pelos muito pequenos, pistas nanotopographical do ECM e, assim, o nosso substrato NP deve revelar-se vantajoso. Além disso, essas técnicas de padronização microescala tem desvantagens inerentes em relação aos nossos substratos anisotropicamente nanofabricated. Por exemplo, o nosso método de microusinagem é mais rentável e controlável do que eletrofiação. Microcontact impressão, por outro lado, rels em células que aderiram ao faixas específicas para ganhar anisotropia estrutural. A fim de criar uma monocamada funcional, as células devem então ou proliferar ou migrar para fora destas faixas, para formar junções apertadas. Isto é muito mais difícil para as células com pouca ou nenhuma capacidade de proliferação, tais como os cardiomiócitos neonatais. Microtopografias também está limitada pela incapacidade para criar as monocamadas de células fortemente acopladas. Devido à escala das células em comparação com a microtopografia, as células residem em cima ou dentro das micropregas. Isto limita a quantidade de interacção célula-célula e diminui o acoplamento célula-célula. Com o nosso método, as células tornam-se alinhados através da topografia nano-escala de inspiração biológica e pode interagir livremente com as células vizinhas como os tamanhos recurso são pelo menos uma ordem de magnitude menor do que as próprias células. Isto permite uma maior biomimético, fortemente acoplados células monocamadas a ser criado.
Para obter melhores resultados com a NP-PU sugerimos seguindo o getapas de pré-tratamento lamela moça. Estas etapas vão aumentar a aderência do polímero à superfície do vidro. Isto não só ajuda na remoção limpa do mestre PUA durante a fabricação, mas também evitar que o polímero modelada se desprendam do vidro durante os experimentos. Para testar a eficácia dos passos de pré-tratamento, colocar um substrato NP-PU em água e observar se o polímero permanece colada ao vidro.
PLGA é um co-polímero de ácido glicólico e ácido láctico, que foi desenvolvido para ambos dispositivo e entrega de drogas in vivo. Assim, este substrato é um bom ECM, biocompatível para as células. A rigidez de PLGA pode ser modulada por qualquer ajuste da proporção de ácido glicólico para ácido láctico ou alterando a contracção de PLGA em clorofórmio.
Vários parâmetros podem ser facilmente variada e ajustada neste sistema para otimização ou fins de investigação. Vários polímeros à base de PU estão disponíveis com uma variedade depropriedades mecânicas. Assim, através da utilização de diferentes pré-polímeros de PU, vários factores de rigidez do substrato pode ser fabricado com o mesmo protocolo. O utilizador também pode alterar a topografia do substrato. O nanotopografia do substrato depende da concepção do mestre de silício. Portanto, uma variedade de cume e groove larguras, bem como várias geometrias, pode ser modelada, alterando o design mestre de silício para atender às especificações.
O tamanho dos nano-cumes também influenciar o comportamento de tecidos e de células. Menores larguras de ranhura permite menor penetração celular nas ranhuras e limitar a interação da célula com o nanotopografia engenharia 2. Isto por sua vez irá alterar a extensão do comportamento anisotrópico da monocamada de células cardíacas. Além disso, o protocolo apresentado está limitado a duas dimensões (2D) de cultura de células e de alinhamento. Obviamente, para ser verdadeiramente biomimético, tecido cardíaco engenharia teriam de ser 3D. O trabalho futuro é necessário para designing denso e alinhado functional3D tecido cardíaco. O protocolo aqui apresentado, no entanto, oferece um controlo superior da morfologia das células cardíacas e permite o controlo da função do tecido cardíaco macroscópica com base em sinais de nanoescala.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25 mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500 g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
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