Summary
हम इमेजिंग विधि बैक्टीरियल FtsZ - अंगूठी, कोशिका विभाजन के लिए एक अनिवार्य उपकरण के संरचनात्मक संगठन की जांच के लिए एक सुपर संकल्प का वर्णन करने के लिए. इस विधि photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) छवियों की मात्रात्मक विश्लेषण पर आधारित है और अन्य जीवाणु cytoskeletal प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है.
Abstract
बैक्टीरियल कोशिका विभाजन 1,2 midcell में अधिक से अधिक दस आवश्यक प्रोटीन के समन्वित विधानसभा की आवश्यकता है. इस प्रक्रिया के लिए केंद्रीय विभाजन योजना 3,4 पर FtsZ प्रोटीन के द्वारा एक suprastructure अंगूठी की तरह (Z-अंगूठी) का गठन है. Z अंगूठी कई एकल असहाय FtsZ protofilaments के होते हैं, और Z रिंग के अंदर protofilaments की व्यवस्था को समझने Z-अंगूठी और एक बल 5,6 जनरेटर के रूप में अपना कार्य विधानसभा के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा. यह जानकारी मायावी पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में वर्तमान सीमाओं के कारण बनी हुई है. पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रकाश के विवर्तन सीमा (~ 200 एनएम) के कारण जेड अंगूठी की एक उच्च संकल्प छवि प्रदान करने में असमर्थ है. इलेक्ट्रॉन cryotomographic इमेजिंग छोटी सी में पाया है FtsZ protofilaments बिखरे हुए crescentus 7 कोशिकाओं, लेकिन इस तरह के रूप में बड़ा कोशिकाओं को लागू करने के लिए मुश्किल हैई. कोलाई या बी. subtilis. यहाँ हम एक सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विधि के आवेदन का वर्णन, Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम), मात्रात्मक ई. के संरचनात्मक संगठन विशेषताएँ 8 Z-अंगूठी कोलाई.
पाम इमेजिंग दोनों उच्च स्थानिक संकल्प (~ 35 एनएम) और विशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन की स्पष्ट पहचान सक्षम लेबलिंग प्रदान करता है. हम photoactivatable फ्लोरोसेंट प्रोटीन mEos2, जो हरी प्रतिदीप्ति (उत्तेजना = 488 एनएम) से 405 एनएम पर 9 सक्रियण पर लाल प्रतिदीप्ति (= 561 एनएम उत्तेजना) स्विच के साथ FtsZ लेबल. एक ताड़ के प्रयोग के दौरान, एकल FtsZ mEos2 अणुओं stochastically सक्रिय कर रहे हैं और इसी एकल अणुओं के केन्द्रक पदों <20 एनएम परिशुद्धता के साथ निर्धारित कर रहे हैं. सुपर संकल्प Z अंगूठी की छवि को तो सब पता लगाया FtsZ mEos2 अणुओं के केन्द्रक पदों superimposing द्वारा खंगाला है.
<पी वर्ग = "jove_content"> इस पद्धति का उपयोग करके, हमने पाया है कि जेड अंगूठी ~ 100 एनएम के एक निश्चित चौड़ाई है और तीन आयामों में एक दूसरे के साथ ओवरलैप FtsZ protofilaments का एक ढीला बंडल बना. इन आंकड़ों Z-अंगूठी 10 के सेल चक्र निर्भर परिवर्तन के आगे की जांच के लिए एक मंच प्रदान करते हैं और ब्याज की अन्य प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है.Protocol
1. नमूना तैयार
- JB281 तनाव की एक कॉलोनी के साथ लेग मीडिया टीका लगाना [BW25113 / pJB042 (पी Lac: FtsZ mEos2)]. एक प्रकार के बरतन में रात 37 पर आगे बढ़ें ° सी.
- M9 में 1:1,000 संस्कृति + न्यूनतम मीडिया [M9 साल्ट, 0.4% ग्लूकोज, 2 मिमी MgSO 4, 0.1 मिमी 2 CACL, सदस्य एमिनो एसिड और विटामिन] पतला और मध्य लॉग चरण (600 = आयुध डिपो 0.2-0.3) विकसित करने के लिए कमरे के तापमान (आर टी) पर chloramphenicol (150 / छ मिलीलीटर) की उपस्थिति में.
- 20 सुक्ष्ममापी 2 घंटे के लिए IPTG (ध्यान दें # 1 देखें) के साथ संस्कृति प्रेरित.
- Microcentrifuge (8000 rpm, 1 मिनट) में गोली संस्कृति और + M9 के एक बराबर मात्रा में resuspend, दोहराने. 2 resuspension बाद, आरटी में 2 घंटे के लिए वृद्धि जारी है.
- पीबीएस में 4% paraformaldehyde (= पीएच 7.4) आरटी पर 40 मिनट के लिए के साथ प्रेरित संस्कृति को ठीक करें. गोली संस्कृति और पीबीएस के एक बराबर मात्रा में resuspend, दोहराएँ. इमेजिंग जीवित कोशिकाओं यदि बराबर मात्रा के साथ निर्धारण, गोली, संस्कृति, और resuspend छोड़M9 [M9 साल्ट, 0.4% ग्लूकोज, 2 मिमी MgSO 4, 0.1 मिमी CACL 2, सदस्य एमिनो एसिड]; दोहराने.
- सोने resuspended संस्कृति के साथ 1:10 मोती पतला. तैयार इमेजिंग चैम्बर के लिए नमूना लागू (2.4 कदम देखें).
[1] नोट: ऊपर प्रेरण प्रोटोकॉल (1.1-1.3 कदम) JB281 तनाव की अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए अनुकूलित किया गया है. विस्तृत प्रेरण शर्तों अभिव्यक्ति हित के अन्य सिस्टम या प्रोटीन के लिए भिन्न हो सकते हैं.
2. इमेजिंग चैंबर के विधानसभा
- एक 3% (w / v) M9 में agarose समाधान करें. एक पीठ टॉप गर्मी ब्लॉक में 70 में 40min के लिए agarose ° सी पिगलो. स्टोर में 5 घंटे तक के लिए 50 डिग्री सेल्सियस agarose पिघल गए.
- नीचे का सामना करना पड़ रहा है इलेक्ट्रोड के साथ इमेजिंग चैम्बर के ऊपरी हिस्से में एक स्वच्छ microaqueduct स्लाइड रखें. Microaqueduct स्लाइड पर कम गैसकेट पंक्ति के रूप में तो छिड़काव चैनलों को कवर करने के लिए.
- कांच के केंद्र के लिए लागू ~ पिघल agarose के 50 μlस्लाइड. एक साफ, सूखे coverslip साथ तुरंत ऊपर agarose जेल बूँद. जेल आरटी पर 30 मिनट के लिए जमना करने की अनुमति दें.
- Coverslips साफ करने के लिए एक चीनी मिट्टी धारक में coverslips की व्यवस्था और एसीटोन, इथेनॉल, और कांच के जार में 1M KOH के घूर्णन स्नान में 20 मिनट के लिए sonicate. चक्र तीन बार दोहराएँ, 9 sonications के एक कुल के लिए, DH 2 ओ में एक एकल sonication द्वारा पीछा ताजा DH 2 ओ में साफ coverslips स्टोर उपयोग करने के लिए पहले, फ़िल्टर्ड हवा के साथ सूखी coverslips झटका.
- ध्यान coverslip हटाने microaqueduct स्लाइड पर जेल पैड छोड़ने. तुरंत जेल पैड के शीर्ष सेल संस्कृति के नमूने के 1 μl (1.6 कदम देखें) जोड़ने. ~ 2 मिनट के लिए रुको, समाधान जेल पैड द्वारा अवशोषित करने के लिए अनुमति देता है. एक नया साफ, सूखे coverslip के साथ शीर्ष जेल पैड. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पूरे इमेजिंग कक्ष इकट्ठे.
3. छवि अधिग्रहण
- माइक्रोस्कोप, कैमरा, और लेसरों पर मुड़ें. Metamorph नरम खोलेंवेयर (आणविक उपकरणों).
- इमेजिंग रास्ते में उपयुक्त / उत्तेजना उत्सर्जन फिल्टर (1 चित्रा) रखें.
- लेजर शक्ति और अधिग्रहण सेटिंग्स के अनुसार निर्धारित हैं.
- 488 एनएम लेजर है = 15 मेगावाट (# नोट 2 देखें)
- 561 एनएम लेजर = 75 मेगावाट
- 405 एनएम लेजर = 2 ± तटस्थ घनत्व फिल्टर मेगावाट (# नोट 3 देखें)
- चरण में पूरक चरण एडाप्टर के माध्यम इमेजिंग कक्ष बंद.
- एक उपयुक्त इमेजिंग (100x100 पिक्सेल) क्षेत्र Designate कि homogenously सभी तीन लेसरों द्वारा प्रकाशित है.
- एक नमूना क्षेत्र है कि दोनों कोशिकाओं और करीब निकटता में मापकला मार्कर (सोने की माला), लेकिन नहीं अतिव्यापी हैं पहचानें.
- Coverslip करने के लिए करीब कोशिकाओं की सतह पर ध्यान दें. 50 ms एकीकरण समय के साथ एक brightfield छवि प्राप्त करने और ध्यान के नमूने में 0.5 सुक्ष्ममापी चाल (3Ai चित्रा).
- 488 n से उत्तेजना के साथ कलाकारों की टुकड़ी हरी प्रतिदीप्ति छवि मोल मीटर लेजर एक 50 ms एकीकरण समय (3Aii चित्रा) का इस्तेमाल करते हैं.
- 405 एनएम और 561 एनएम लेज़रों से निरंतर रोशनी के साथ लाल चैनल में वीडियो स्ट्रीमिंग मोल. निश्चित कोशिकाओं के लिए, एक 50 ms फ्रेम दर 405 एनएम लेजर ~ 10% से ramped हर 1,000 तख्ते शक्ति के साथ 20,000 फ्रेम (~ 17 मिनट कुल) के एक कुल (# 4 नोट देखें) के लिए प्रयोग किया जाता है. जीवित कोशिकाओं के लिए, एक 10 एमएस फ्रेम दर एक निरंतर लेजर 405-एनएम सत्ता में 3000 फ्रेम (~ 30 कुल) के एक कुल के लिए प्रयोग किया जाता है.
- ध्यान कोशिकाओं के निचले सतह के लिए वापस ले जाएँ और 3.7 चरण में के रूप में एक और brightfield छवि प्राप्त.
[2] नोट: एक सेल की हरी प्रतिदीप्ति का एकीकृत तीव्रता सीधे FtsZ mEos2 सेल में व्यक्त अणुओं की कुल संख्या के लिए आनुपातिक है. 488 एनएम उत्तेजना शक्ति और कलाकारों की टुकड़ी प्रतिदीप्ति अधिग्रहण सेटिंग्स सभी कोशिकाओं के लिए स्थिर रखा जाना चाहिए इतना है कि रिश्तेदार FtsZ mEos2 विभिन्न कक्षों में अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना में किया जा सकता है.
ontent "> [3] नोट: फिक्स्ड कोशिकाओं तटस्थ (एनडी) जगह में घनत्व फिल्टर (1 चित्र, ऑप्टिकल घटक 5) के साथ imaged क्रम में इतना है कि प्रत्येक व्यक्ति के अणु सही पहचाना जा सकता है एक धीमी सक्रियण दर हासिल जब इमेजिंग कोशिकाओं सक्रियण दर को बढ़ाने के लिए रहते हैं, जबकि दो अणुओं एक साथ एक विवर्तन सीमित क्षेत्र में सक्रिय होने के एक कम संभावना को बनाए रखने के लिए एन डी फिल्टर हटा दिया जाता है तेज दर जीना सेल इमेजिंग के लिए लागू है कुल अधिग्रहण के समय में कमी करने की जरूरत है, जिससे समय में Z-अंगूठी "ठंड" और सेल के लिए photodamage के प्रभाव को सीमित.[4] नोट: अधिग्रहण तख्ते की संख्या हमारी प्रणाली के लिए अनुकूलित किया गया और विशेष सेलुलर संरचना पर निर्भर कर रहे हैं, घनत्व लेबलिंग, सक्रियण दर और क्या fluorophores के पूरे पूल थकाऊ विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है. जीवित कोशिकाओं में, यह महत्वपूर्ण है ती के रूप में कम अवधि में localizations के एक पर्याप्त संख्या में प्राप्तमुझे के रूप में सेलुलर संरचना के आंदोलन के कारण छवि के धुंधला से बचने के लिए संभव है.
4. ताड़ के छवि निर्माण
- प्रत्येक का पता चला हाजिर के केन्द्रक स्थिति निर्धारित करें.
- Matlab (MathWorks, इंक) में छवि ढेर लोड.
- एक क्षेत्र के लिए एक सेल है कि सभी मापकला मोती शामिल नहीं आसपास छवि ढेर फसल.
- कि पृष्ठभूमि के स्तर से ऊपर है, लेकिन औसत हाजिर तीव्रता नीचे स्थान का पता लगाने के लिए एक तीव्रता सीमा का चयन करें. हम अधिकतम तीव्रता की चल औसत की गणना एक 150 फ्रेम खिड़की का उपयोग करके एक प्रयोग भर पृष्ठभूमि स्तर में बदलाव के लिए खाते हैं. प्रत्येक फ्रेम के लिए तीव्रता सीमा तो चल औसत मूल्यों से interpolated है.
- प्रत्येक फ्रेम से संबंधित सीमा घटाएँ. भावी स्पॉट सीमा से ऊपर तीव्रता के साथ तीन आसन्न पिक्सल के रूप में पहचाने जाते हैं.
- एक दो आयामी Gaussia प्रत्येक संभावित स्थान के प्रतिदीप्ति तीव्रता फ़िटn समारोह [समीकरण # 1] एक nonlinear कम से कम वर्गों एल्गोरिथ्म (चित्रा 2) का उपयोग. हर जगह का स्थानीयकरण परिशुद्धता पाया photons की कुल संख्या [समीकरण # 2] का उपयोग कर की गणना है. एक स्थानीयकरण परिशुद्धता के साथ कोई खराब फिट जगह 20 से अधिक (निश्चित कोशिकाओं) एनएम या 45 एनएम (जीवित कोशिकाओं) (# नोट 5 देखें) खारिज कर दिया है. एक मतलब तीव्रता, संभवतः अतिव्यापी emitters के कारण दो गुना से अधिक तीव्रता के साथ किसी भी जगह है, को भी खारिज कर दिया है.
- निश्चित कोशिकाओं के लिए, जिसका केन्द्रक स्थिति 45 एनएम के भीतर किसी भी स्थान की अनदेखी करके एक ही अणु के दोहराया टिप्पणियों को हटाने किसी भी अन्य जगह है कि यह कम 6 या फ्रेम से पहले. जीवित कोशिकाओं के लिए, सभी स्थानों में रखा जाता है.
- जांचना नमूना बहाव मापकला मार्कर आंदोलन का उपयोग.
- एक 10x10 पिक्सेल एक मापकला मार्कर के आसपास के क्षेत्र के बाहर फसल.
- संबंधित प्रत्येक फ्रेम से 4.1.3 में निर्धारित सीमा घटाना.
- प्रत्येक में तीव्रता प्रोफ़ाइल फिटकम से कम वर्ग फिटिंग एल्गोरिथ्म के माध्यम से फ्रेम एक गाऊसी दो आयामी आकार संभालने.
- केन्द्रक 1 फ्रेम के सापेक्ष पदों के बीच विस्थापन की गणना.
- प्रत्येक अद्वितीय उपयुक्त नमूना 4.2 में गणना बहाव के साथ 4.1 में पहचान अणु के केन्द्रक स्थिति सुधारें. Brightfield 3.7 और 3.10 में अधिग्रहीत छवियों से तुलना कर लें. यदि कोशिकाओं को असंदिग्ध मार्करों के सापेक्ष स्थानांतरित करने के लिए मनाया जाता है, डेटा बाहर फेंक दिया है.
- 15x15 एनएम पिक्सल के एक एकल बना छवि पर सभी सही केन्द्रक पदों सुपरइंपोज़. एक इकाई क्षेत्र, दो आयामी गाऊसी स्थानीयकरण परिशुद्धता [समीकरण # 2] के बराबर एक मानक विचलन के साथ केन्द्रक स्थिति पर केन्द्रित प्रोफाइल के रूप में एक अद्वितीय अणु प्लॉट. एक प्रायिकता घनत्व नक्शा है, जहां एक पिक्सेल तीव्रता कि पिक्सेल में एक अणु की खोज की संभावना (3Aiv चित्रा) के लिए आनुपातिक है में यह परिणाम है.
- कलाकारों की टुकड़ी छवियों पाम छवियों तुलना.
- सेंट्रो Replotआईडी के रूप में 4.4, लेकिन 150x150 पिक्सल एनएम और 250 एनएम के लिए एक मानक विचलन बराबर के साथ एक विमान पर पदों. यह एक पाम छवि है कि एक छवि विवर्तन सीमित है जो विवर्तन सीमित, पहनावा छवि 3.8 (चित्रा 3Aiii) में अधिग्रहण करने के लिए तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है mimics उत्पन्न.
- पुष्टि करने के लिए पता चला है कि अणु पूरी आबादी के प्रतिनिधि हैं, प्रयोगात्मक कलाकारों की टुकड़ी प्रतिदीप्ति (चित्रा 3Aii 3.8 कदम) छवि पुष्टि करने के लिए के साथ खंगाला कलाकारों की टुकड़ी छवि (चित्रा 3Aiii 4.5.1 कदम) की तुलना कि दोनों छवियों समान आकार की संरचनाओं दिखा , अभिविन्यास और रिश्तेदार तीव्रता.
[5] नोट: न्यूनतम आवश्यक स्थानीयकरण परिशुद्धता के empirically प्रत्येक विधि इमेजिंग के लिए किसी नमूने के लिए सभी अणुओं की precisions की साजिश रचने और एक उपयुक्त cutoff का चयन द्वारा निर्धारित किया गया था.
5. पाम छवि विश्लेषण
- मापने Z अँगूठी widtज और व्यास.
- पाम छवि तो खड़ी उन्मुख करने के लिए सेल की लंबी अक्ष (4A चित्रा) के रूप में घुमाएँ.
- सेलुलर Z अंगूठी क्षेत्र है जिसमें बाहर फसल.
- सेल की लंबी अक्ष के साथ एक तीव्रता प्रोफाइल पेश संचयी तीव्रता की गणना.
- एक गाऊसी वितरण तीव्रता प्रोफ़ाइल फिट. अंगूठी चौड़ाई सज्जित गाऊसी वितरण की पूरी चौड़ाई आधा (FWHM) अधिकतम (4B चित्रा) के रूप में परिभाषित किया गया है.
- सेल कम अक्ष के साथ 5.1.2 संचयी तीव्रता प्रोफाइल परियोजना. अंगूठी व्यास तीव्रता प्रोफ़ाइल (चित्रा 4C) की पूरी लंबाई के रूप में परिभाषित किया गया है.
- FtsZ घनत्व की साजिश रचने (# नोट 6 देखें).
- में (4.4) के रूप में केन्द्रक पदों Replot, लेकिन ऐसी है कि प्रत्येक अद्वितीय अणु 1 के एक मूल्य दिया जाता है और एक एकल उसके केन्द्रक स्थिति को इसी पिक्सेल सौंपा गाऊसी प्रोफाइल बिना. इस तरह, प्रत्येक की तीव्रतापिक्सेल कि पिक्सेल में पाया अणुओं की कुल संख्या का प्रतिनिधित्व करता है. घनत्व पाम छवि भी एक समोच्च साजिश (चित्रा 5E) के रूप में देखे जा सकते हैं.
- स्थानिक संकल्प निर्धारण.
- सैद्धांतिक रूप से प्राप्त स्थानिक संकल्प: पूरे नमूना का पता चला सभी अणुओं की औसत निर्धारित स्थानीयकरण परिशुद्धता का उपयोग के लिए एक प्रतिनिधि पीएसएफ बनाने और FWHM (# समीकरण 3) की गणना.
- प्रयोगात्मक हासिल स्थानिक संकल्प: एक ही अणु के दोहराने की टिप्पणियों के बीच औसत विस्थापन की गणना.
[6] नोट: हम कुल आंतरिक प्रतिबिंब पाम (TIR पाम, चित्रा 1 और 5) सक्रियण और इंटरफ़ेस / सेल ग्लास के ऊपर एक पतली परत (~ 200 एनएम) उत्तेजना को प्रतिबंधित. इसलिए कि केवल FtsZ coverslip के लिए निकटतम झिल्ली के साथ जुड़े अणुओं का पता लगाया जाएगा.
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Representative Results
चित्रा 3Aiv में सचित्र है एक दो आयामी, पाम इमेजिंग ऊपर वर्णित विधि से उत्पन्न Z अंगूठी का प्रतिपादन सुपर संकल्प है. नीचे, हम गुणात्मक और मात्रात्मक जानकारी है कि उनमें से प्राप्त किया जा सकता है संक्षेप.
गुणात्मक, हमने देखा है कि जेड अंगूठी एक अनियमित संरचना है कि कई विन्यास है कि पारंपरिक प्रतिदीप्ति छवियों (3A Dii और iv चित्रा की तुलना) में साफ़ नहीं कर रहे हैं (एक बैंड या पेचदार चाप) को गोद ले. इस तरह के रूप में इन टिप्पणियों के लिए सेल आबादी है कि एक विशेष संरचनात्मक विन्यास प्रदर्शित करता है के प्रतिशत का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
हम भी मात्रात्मक Z अंगूठी के आयामों के उपाय कर सकते हैं. अंगूठी चौड़ाई और व्यास का निर्धारण करने के लिए हमारा दृष्टिकोण 5.1 चरण में वर्णित हैं और 4 चित्र में सचित्र. 4B चित्रा से, अंगूठी चौड़ाई det था113 एनएम (FWHM) अरमाइन - विषयक. इस मूल्य एक एकल FtsZ protofilament (5-10 में इन विट्रो EM 11 के आधार पर एनएम) की उम्मीद चौड़ाई से अधिक व्यापक है. चित्रा 4C, अंगूठी व्यास 1050 एनएम के रूप में मापा जाता है. यह व्यास मात्रात्मक कोशिका विभाजन के दौरान कसना की डिग्री का वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
एक और मात्रात्मक दृष्टिकोण एक परिभाषित क्षेत्र के भीतर स्थानीय अणुओं की संख्या की गणना अणु घनत्व की गणना करने के लिए है. घनत्व माप कैसे कसकर अणु संरचना में पैक कर रहे हैं के बारे में जानकारी प्रदान करता है. अणु घनत्व दोनों सापेक्ष और निरपेक्ष संदर्भ में वर्णित किया जा सकता है. सापेक्ष घनत्व (Z पूरे सेल बनाम अंगूठी में अणुओं की जैसे अंश) अलग सेलुलर क्षेत्रों में अणुओं के वितरण के बारे में जानकारी प्रदान करता है. निरपेक्ष घनत्व माप तथ्य यह है कि पाम (3Aiv चित्रा) छवि वास्तव में एक 2d प्रक्षेपण से जटिल हैएक 3D वस्तु के. इस जटिलता को दरकिनार करने के लिए, हम TIR - पाम है, जो Z अंगूठी का एक ही पक्ष का पता लगाने विमान को प्रतिबंधित रोजगार. परिणामी डेटा चित्रा 5E में सचित्र है. चूंकि प्लॉट किए जाते अणु कुल FtsZ की आबादी का एक सबसेट का प्रतिनिधित्व करते हैं, निर्धारित घनत्व वास्तविक घनत्व की एक सीमा से कम है. अधिकतम Z-अंगूठी के TIR छवियों में मनाया घनत्व का सुझाव है कि कुछ वर्गों protofilaments 10 अतिव्यापी होते हैं.
चित्रा 1 हमारे खुर्दबीन सेटअप के एक सरल योजनाबद्ध. सभी तीन लेज़रों Metamorph कि उपयुक्त उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर सटीक नियंत्रण के लिए सक्षम बनाता है में विकसित एक कस्टम इमेजिंग प्रोग्राम द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. अंधेरे ग्रे लाइन उत्तेजना प्रकाश पथ को इंगित करता है, जबकि प्रकाश ग्रे लाइन उत्सर्जन पथ को इंगित करता है. कुल आंतरिक refle के लिएction माइक्रोस्कोपी (TIR), समायोज्य मंच प्रकाश पथ ताकि घटना कोण के रूप में बदलने के लिए सीधा अनुवाद किया है.
चित्रा 2. पाम विधि का एक सारांश. प्रारंभ में, सभी FtsZ mEos2 अणुओं हरी प्रतिदीप्ति राज्य में हैं. 405 और 561 लेज़रों द्वारा निरंतर रोशनी के लिए जोखिम पर, एकल अणुओं stochastically लाल प्रतिदीप्ति राज्य के लिए बदल रहे हैं. इस प्रक्रिया की दर 405 लेजर की शक्ति द्वारा निर्धारित किया जाता है, जबकि photobleaching दर दोनों 405 और 561 लेजर की शक्ति द्वारा निर्धारित किया जाता है. आदर्श रूप में, सक्रियण और photobleaching की दर इस तरह है कि केवल एक अणु फ्रेम प्रति का पता चला है में संतुलित कर रहे हैं. एक बार तख्ते की एक पर्याप्त संख्या का अधिग्रहण कर रहे हैं, छवियों Matlab में प्रत्येक की पहचान हाजिर फिटिंग के रूप में 4.1 चरण में वर्णित द्वारा संसाधित कर रहे हैं. प्रत्येक unique अणु तो एक हवाई जहाज़ पर है (4.4 कदम) प्लॉट किए जाते हैं, इस प्रकार एक पाम छवि पैदा, यहाँ छद्म लाल रंग में दिखाया गया है. लाल रंग में उल्लिखित फ्रेम करने के लिए पूर्ववर्ती फ्रेम के रूप में एक ही अणु से एक दोहराने की जगह शामिल करने के लिए निर्धारित किया गया था और इसलिए पाम छवि के निर्माण के दौरान शामिल नहीं किया गया था.
चित्रा 3 (ए और बी) तय की और रहते हैं (सी और डी) FtsZ mEos2 व्यक्त कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों. सभी कोशिकाओं के लिए रूपरेखा और सामान्य आकार brightfield छवि (i) में देखे जा सकते हैं. एनसेंबल प्रतिदीप्ति छवियों (ii) उत्तेजना के साथ 488 लेजर (3.8 कदम) से प्राप्त कर रहे हैं और के FtsZ - mEos2 पूरे पूल के वितरण का प्रतिनिधित्व करते हैं. कलाकारों की टुकड़ी पाम डेटा (iii, 5.4 कदम) से खंगाला छवि विधि वफादार के लिए एक गुणात्मक जांच प्रदान करता हैसच कलाकारों की टुकड़ी संरचना का प्रतिनिधित्व. उत्पन्न पाम छवि (iv) सभी अद्वितीय FtsZ mEos2 localizations के संकलन और के लिए FtsZ - mEos2 एक प्रायिकता घनत्व नक्शा का प्रतिनिधित्व करता है. सेल रूपरेखा छवियों तृतीय और चतुर्थ में पीले बिंदीदार रेखा द्वारा प्रतिनिधित्व किया है. ए और सी शो FtsZ एक एकल बैंड रचना में, जबकि कक्षों बी और डी FtsZ उदाहरण देकर स्पष्ट करना एक चक्करदार चाप रचना है, जो विवर्तन सीमित कलाकारों की टुकड़ी छवि (iii) में undetectable है अपनाने सेल. स्केल सलाखों, 500 एनएम.
चित्रा 4. ए एक पाम Z अंगूठी चौड़ाई (लाल) और Z-अंगूठी (हरा) व्यास बी रिंग चौड़ाई. के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखा छवि एक (नीला एक्स) के साथ सेल की लंबी अक्ष के साथ अनुमानित तीव्रता प्रोफ़ाइल के लिए उपयुक्त से गणना की है गाऊसी समारोह (gray) रेखा है और फिर FWHM (लाल बिंदीदार रेखा) का निर्धारण. यहाँ 113 एनएम, अंगूठी चौड़ाई निर्धारित किया गया था सी. अँगूठी व्यास 1 सेल की कमी अक्ष के साथ तीव्रता प्रोफाइल पेश और फिर शून्य से ऊपर तीव्रता प्रोफाइल की पूरी लंबाई (हरी बिंदीदार रेखा) की गणना के द्वारा निर्धारित किया जाता है. Z-अंगूठी के व्यास १,०५० एनएम के लिए निर्धारित किया गया था.
5 चित्रा TIR हथेली. अणुओं की सही गिनती के लिए अनुमति देता है. चित्रा 3 में, brightfield छवि (ए), पहनावा प्रतिदीप्ति छवि (बी), खंगाला कलाकारों की टुकड़ी प्रतिदीप्ति छवि (सी) और पाम छवि (डी) एक दिया FtsZ mEos2 व्यक्त सेल के लिए सचित्र हैं. अणु मांद से एक समोच्च साजिश के रूप में एक ही डी का निर्माण किया डेटा replottedई में sity (पिक्सेल प्रति अणुओं). इस घनत्व विश्लेषण से, FtsZ mEos2 पिक्सेल प्रति 8 अणुओं में ज़्यादा से ज़्यादा उपस्थित होने के लिए निर्धारित किया गया था. क्योंकि FtsZ protofilaments की एक परत 10 पिक्सेल प्रति 5 अणुओं की एक अधिकतम घनत्व में नतीजा होगा, इस विश्लेषण से पता चलता है कि जेड अंगूठी FtsZ protofilaments की कई परतों से बना है.
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Discussion
पाम छवियों अणु मायने रखता है और एक कोशिका के भीतर पदों के बारे में जानकारी होती है, वितरण और लक्ष्य प्रोटीन अणुओं की व्यवस्था है कि अन्य तरीकों से प्राप्त करने के लिए मुश्किल है के विस्तृत विश्लेषण की अनुमति. नीचे हम सावधानियों है कि सटीक मात्रात्मक जानकारी निकालने जबकि पाम छवियों के जैविक प्रासंगिकता को बनाए रखने के लिए लिया जाना चाहिए रूपरेखा. हम यह भी जानकारी है कि सबसे अच्छा रहते हैं बनाम निश्चित कोशिकाओं का उपयोग कर प्राप्त कर सकते हैं का पता लगाएं. अंत में, हम सुपर संकल्प कोशिका विभाजन मशीनरी के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्राप्त करने के लिए रास्ते का सुझाव देते हैं.
ऊपर वर्णित विधि निम्नलिखित तरीके में सटीक पाम छवियों का उत्पादन करने के लिए अनुकूलित किया गया था. सबसे पहले, हम विशेषता और संलयन प्रोटीन की कार्यक्षमता अनुकूलित करने के लिए सुनिश्चित करें कि यह z-अंगूठी 10 संरचना के एक विश्वसनीय मार्कर के रूप में कार्य करता है. दूसरा, हम दोनों के ऊपर और अभिव्यक्ति के तहत परिणाम के बाद से ठीक tuned संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्तिमें न्यायपालिका संरचना 10,12,13 गठन. तीसरा, हम अद्वितीय अणु (4.1.5 कदम) fluorophore photoblinking 14 गुणों पर आधारित दृढ़ संकल्प के लिए थ्रेसहोल्ड चुना है. Photoblinking अद्वितीय अणुओं का निर्धारण पेचीदा है और अगर अवहेलना, एकल अणुओं के overcounting के लिए जाता है. हालांकि overcounting आयाम माप को प्रभावित नहीं करता, यह पूर्ण घनत्व माप बढ़ाना होता है, और झूठी समूहों की उपस्थिति बना सकते हैं. इन सभी कारकों के ध्यान जा सकता है जब ब्याज की अन्य प्रोटीन के लिए इस विधि को लागू करने पर विचार करना चाहिए.
इमेजिंग के लिए रहते हैं या निर्धारित कोशिकाओं के चयन वांछित जानकारी और throughput पर निर्भर करता है. लाइव सेल इमेजिंग स्थानीय बनाने योग्य (यानी धीमी गति से चलती है) अणुओं पर (30) तेजी से है, लेकिन केवल रिपोर्ट है. यह आम तौर पर मतलब है कि झिल्ली से जुड़े अणुओं केवल जीवित कोशिकाओं में मनाया जाता है, जबकि अचल कोशिकाओं सभी लेबल अणुओं पर जानकारी प्रदान करते हैं. लाइव सेल इमेजिंग जनसंपर्कovides उच्च संकल्प संरचनात्मक आयाम और आकारिकी, लेकिन व्यक्तिगत अणुओं के आंदोलन की वजह से सटीक अणु घनत्व माप प्रदान नहीं कर सकते. फिक्स्ड सेल छवियों को इस जानकारी के सभी प्रदान कर सकते हैं, लेकिन कम यूवी सक्रियण स्तर की आवश्यकता होती है कि इतना अद्वितीय अणुओं की पहचान की जा सकती है. इस विस्तारित इमेजिंग समय (15 मिनट) के लिए होता है. इसके अलावा, निर्धारण संरचनात्मक aberrations कारण हो सकता है. इन सभी कारकों के जब चुनने जो नमूना उपयोग करने के लिए टाइप संतुलित किया जाना चाहिए.
पाम विधि हम वर्णित है Z अंगूठी संरचना है कि अलग उपभेदों, सेल चक्र राज्यों, और विकास की स्थिति की तुलना में किया जा सकता है की सुपर संकल्प जानकारी प्रदान करता है. हाल ही में तकनीकी विकास के कार्यान्वयन Z अंगूठी के cytokinetic तंत्र में जोड़ा अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है. उदाहरण के लिए, पता लगाने के मार्ग में दृष्टिवैषम्य शुरू सरल ऑप्टिकल सेटअप illust तीन आयामी क्षमता (~ 100 एनएम z-संकल्प) को जोड़ने के लिए एक रास्ता हैचित्रा 1 15 में मूल्यांकन किया गया. इसके अलावा, एक साथ एक ही समय में दो या दो से अधिक प्रोटीन की इमेजिंग spectrally अलग photoactivatable फ्लोरोसेंट प्रोटीन की तेजी से उभार के साथ एक यथार्थवादी विकल्प बन गया है. अंत में, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि एक यूवी स्वतंत्र तरीके में photoactivates के विकास के एक एकल कोशिका के डीएनए 405 एनएम रोशनी द्वारा प्रेरित नुकसान पैदा करने के बिना लंबी अवधि की निगरानी की अनुमति होगी.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
अनुदान 5RO1GM086447-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 x MEM Amino Acids | Sigma | M5550 | |
| 100 x MEM Vitamins | Sigma | M6895 | |
| IPTG | Mediatech | 46-102-RF | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Micrsocopy Sciences | 15710-S | |
| SeaPlaque GTG Agarose | Lonzo | 50111 | |
| 50 nm Gold Beads | Microspheres-Nanospheres | 790113-010 | |
| FCS2 Imaging Chamber | Bioptechs | ||
| Stage Adaptor | ASI | I-3017 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 1.45 NA, 60x Objective | Olympus | ||
| IXON EMCCD Camera | Andor Technology | DU897E | |
| 488-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 561-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 405-nm CUBE Laser | Coherent |
References
- Buddelmeijer, N., Beckwith, J. Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center. Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).
- de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase. Nature. 359, 254-256 (1992).
- Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ). J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).
- Bi, E. F., Lutkenhaus, J. FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli. Nature. 354, 161-164 (1991).
- Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).
- Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes. Science. 320, 792-794 (2008).
- Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. Embo J. 26, 4694-4708 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
- Fu, G., et al. In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM). Plos One. , (2010).
- Huecas, S., et al. Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments. Biophys. J. , (2007).
- Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).
- Dai, K., Lutkenhaus, J. The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
