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Biology

Whole Berg RNA Fluorescent Published: January 30, 2013 doi: 10.3791/50057
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), 2Department of Biochemistry, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

Hier beschreiben wir eine ganze-mount fluoreszierende

Abstract

Beurteilung der Expression eines Gens, sowie der subzellulären Lokalisation Eigenschaften seiner transkribierte RNA, sind wesentliche Merkmale für das Verständnis seine biologische Funktion während der Entwicklung. RNA in situ Hybridisierung (RNA-ISH) ist eine leistungsfähige Methode zur Visualisierung von RNA Verteilung Eigenschaften verwendet, sei es bei den Organismen, Zellen oder subzellulären Ebene 1. RNA-ISH basiert auf der Hybridisierung einer markierten Nukleinsäure-Sonde (z. B. Antisense-RNA, Oligonukleotiden) komplementär zu der Sequenz eines mRNA oder eines nicht-kodierende RNA Ziel von Interesse 2 basiert. Da das Verfahren erfordert Primärsequenz Information allein zur sequenzspezifischen Sonden zu erzeugen, kann es allgemein zu einem breiten Spektrum von Organismen und Gewebeproben 3 angewendet werden. In der Tat, eine Reihe von großen ISH Studien durchgeführt wurden, um die Genexpression zu dokumentieren und RNA Lokalisation Dynamik in verschiedenen Modellorganismen hat sich auf das führteAufbau wichtiger Community-Ressourcen 4-11. Während eine Vielzahl von Sonden-Markierung und zum Nachweis Strategien im Laufe der Jahre entwickelt worden sind, bieten die kombinierte Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nachweisreagenzien und enzymatische Signalverstärkung Schritte signifikante Verbesserungen der Empfindlichkeit und Auflösung des Verfahrens 12. Hier beschreiben wir eine optimierte Fluoreszenz in situ Hybridisierung Verfahren (FISH) unter Verwendung Tyramid Signalverstärkung (TSA), die RNA Expression und Lokalisation Dynamik inszeniert Drosophila-Embryonen zu visualisieren. Das Verfahren wird in 96-well PCR-Platte-Format, das erleichtert die gleichzeitige Verarbeitung einer großen Zahl von Proben durchgeführt.

Protocol

Ein. RNA Probe Vorbereitung

Übersicht: Der folgende Abschnitt beschreibt die erforderlichen Schritte zum Digoxigenin (DIG)-markierten RNA-Sonden für FISH machen. Der erste Schritt beinhaltet das Klonen oder PCR Amplifikation einer Sequenz entsprechend der transkribierten Region eines Gens von Interesse, die verwendet werden, um eine Sequenz-spezifische Sonde erzeugt wird. Dies kann durch Klonieren der erste Genabschnitt in ein Plasmid, in dem die multiple Klonierungsstelle von Bakteriophagen Promotorelemente (T7, T3 oder SP6), die dann als Matrize für eine PCR mit flankierenden Primer dienen, die die Promotor-Sequenzen flankiert wird integrieren können erreicht werden , wodurch eine lineare PCR-Produkt mit unterschiedlichen Promotorsequenzen an jedem Ende (1A). Alternativ, den Klonierungsschritt zu vermeiden, kann man auch eine PCR-Amplifikation von genomischer DNA oder cDNA unter Verwendung von Oligonukleotiden, die T7-, T3 oder SP6-Sequenzen an ihrem 5'-Enden (zB T7 umfassen:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '; T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; Sp6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '). Die lineare PCR-Produkte werden dann als Matrizen verwendet, um Dig-markierten Sense oder Antisense-RNA-Sonden durch Abfließen in vitro-Transkription mit der geeigneten Polymerase (1B) zu machen. Bei der Sonden für spezifische Gene, bereiten wir sowohl Sense-und Antisense-RNA-Sonden empfehlen verschiedene Polymerasen, die hilfreich sein für die Beurteilung der FISH-Signal Spezifität (dh, wenn das Gen von Interesse in Antisense-Orientierung transkribiert wird, wird die RNA-Sonde zeigen, die Pegel der Hintergrundgeräusche Signal). In all der folgenden Schritte aus, sollte man große Sorgfalt, um potenzielle Abbau durch Kontamination Ribonukleasen (RNasen) zu vermeiden, indem Sie zunächst die Reinigung aller Bank Flächen und Geräte mit 70% Ethanol oder kommerzielle RNAse Dekontaminationslösungen und durch die Verwendung RNAse-freie Versorgung (zB Wasser, Tipps, Mikrozentrifugenröhrchen).

MaMaterialien

  • 1,5 ml Reaktionsgefäße (Abgene, Rochester, NY, USA Cat. No 0900)
  • Gel-Extraktions-Kits (QIAGEN, Mississauga, ON, Canada;. Art.-Nr. 28706).
  • RNAse freiem Wasser (Wisent, Inc. Cat. Nr. 809-115-CL)
  • RNA-Polymerasen (T7, T3 oder SP6). (20 U / ul, Fermentas Biosciences. Cat. No EP0101, EP0111, EP0131).
  • RNAse-OUT Ribonuclease-Inhibitoren (40 U / ul) (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. Nr. 10777-019).
  • Digoxigenin (DIG) Nukleotid Mixe (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Laval, QC, Kanada. Cat. No.11209256910).

Ausrüstung

  • Tischplatte Mikro-Zentrifuge
  • Gel-Elektrophoresegerät
  1. PCR amplifizieren genspezifischen Sequenz aus genomischer DNA, cDNA, oder Plasmid-DNA, um eine lineare PCR-Produkts durch Bakteriophagen T7, T3 oder SP6-Promotor flankiert erzeugen. Folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers für die PCR-Bedingungen.
  2. Überprüfen Sie die Qualität und size des PCR-Produkts durch Agarosegelelektrophorese. Verbrauchsteuern und reinigen PCR-Produkt mit einem Standard-Gel-Extraktions-Kit nach den Herstellern Empfehlungen und eluieren das Produkt in 50 ul Puffer.
  3. Fällung des PCR-Produkt durch Zugabe von 5 ul 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 150 pl eiskaltem 100% Ethanol, und legen die Röhrchen bei -70 ° C über Nacht. Zentrifugenröhrchen bei 13.000 xg für 10 min bei 4 ° C waschen und das Pellet mit 70% Ethanol. Spin wieder zu entfernen alle Spuren von Ethanol und Luft trocknen das Pellet. Resuspendieren in 25-50 ul RNAse-freiem Wasser.
  4. Transkribieren Dig-markierten Sonde mit 200-500 ng gereinigtes PCR-Produkt in einem 20 ul Reaktion wie folgt: 2 ul 10X T7 Transkription Puffer (Invitrogen), 1 ul (20 U / ul) RNAse-Inhibitor, 2 ul Dig-NTP-Mix und 2 ul T7-RNA-Polymerase (20 U / ul). Bringen Sie das Endvolumen 20 ul mit RNAse-freiem Wasser. Die Transkription bei 37 ° C für 3-4 Stunden.
  5. Passen TRANSCription Mix zu 50 ul mit RNAse-freies Wasser und Ausfällen des Dig-markierten RNA-Sonde, wie in Schritt 4 beschrieben. Resuspendieren der gewaschenen RNA-Pellet in 100 ul RNAse-freiem Wasser. Bewahren Sie die resuspendierten Proben bei -70 ° C.
  6. Quantifizierung der Sonde mit einem nanodrop Spektralphotometer. Um die Sonde Qualität zu überprüfen, führen Sie eine 1-2 ul Probe auf einem 1-2% igen Agarosegel mit Ethidiumbromid gefärbt.

2. Sammlung und Fixierung von Drosophila-Embryonen

Übersicht: Dieser Abschnitt beschreibt die Schritte für die Ernte und Verarbeitung inszeniert Drosophila-Embryo. Abhängig von der Anzahl von Embryonen Bedarf können Fliegen in Käfigen Population verschiedener Größe aufrechterhalten werden. Die folgenden Schritte sind für Sammlungen durchgeführt mit 900 cm 3 zylindrischen Käfige mit 100mm Apfelsaft Sammlung Platten. Ordnungsgemäße Fixierung erfordert die Entfernung von zwei Schutzschichten umgibt den Embryo: die äußere und die innere Chorion Vitelline Membran 13. Nach der Ernte werden die Embryonen werden zunächst in einem 50% Bleichlösung auf das Chorion entfernen getaucht, dann werden sie in einer zweiphasigen Lösung mit Heptan (permeabilisiert die Vitellin-Membran) und PBS mit 3,7% Formaldehyd versetzt. Die Membran wird dann Vitellin rissig und entfernt durch Übertragen der Embryonen in einem zweiphasigen Gemisch aus Heptan und Methanol. Ordnungsgemäße Embryo Fixierung und Entfernen des Dotterhaut ist kritisch für den Erfolg des stromabwärtigen FISH-Verfahren.

Materialien

  • Apfelsaft Agarplatten (40% Apfelsaft, 4% Saccharose, 3,5% Agar, 0,3% Methylparaben) mit Dime-Größe Hefepaste (Bäckerhefe mit Wasser auf Butterkonsistenz gemischt)
  • Powdered Paraformaldehyd (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA;. Art.-Nr. 19208)
  • Heptan
  • Methanol
  • 3% Bleach-Lösung
  • 20 ml Glasszintillationsröhrchen (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada;. Best.-Nr. 03-337-15).

Ausrüstung

  • Bevölkerung Käfigen
  • Sammelkörbe (hergestellt unter Verwendung eines Nitex mesh und den oberen Teil des Schnittes 50 ml Polypropylen-Rohr, in dem ein Loch im Deckel geschnitten worden ist).
  • Kleinen Pinsel
  • Tischplatte Wirbel
  1. Pre-Clear wohlgenährten Bevölkerung Käfige mit einem frischen Apfelsaft / Hefe Platte für 1 Stunde bei 25 ° C.
  2. Fügen Sie einen neuen Apfelsaft / Hefe Platte an den Käfig, um Embryonen im Frühstadium zu ernten. Inkubieren den Käfig für 4 Stunden bei 25 ° C (beachten Sie, dass Abholzeiten eingestellt werden je nach den gewünschten Stufen werden).
  3. Eine frische 37% Formaldehyd-Lösung durch Kombinieren 3,7 g Paraformaldehyd Pulver, 70 ul 2N KOH und 7,3 ml Milli-Q Wasser in einem Glasszintillationsröhrchen unter einer chemischen Haube. Kochen Sie die Lösung bis der Paraformaldehyd Pulver vollständig gelöst ist, dann auf Raumtemperatur abkühlen und filtriert in neue Szintillationsfläschchen.
  4. Bereiten Sie eine biphasische Fixierung LösungKombinieren 2,25 ml 1X PBS mit 250 ml 37% Formaldehyd in einem Szintillationsfläschchen, dann Zugabe von 7,5 ml Heptan.
  5. Ernten den Apfelsaft Platte aus dem Käfig und sammeln die Embryonen, die durch Zugabe von ein wenig Raumtemperatur Leitungswasser und zart Bürsten der Embryonen aus der Platte mit dem Pinsel. Übertragen Sie die resuspendierten Embryonen in einem Korb und mit lauwarmem Leitungswasser.
  6. Dechorionate Embryonen für 90 sec durch Baden die Sammlung Körbe in Bleichlösung, dann gründlich mit lauwarmem Leitungswasser (bis Bleiche Geruch verschwunden ist).
  7. Demontieren Sie den Auffangkorb, sammeln Embryonen vorsichtig mit einem Pinsel und übertragen sie in der zweiphasigen Fixierung Lösung. Die Embryonen werden an der Grenzfläche zwischen dem PBS und Heptan Schichten anreichern.
  8. Seal Szintillationsgefäße und befestigen zu einem Vortex-Mischer. Schütteln für 20 min am niedrigsten Einstellung.
  9. Entfernen und entsorgen Sie die meisten der unteren PBS und oberen Heptan Phasen mit einer Pasteurpipette. Aspirierendie verbleibende PBS / Heptan / Embryonen Mischung in die Pipette. In tropfenweise, entsorgen Sie die unteren PBS-Phase aus der Pipette, kümmert sich nicht um die Embryonen zu beseitigen. Hinterlegen die Embryonen in ein 1,5 ml Röhrchen, das eine zweiphasige Lösung von 500 ul Heptan (obere Phase) und 500 ul Methanol (untere Phase).
  10. Schütteln Rohre von Hand kräftig für 30-45 Sek. vitelline Membranen zu knacken. Einmal geknackt, werden die Embryonen in die Methanol sinken.
  11. Entsorgen Sie die oberen Heptanphase und ungerissenen Embryonen im Heptan / Methanol Interphase, und 500 ul Methanol. Schütteln für 5 sek.
  12. 3 x waschen mit Methanol und speichern die Embryonen bei -20 ° C (an dieser Stelle Embryonen können für Wochen / Monate gespeichert werden).

3. Postfixierung Processing, Hybridisierung und Post-Hybridisierung Washes

Übersicht: In diesem Abschnitt werden die Bearbeitungsschritte für den Embryo Permeabilisierung vor FISH, pre-HybridisierungHybridisierung mit den Sonden und RNA Posthybridisierung Wäschen. Für die anfänglichen Schritte Permeabilisierung die Embryonen als Pool in einem einzigen Rohr (Schritte 1-9 unter dem Ziel für 10-15 ul ständiger Embryonen / Probe) gehandhabt, aber sie werden in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte PCR aliquotiert bevor mit der Vorhybridisierung Schritt (Schritt 10). Dies hilft, die gleichmäßige Bearbeitung aller Embryonen in den ersten Phasen des Experiments zu gewährleisten. Beim Einrichten einer FISH Experiments ist es wichtig, negative Kontrollen umfassen, um den Pegel des Hintergrundsignals in einzelnen Experimente bestimmen. Hierzu empfehlen wir auch ein "no-Sonde" Probe und, wie in Abschnitt 1, eine Probe mit dem "Sinn"-RNA-Sonde, die in der Regel geben ein Signal vergleichbar mit der "no-Sonde" Bedingung hybridisiert festgestellt.

Materialien:

  • Methanol
  • Phosphatgepufferte mit 0,1% Tween-20 (PBT) Kochsalzlösung
  • Proteinase-K 1 mg / ml Stammlösung (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Kanada. Katalog Nr. P2308)
  • Glycine (20 mg / ml Stammlösung)
  • Hybridisierungslösung: 50% Formamid, 5X SSC, 0,1% Tween-20, 100 g / ml gescherte Lachssperma-DNA, 100 ug / ml Heparin.
  • 0,2 ml halfskirted 96-well PCR-Platten, Abgene, Rochester, NY, USA Cat. Kein 0900)

Ausrüstung

  • Hybridisierungsofen, digitale Heizblock oder Wasserbad einstellbaren bis 56 ° C, 80 ° C oder 100 ° C, oder eine PCR-Maschine.
  • Mehrkanalpipetten (empfohlen Waschschritte vereinfacht)
  • Taumelmischer
  1. Spülen der Embryos in Methanol, dann in einem 1:1-Gemisch von Methanol: PBT, und dann zweimal in PBT.
  2. Fixierung der Embryonen für 20 min in 1 ml PBT mit 3,7% Formaldehyd (frisch zubereitet, wie in Schritt 11 beschrieben) mit konstanter Schaukeln auf einem Kolbenpendel.
  3. Waschen Embryonen für 3 mal 2 min in PBT, während schaukeln.
  4. Bereiten Sie eine Lösung von 3 g / ml Proteinase K (PK) in PBT verdünnt und fügen500 ul Lösung, um Proben. Inkubieren Proben für 10 min bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Mix Embryonen alle 2 min durch Strahlen mit einer Pipette oder durch vorsichtiges Umdrehen der Rohre.
  5. Übertragen Embryonen Proben auf Eis für 1 Stunde.
  6. Bewegen Proben auf Raumtemperatur und entfernen PK Lösung. Waschen 2 mal für 2 min mit 1 ml PBT + 2 mg / ml Glycin.
  7. Fix Proben 20 min in 1 ml PBT + 3,7% Formaldehyd mit Schaukeln. Spülen Embryonen 5 mal in PBT.
  8. Spülen Embryonen mit 1 ml einer 1:1-Mischung von PBT und Hyb Lösung. Ersetzen mit 0,5-1 ml 100% Hyb Lösung (bei diesem Schritt werden die Embryonen können für mehrere Tage / Wochen bei -20 ° C gelagert werden).
  9. Aliquot Embryonen in einzelnen Wells einer 96-Well-Platte (Ziel für ~ 10-15 ul angesiedelt Embryonen / well, kümmern sich um große Blende Tipps verwenden, um eine Beschädigung der Embryonen).
  10. Kochen Sie 100 ul / Stichprobe von Hyb-Lösung für 5 min und dann kühl auf Eis für 5 min. Diese Lösung wird für die Probe vor Hybridisierung verwendet (Pre-Hyb).
  11. Fügen Sie 100 ul / Stichprobe von Pre-Hyb-Lösung und Inkubation für mindestens 2 Stunden bei 56 ° C.
  12. Für jede Probe verdünnen ~ 100 ng Sonde in 100 ul Hyb Lösung. Wärme bei 80 ° C für 3 min, dann cool auf Eis für 5 min (beheizte Sonden können auf Eis für mehrere Stunden aufbewahrt werden).
  13. Entfernen Sie die Pre-Hyb-Lösung aus den Embryonen und ersetzen mit dem RNA-Sonde Lösung.
  14. Hybridisieren bei 56 ° C für 12-16 Stunden.
  15. Pre-warm die folgenden Waschlösungen bei 56 ° C: (A) 200 ul / Stichprobe von Hyb Lösung; (B) 100 ul / Probe einer 3:1 Mischung aus Hyb: PBT; (C) 100 ul / Probe ein 1:1-Mischung aus Hyb: PBT, (D) 100 ul / Probe von einer 1:3 Mischung aus Hyb: PBT, (E) 400 ul / Probe von PBT.
  16. Spülen Proben mit 100 ul Waschlösung A, dann die Waschschritt mit 100 ul / Probe von Lösungen AD bei 56 ° C für 15 min jeden. Dann waschen Proben 4 mal für 5 min mit 100 ul / Probe der Lösung E bei 56 ° C.
  17. Proben kühle auf Raumtemperatur.

Übersicht: In diesem Abschnitt werden die Antikörper und Nachweisreagenzien zum Nachweis und zur Visualisierung der Verteilung der RNA Sondensignal folgende Hybridisierung. Diese Schritte sind schematisch in Abbildung 2 dargestellt. Hier präsentieren wir nur die Standard Nachweisreagenzien, die wir verwenden zur robusten Signalverstärkung, sondern es existiert eine Vielzahl im Handel erhältlichen Reagenzien, die als Alternativen verwendet werden können, vor allem beim Durchführen Doppel-FISH-Experimente zur Zusammenarbeit erkennen verschiedene RNAs gleichzeitig für Protein-RNA Doppel Färbung. Beispiele von Ergebnissen mit diesem Protokoll sind in der mRNA-Expression / Lokalisierung Muster Mosaik in Abbildung 3 dargestellt.

Materialien

  • HRP-konjugierten monoklonalen anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. Nr. 200-032-156)
  • Biotin-konjugierten Maus-monoklonalen anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. Nr. 200-062-156)
  • Streptavidin-HRP-Konjugat (Molecular Probes, Eugene OR, USA, Cat. No.S991)
  • Cy3-Tyramid Konjugate (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA, Cat. No SAT704A)
  • DABCO Montage Lösung: In einem 50-ml-Tube, verdünnen 1,25 g DABCO (1,4-Diazabicyclo [2.2.2] octan; Sigma D-2522) in 15 ml 1X PBS, dann fügen Sie 35 ml Glycerin und Mischung bis zur vollständigen homogen. Durch Vormischung mit PBS wird das DABCO Pulver löste sich sehr schnell. Shop Montage Lösung bei -20 ° C.
  • Objektträger, Deckgläser

Ausrüstung

  • Taumelmischer
  • Mehrkanalpipette
  • Fluoreszenzmikroskop
  1. Planen PBTB Lösung, enthaltend PBT + 1% fettfreie Trockenmilch (üblicherweise 50 bis 100 ml ausreichend für alle Nachweisreagenz Inkubations-und Waschschritte).
  2. Blockieren Proben für 10 min bei Raumtemp in 100 ul PBTB / Probe während Schaukeln auf Kolbenpendel.
    3. <li> entfernen Blocking-Lösung aus Embryonen und inkubieren Proben für 1,5-2 Stunden bei Raumtemperatur mit 100 ul / Probe des monoklonalen Biotin Anti-DIG-Antikörper-Lösung (verdünnt 1/400 ab Lager in PBTB) mit Schaukeln.
  3. Waschen Proben 6 mal für jeweils 5 min mit 100 ul PBTB / Probe mit Schaukeln.
  4. Inkubieren 1,5 Stunden bei Raumtemperatur mit 75 ml / Probe von Streptavidin-HRP-Lösung (verdünnt 1/100 ab Lager PBTB, 10 ug / ml Endkonzentration) mit Schaukeln.
  5. Waschen Proben 6 mal für 5 min Jeweils 100 ul PBTB / Probe mit Schaukeln (für die DNA-Gegenfärbung, verdünnter DAPI auf 1X Arbeitskonzentration in PBTB und diese Lösung im ersten Waschschritt).
  6. Spülen Embryonen mit PBT, dann waschen 2 mal für 5 min mit PBS.
  7. Inkubieren Proben für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf der Kolbenpendel mit 50 ul / Probe von Cy3-Tyramid Lösung (verdünnt 1/50 in Tyramid Amplifikationspuffer). Von diesem Schritt auf, stellen Sie sicher, um Proben in einem Licht abgeschirmt Behälter halten. </ Li>
  8. Waschen Proben 6 mal für jeweils 5 min mit 100 ul PBS / Probe auf Kolbenpendel.
  9. Entfernen PBS und fügen 100-125 ul / Probe der Montage Lösung mit 70% Glycerin und 2,5% (DABCO). Proben bei 4 ° C. Diese Proben können für mehrere Jahre gelagert werden.
  10. Mit einem breiten Bohrung Spitze, resuspendieren Embryonen durch vorsichtiges Pipettieren der Proben und übertragen 25 ul von Embryonen auf einen Objektträger aus Glas, dann ein Deckglas über die Embryonen und Dichtung auf dem Objektträger mit Nagellack.
  11. Analysieren Embryos Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop.

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Representative Results

Wenn erfolgreich durchgeführt, bietet dieses Verfahren eine auffallend erhöhtes Maß an Detail in der räumlich-zeitlichen Analyse von Genexpression und mRNA Lokalisation Dynamik in der frühen Drosophila Embryogenese. In der Tat, wie in 3A für die klassische Pair-rule-Gens runt (run) dargestellt, kann man dieses Protokoll, um die Genexpression Veranstaltungen über den Nachweis des entstehenden transcript Herde in Gruppen zum Ausdruck Kerne beobachten. Zusätzlich, wie im Embryo Mosaik in 3B gezeigt, ermöglicht das Verfahren die Visualisierung von mRNA Lokalisierungsfeatures im Hochauflösungsmodus.

Abbildung 1
Abbildung 1. Outline of RNA-Sonde Herstellungsweise. (A) Schematische Darstellung der Strategie zur Synthese Dig-markierten RNA-Sonden durch in vitro Transkription usinga linearen DNA-Matrize mit Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor Elementen flankiert. (B) Bild von Standard 1% Agarosegel, das Beispiele von in vitro transkribierte RNA-Sonden für die Histon H2A, Lauf und doc Transposon RNAs. Wir führen in der Regel eine Seite-an-Seite-Elektrophorese sowohl des PCR-Matrize und RNA-Sonde. Die RNA tritt typischerweise als eine intensive diskretes Band mit höherer Mobilität im Vergleich zu der Vorlage

Abbildung 2
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Sonde Detektionsschritte in der FISH-Verfahren. Nachfolgend Sondenhybridisierung zu verarbeitenden Embryonen werden die Dig-markierten Sonden erkannt Verwendung eines biotinylierten α-DIG-Antikörper, der dann an HRP-konjugiertem Streptavidin komplexiert ist. Tyramid Signalverstärkung (TSA) wird dann durchgeführt, was zur Umwandlung der Tyramid Reagenz in Form freier Radikale turch die Aktivität von HRP. Transient reaktiven Tyramid freie Radikale kovalent an aromatischen Resten benachbarter Proteinen und verhindert ihre Diffusion von der Sonde weg Lage. Das Substrat wird auf Tyramid Fluoreszenzfarbstoffe, die durch Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden kann komplexiert.

Abbildung 3
Abbildung 3. Beispiele von Ergebnissen unter Verwendung dieser FISH-Verfahren Hervorhebung der Vielfalt der mRNA-Expression und subzelluläre Lokalisation Muster in Drosophila Embryonen. (A) FISH-Analyse der Pair-rule-Gens auf verschiedene Phasen der Embryogenese laufen enthüllt, wie die erste allgemeine Ausdruck im mittleren Bereich der Embryo in embryonalen Stadium 4 wird in einem segmentierten Streifenmuster in späteren Stadien verfeinert. (B) Darstellung der Mosaik FISH Ergebnisse zeigen verschiedene Sorten von mRNA localization Mustern in Stufe 4-7 Embryonen. FISH wurde unter Verwendung Dig-markierten Antisense-Sonden, die hybridisiert und durch sequentielle Inkubationen mit dem biotinylierten anti-DIG-Antikörper, Streptavidin-HRP, und Cy3 Tyramid nachgewiesen. RNA = blau, DNA = rot. Maßstab in (A) = 25 uM, während die in (B) = 50 uM.

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Discussion

Für Sonde Syntheseschritte, wir erzeugen typischerweise Run-off-Antisense-RNA-Sonden durch in vitro Transkription von full-length Drosophila cDNAs von Plasmiden in der Drosophila Gene Collection (DGC), eine Ressource auf der folgenden Website detailliert gefunden amplifiziert: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 14,15. Dieser Ansatz wurde ausgiebig in großem Maßstab ISH Studium an Mapping-Genexpression und mRNA Lokalisation Muster in fly Embryonen 9,16 Ziel verwendet. DGC Plasmide können aus der Drosophila Genomic Resource Center (bestellt werden https://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/ ). Die Flexibilität in der Gestaltung Ausgangsmaterialien und individuelle Primer mit T7, SP6 oder T3 Überhänge erlaubt es, auf einfache Weise an bestimmte Sonden-mRNA-Isoformen (zB alternativ gespleißte Varianten) o detektierenr nicht-kodierende RNAs, die nicht in der Standard-cDNA Sammlungen vertreten sind. Bei der Betrachtung Gestaltung Isoform-spezifischen Sonden, haben wir festgestellt, dass Vorlagen von 250-1,000 Basen können hervorragende FISH Ergebnisse zu erzielen.

Für FISH in der Fliege Embryos, tun wir nicht fragmentieren unseren Sonden durch Carbonat Behandlung, sondern wir voller Länge Run-off-Transkripte, die in der Größe zwischen 500-5000 Basen reichen kann. Bei der Durchführung von FISH auf andere Gewebe, die weniger durchlässig für große Sonden sind, kann die Fragmentierung der Tat begünstigen Sonde Penetration. Jedoch bevorzugen wir die Möglichkeit zur Herstellung von Sonden mit kleineren PCR-amplifizierten DNA-Templates oder Bündelung mehrerer individuell synthetisierten kleine Sonden zusammen, anstatt Durchführen chemische Fragmentierung der große Sonden, die variabel Ergebnisse liefern und die Gesamtkosten Sonde Qualität kann.

Wie in den Embryo-Entnahme beschriebenen Schritte haben wir in der Regel fügen Hefepaste den Entnahmeeinheit Platten. Hefepaste wird erheblichErhöhung der Zahl der Eier von den Fliegen gelegt, als Eierproduktion ist abhängig von der Ernährung Umwelt 17. Darüber hinaus wird häufig Drosophila Fliegen legen ihre Eier direkt in die Hefe Paste. Diese Embryonen kann leicht durch Lösen der Hefe in Wasser mit einem kleinen Pinsel Paste und Passieren der Mischung durch einen Auffangkorb gesammelt werden. Für die dechorionation Schritt 3% Bleichlösung durch Verdünnen handelsübliche Bleiche (typischerweise 6% Konzentration) 1:1 mit Wasser, wird in den meisten Protokollen 13,18,19 verwendet. In unserer Erfahrung haben wir festgestellt, dass Inkubation Embryonen mit einer 3% igen Bleichlösung für 90 sec bietet effiziente dechorionation. Diese Parameter müssen unter Umständen angepasst abhängig von der kommerziellen Bleichmittel-Lösung, die verfügbar ist, aber man sollte darauf achten, nicht um die Embryonen zu bleichen überbelichtet, da dies die Proben beschädigen können. Um die dechorionation Verfahren genauer zu überwachen, ist es möglich, bei den Embryonen unter einem Mikroskop t Blicko sicherstellen, dass die dechorionation Reaktion abgeschlossen ist, dh die Embryonen verlieren ihre dorsalen Fortsätze, wenn sie dechorionated werden. Schließlich, um die ordnungsgemäße Embryos Fixierung zu gewährleisten, verwenden wir frisch zubereitet Formaldehyd-Lösungen, wie alte Lösungen zur Ausfällung neigen. Für weitere Referenz, wurde dieses Verfahren in früheren Methoden Artikel 13,18,19 beschrieben worden.

Für die Schritte in Bezug auf Permeabilisierung embryonalen Gewebe mit Proteinase K, oder Nachweisreagenzien wie den Antikörpern und Cy3-Tyramid haben wir gefunden, optimale Ergebnisse mit den Verdünnungen in diesem Protokoll beschrieben. Jedoch aufgrund von Variationen in Laborumgebungen und Reagenz Aktien, empfehlen wir, dass jedes Labor empirisch zu testen ihren Reagenzien an die besten Arbeitsbedingungen Konzentrationen für ihre spezifischen Bedürfnisse zu ermitteln. Darüber hinaus haben wir gefunden, die optimalen Reagenzkonzentrationen kann in Abhängigkeit von den analysierten Geweben variieren.

Um das FISH-Verfahren sicherzustellen, is geben reproduzierbare Ergebnisse empfehlen wir immer Hinzufügen von mehreren positiven Kontrollen auf den Test, was könnte Sonden für Transkripte mit wohldefinierten Ausdruck / Lokalisierung Muster (zB run) enthalten. Transcripts mit markanten mRNA Lokalisation Muster während der frühen Drosophila Embryogenese auf der Fly-FISH-Website (zu finden http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca/ ). Umgekehrt, für Hintergrund Signalerkennung, wie oben erwähnt zu steuern, sollte man auch "No-Sonde" und / oder RNA-Sonde Proben.

Neben dem Cy3 Tyramid Konjugats in diesem Protokoll beschrieben, gibt es eine Vielzahl von anderen kommerziell erhältlichen Fluorochrom-konjugierten Tyramid Reagenzien von Perkin Elmer Life Sciences oder Molecular Probes (Invitrogen, Canada, Inc.), die zusätzliche Flexibilität für Mehrfarben Imaging Experimente können bereitzustellen . Während diese Methode beschreibt unsere grundlegenden Procedure für einzelne RNA FISH, Variationen dieser Methode kann für komplexere Experimente, wie Doppel-RNA FISH-oder RNA-Protein-co-Erkennung implementiert werden. Für Einzelheiten zu diesen Verfahren, empfehlen wir nach den Verfahren in bestehenden FISH Methoden papers 18-20 beschrieben.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Arbeiten durchgeführt im Lécuyer Labor wird durch Mittel aus dem Nationalen Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), dem kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) und dem Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) unterstützt. Fabio Alexis Lefebvre und Gaël Moquin-Beaudry von NSERC Undergraduate Research studentships unterstützt, während Carole Iampietro vom Angelo Pizzagalli Postdoc-Stipendium unterstützt wird.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T7, T3 or SP6 RNA Polymerase Fermentas Life Sciences EP0101,EP0111,EP0131 Kits contain reaction buffer.
DIG RNA Labeling Mix Roche Applied Science 11 277 073 910
RNAguard Amersham Biosciences 27-0816-01
3M sodium acetate
Cold 100% ethanol.
Cold 70% ethanol.
Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water.
Heptane
Methanol
proteinase K Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada Catalog No. P2308
40% formaldehyde solution, freshly prepared
PBS-Tween solution (PBT) 1xPBS, 0.1% Tween-20
Glycine solution 2 mg/ ml glycine in PBT
HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc 200-032- 156 (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB
HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG Roche Applied Science, Laval, QC 1 207 733 1/500 dilution of stock solution in PBTB
Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA 200-062-156 (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB
Streptavidin-HRP conjugate Molecular Probes, Eugene OR, USA S991 (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
  2. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
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Legendre, F., Cody, N., Iampietro, C., Bergalet, J., Lefebvre, F. A., Moquin-Beaudry, G., Zhang, O., Wang, X., Lécuyer, E. Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (71), e50057, doi:10.3791/50057 (2013).

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