Summary
بروتوكول للتصوير حي للبروتينات GFP الموسومة أو هياكل autofluorescent في الفردية
Abstract
تم تأسيس بويضة ذبابة الفاكهة كنظام تنوعا للتحقيق في أسئلة أساسية مثل وظيفة هيكل الخلية، وتنظيم الخلية، وبناء عضية وظيفة. توافر مختلف البروتينات GFP الموسومة يعني أنه يمكن رصد العديد من العمليات الخلوية في الخلايا الحية على مدى دقائق أو ساعات، وباستخدام هذه التقنية، وقد وصفت عمليات مثل نقل RNP، التشكل الظهارية، وإعادة عرض الأنسجة بقدر كبير من التفصيل في ذبابة الفاكهة 1،2 البويضات.
القدرة على أداء التصوير الفيديو جنبا إلى جنب مع ذخيرة غنية من المسوخ يسمح للفحص مجموعة متنوعة هائلة من الجينات والعمليات بالتفصيل لا يصدق. أحد الأمثلة على ذلك هو عملية تدفق ooplasmic، الذي يبدأ في منتصف oogenesis 3،4. هذه الحركة قوية من الحويصلات السيتوبلازمية هو أنيبيب و 5 كينيسين التي تعتمد على أنظمة ويوفر مفيدةتيم للتحقيق وظيفة الهيكل الخلوي في هذه المراحل.
هنا أقدم على بروتوكول للتصوير الفاصل الزمني من البويضات الحية باستخدام تقريبا أي الإعداد المجهري متحد البؤر.
Protocol
1. إعداد الذباب لتشريح
- تخدير الذباب صحية من النمط الجيني المطلوب (على سبيل المثال، معربا عن بروتين GFP المسمى-) التي هي أقل من أسبوع واحد من العمر. حدد 10-15 الإناث بطون كبيرة مع كريم اللون مدورة.
- نقل الذباب المحددة وعدد قليل من الذكور (3-5) لقارورة تحتوي على المواد الغذائية الجديدة yeasted طفيفة والسماح للذباب لتسمين لمدة يومين في C. ° 25 الرجوع إلى ويل وآخرون .. 6 للاطلاع على تفاصيل إعداد ذبابة الفاكهة. تسمين الذباب يضمن مجموعة متنوعة من المراحل، مراحل خاصة 8-12، سوف تكون متاحة للتصوير. مسمن ضعيف أو unfattened الذباب عادة ما تحتوي على مراحل فقط في وقت مبكر جدا (1-6) وناضجة البويضات (المرحلة 14).
2. إعداد البويضات للتصوير باستخدام المجهر المركب منتصبة
- إعداد شريحة زجاجية المعيار لصق 2 coverslips إلى الشريحة، ما يقرب من 1 سم بعيدا، وذلك باستخدام السيليكون greasه. فقط استخدام الشحوم كافية لضمان ختم جيدة بين ساترة والشرائح. والضغط لأسفل بشدة على كل ساترة انتشار الشحوم رقيقة وبالتساوي. إضافة بعض النفط الهالوكربون 27 (سيغما) إلى المرحلة بين coverslips والشرائح. فإنها تكون بمثابة الفواصل لمنع إصابة البويضات المعزولة في الخطوات اللاحقة. رقم 1،5 coverslips تعمل بشكل جيد، مع سمك المتوسط (0،16-0،18 مم) أن يطابق من البويضات مرحلة متأخرة.
- مكان 2-3 قطرات من زيت الهالوكربون 27 على سطح ساترة 22 2 مم. للحصول على صحة البويضات ممكن، وتتم إزالة أنثى الفرد من الغذاء باستخدام القارورة pipetting الفم بلطف وأودعت في الهالوكربون النفط دون التخدير الأولى.
- باستخدام ملقط تشريح حادة (مثل دومون # 5)، دبوس الطاير ضد ساترة وسحب قبالة غيض من البطن. إزالة المبايض عن طريق سحبها على طول سطح ساترة، في إطار برنامج النفط. وسيعزز هذا الالتصاقةن من البويضات إلى ساترة.
- ندف بلطف بعيدا المبيضين، وتبحث عن البويضات التي هي على الأقل 10B مرحلة oogenesis. ويمكن تحديد البويضات في هذه المرحلة من خلال البحث عن البيض في الغرف التي تحتل البويضة على الأقل 50-60٪ من الحجم الكلي للغرفة البيض. في هذه المرحلة من oogenesis، أصبحت خلايا بصيلات تغمر البويضة عمودي، وتحيط البويضة من جميع الجهات باستثناء منطقة صغيرة حيث الاتصالات إلى خلايا ممرضة لا تزال قائمة. استخدام ملقط لإزالة البويضات الفردية من غمد ovariole.
- المضي قدما، وذلك باستخدام الإناث 1-3، إلى أن يتم عزل البويضات غير التالفة 5-8 على ساترة. إزالة أي نوع من الأنسجة غير صالحة للاستعمال.
- عكس بعناية تحتوي على البويضات ساترة على الشريحة معدة سلفا بحيث يتم وضع البويضات بين الفواصل اثنين. لا تضغط لأسفل على ساترة مقلوب لأن ذلك سوف يضر البويضات. إذا لزم الأمر، إضافة كمية صغيرة من النفط الهالوكربون لريتم تعبئة انه حواف "ساندويتش" لضمان الفضاء. (اختياري: اسمحوا بقية الشرائح لعدة دقائق للسماح لتسوية من ساترة) الشريحة الآن جاهزة للتصوير.
3. إعداد البويضات للتصوير باستخدام المجهر المركب مقلوب
- وتشريح البويضات أساسا كما هو موضح في القسم 2، إلا أن أطباق بتري صغيرة مع كوب إدراج أسفل (ماتيك، 35 مم) وتستخدم بدلا من coverslips. ومن غير الضروري لتغطية العينة، وبعد تشريح، ولا يمكن تصوير الأنسجة مباشرة في أطباق، ولكن يجب توخي الحذر لضمان البويضات تبقى مغطاة بالنفط والتي لا يسمح لتجف.
4. يعيش التصوير
- وضع بويضة في التركيز باستخدام DIC أو العكس المرحلة البصريات ودراسة البويضة عن أي علامات للتلف، مثل تسريب السيتوبلازم، أو انتفاخ الخلايا المسام. البويضات التي تظهر الصورة فقط صحية وغير التالفة.
- Streaيمكن رصدها مينغ مباشرة دون الحاجة إلى وضع العلامات GFP، منذ الحويصلات صفار في السيتوبلازم هي autofluorescent 7. يمكن التقاط هذه الإشارات في النطاق FITC نطاق ولكن سوف يتطلب على الأرجح أعلى أرباح الإعدادات من تلك التي تستخدم لبروتينات GFP-المسمى.
- يتم الحصول على صور لافضل المتدفقة من أقسام البصرية التي هي أسفل سطح البويضة التي يستريح على الزجاج ساترة / بتري الزجاج. هنا قليلا بالارض البويضة، مما يجعل لأفضل طائرة من التركيز. يمكن التقاط الصور في 200X - 1،000 X. باستخدام ترتيب الموصوفة هنا، يجب استخدام الأهداف الجوية، منذ ساترة يشكل حاجزا بين البويضة وموضوعية. هذا هو الأمثل لأنه يقلل إلى حد كبير الانجراف وحركة العينة.
- مرة واحدة في المنطقة ذات الاهتمام هو في التركيز، إيقاف البصريات brighfield والتحول إلى التصوير مبائر. مسح سريع باستخدام / معاينة ظيفة البرنامج، وضبط التركيز واكتسابحسب الضرورة.
- سوف الإعدادات لالتقاط تختلف من المجهر المجهر ل، ولكن المعلمات العام هي كما يلي: استخدام الطول الموجي الإثارة من 488 نانومتر ~ والطول الموجي 515 نانومتر انبعاث ~. انشاء Z-المحور التقاط بحيث Z-المحور لا تزال مستمرة، مع وجود فارق 10 ثانية من بين الإطارات. التقاط سلسلة من إطارات 5-10 اختبار لضمان بويضة غير ثابتة والطائرة من التركيز المناسب.
- وهناك تسلسل نموذجي الفاصل الزمني التقاط بين 20 - 50 لقطة، ويمكن استعراض فور الانتهاء من تقييم جودة الفيديو. ويمكن تكرار هذه العملية للخلايا الأخرى في الشريحة، أو يمكن تشريح الإناث إضافية حسب الحاجة.
5. استكشاف الأخطاء وإصلاحها والمشاكل الشائعة
- الانجراف - عند استخدام المجهر تستقيم، وخلايا يمكن الانجراف في بعض الأحيان بسبب انتشار النفط. يمكن التقليل من ذلك عن طريق استخدام النفط ما يكفي فقط لتغطية المنطقة تحت ساترة. إذا استمرت المشكلة، استخدام كميات أقل من السيليكون زrease ليضعوا على الفواصل الشريحة.
ملاحظة: بعض حزم البرمجيات مبائر يسمح لتتبع الخلايا، ولكن بشكل عام فإنه من الأفضل أن تتخلى عن التصوير من البويضات الانجراف وبدلا من ذلك استخدام آخر عينة.
- لا توجد مؤشرات على تدفق - إذا يتدفقون ليس واضحا، فمن المرجح عائدا لأحد هذه الأسباب اثنين، إما الطائرة الاتصال لالتقاط الصور ليست صحيحة (عادة عميقة جدا في المناطق الداخلية من بويضة) أو معطوب البويضة. يمكن تقليل الوقت والممارسة على حد سواء أخطاء.
Representative Results
والتصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP تختلف تبعا لمدى قوة التعبير عن البروتين الموسومة. A البويضة منتصف مرحلة التعبير عن reticulon مثل 1 (Rtnl-1)، اكسون ذات الكلمات الدلالية مع GFP 8،9 تنتج إشارة قوية. Rtnl-1 يبدو أن شارك في تعريب مع ميكروتثبول طويلة حاضرا أثناء الجري ooplasmic 10 (الشكل 1A). Rtnl-1 هو علامة جيدة لمراقبة التدفق وأيضا مؤشرا على تنظيم أنيبيب في البويضات مرحلة متأخرة.
تدفق Ooplasmic في غرفة البيض wildtype هو واضح وملحوظ من حركة الحويصلات صفار autofluorescent عند استخدام معدل القبض على إطار واحد كل 10 ثانية (1B الشكل). يمكن إنشاء الإسقاط أقصاها خمس إطارات للاحتفال طريق الحويصلات متحرك.
الشكل 1. يعيش كل من التصوير autoflوGFP الموسومة uorescent هياكل. A) A واحد الوقت الفاصل بين صورة بويضة 11 مرحلة التعبير عن GFP Rtnl1-400X في. Rtnl1-GFP الألياف تتحرك مع حركة متموجة في البويضات الدفق. B) كحد أقصى 5 الإطار إسقاط بيضة غرفة 10B المرحلة التي تم فيها تصوير للحويصلات autofluorescent صفار كل ثانية 10 لإجمالي ثانية 50، في التكبير 400X. شريط النطاق = 30 ميكرومتر
Discussion
ذبابة الفاكهة هي البويضات نظام نموذجي تنوعا لمعالجة مجموعة متنوعة من المسائل المتصلة الدالة وتنظيم الخلايا والمكونات التحت خلوية. A فهم كامل وظيفة البروتين يتطلب رصد كل الجوانب المكانية والزمانية للسلوك البروتين. التقدم في كل من نظم التصوير والأدوات الجينية المتاحة لDrosophilists تجعل من الممكن للمختبرات حتى الصغيرة لأداء عالية الجودة في التصوير التجارب البويضات المعيشة. هنا أتناول بروتوكول لتحليل سلوك البروتينات GFP الموسومة أو autofluorescent والهياكل خلال منتصف إلى أواخر oogenesis التي يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع مجموعة متنوعة من الخلفيات الوراثية للتحقيق وظيفة البروتين.
في هذا البروتوكول أصف العملية التي يتم إعداد البويضات للتصوير والإعدادات الأساسية التي ستمكن مبائر الحصول على الفيديو الفاصل الزمني من البروتينات الفلورية والهياكل. التفصيل إضافيةويرد وصف ليرة سورية على إعداد البويضة بواسطة ويل وآخرون. 6 A مجموعة واسعة من سلالات ذبابة معربا عن البروتينات التي تم وسمها التطور الطبيعي عبر محاصرة-اكسون تتوفر 8، ويمكن تصميم المتغيرات البروتين أكثر بلا حدود ويعيد إلى الذباب.
في العمل مع الأنسجة الحية، وصحة العينات له أهمية قصوى. يمكن البيض من غرف 10B مرحلة استكمال oogenesis بطريقة مستقلة أساسا 11، مما يجعلها مثالية للدراسات قصيرة الأجل التصوير. يجب توخي الحذر في الخطوات الرئيسية عدة للحصول على بيانات ذات جودة عالية. خلال تشريح أنه من المهم لمعالجة المبيضين البويضات وأقل قدر ممكن، والحد من مقدار الوقت بين تشريح والانتهاء من التصوير. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون موجودا محطة تشريح صغيرة في نفس الغرفة التي تضم نطاق مبائر، وينبغي تصوير فقط غرف البيض قليلة في كل مرة. عدد الموصى بها هنا (5-8) يضمن أن يتم تصغير الوقت تشريح مع تعظيم احتمال الحصول على صور ذات جودة جيدة. أوصي التقاط سلسلة من الصور قصيرة لتقييم جودة الصورة والتأكد من أن يتم تحسين إعدادات الالتقاط، قبل التقاط مرور وقت أطول تسلسل. معظم البرامج تسمح ليتم حفظها الإطارات الفردية، ويمكن بعد ذلك يتم تحليل هذه الصور في مجموعة متنوعة من الطرق باستخدام يماغيج 12 أو البرامج الأخرى.
Disclosures
ليس لدي ما تكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل منحة من برنامج GM096076 AREA NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |
References
- Becalska, A. N., Gavis, E. R. Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis. Dev. 136, 2493-2503 (2009).
- He, L., Wang, X., Montell, D. J. Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development. Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).
- King, R. C. Ovarian development Drosophila melanogaster. , Academic Press. New York. (1970).
- Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).
- Serbus, L. R., Cha, B. -J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes. Dev. 132, 3743-3752 (2005).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging. J. Vis. Exp. (60), e3679 (2012).
- Theurkauf, W. E. Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes. Science. 265, 2093-2096 (1998).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. PNAS. 98, 15050-15055 (2001).
- Röper, K. Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components. J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).
- Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations. Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).
- Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium. Wilhelm Roux's Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).
- ImageJ [Internet]. , Available from: http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html (2013).
