Summary
여기 우리는 전체 마운트 형광을 설명
Abstract
유전자뿐만 아니라 베꼈 RNA의 subcellular 지방화 속성의 표현 패턴을 평가하는 것은 개발 과정의 생물학적 기능을 이해하기위한 핵심 기능입니다. 현장 하이브리드 화의 RNA (RNA 살쯤)는 RNA 배포 속성을 시각화하는 데 사용되는 강력한 방법입니다, organismal, 휴대 또는 subcellular 레벨 1에서합니다. RNA 살쯤는 mRNA 또는 관심 (2)의 비 코딩 RNA 대상의 순서를 보완이라는 핵산 산 프로브 (예 : 안티센스 RNA, oligonucleotides)의 하이브리드에 기반을두고 있습니다. 프로 시저가 순서 특정 프로브를 생성 할 만 기본 순서 정보를 필요에 따라, 그것은 보편적 생물과 조직 표본 3의 광범위한 적용 할 수 있습니다. 사실, 대규모 틱 연구 번호가 유전자 발현을 문서화하고 다양한 모델 생물에서 현지화 역학을 RNA하기 위해 구현되었으며, 이는하게되었다중요 지역 사회 자원 4-11의 설립. 프로브 라벨 및 검색 전략의 다양한이 년 동안 개발 된 반면, 휘황-라벨 감지 시약 및 효소 신호 증폭 단계의 결합 사용은 절차 12 감도와 해상도에 상당한 향상을 제공합니다. 여기, 우리는 무대 Drosophila의 배아에서 RNA의 발현 및 현지화 역학을 시각화하는 tyramide 신호 증폭 (TSA)을 채용 원위치 하이브리드 화 방법 (물고기)에 최적화 된 형광을 설명합니다. 절차는 크게 샘플을 다수의 동시 처리를 용이하게 96도 PCR 플레이트 형식으로 수행됩니다.
Protocol
1. RNA 프로브 준비
개요 : 다음 섹션은 물고기에 적합한 Digoxigenin (해봐)이라는 RNA 프로브를 만들기 위해 필요한 단계를 설명합니다. 첫 번째 단계는 복제 또는 시퀀스 특정 프로브를 생성하는 데 사용됩니다 관심있는 유전자의 베꼈 지역에 해당하는 순서를 증폭 PCR 포함됩니다. 이것은 여러 복제 사이트는 다음 발기인 시퀀스를 통합 측면을 노릴 프리 머를 사용하여 PCR을위한 템플릿으로 제공 할 수 박테리오파지 프로모터 요소 (T7, T3 또는 SP6)에 의해 둘러싸인되는 플라스미드에 처음 복제 유전자 세그먼트에 의해 달성 될 수있다 , 따라서 각각의 말단 (그림 1A)에서 다른 발기인 시퀀스와 선형 PCR 제품을 생성. : 또는 복제 단계를 방지하기 위해, 하나는 게놈 DNA 또는 cDNA T3 T7, 또는 5 '극단에서 SP6 시퀀스 (예 : T7을 포함 oligonucleotides를 사용 PCR 증폭을 수행 할 수 있습니다5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '; T3 : 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; SP6 : 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '). 선형 PCR 제품은 다음 실행 - 오프 적절한 효소 (그림 1B)와 체외 스크립트에 의해 해봐 - 라벨 감각이나 안티센스 RNA 프로브를 만들기 위해 템플릿으로 사용됩니다. 특정 유전자에 대한 프로브를 할 때, 우리는 생선 신호 특이성 (예 : 관심의 유전자가 안티센스 방향으로 베꼈하지 않는 한 평가에 도움이 될 것입니다 별개의 polymerases를 사용하여 감각 안티센스 RNA 프로브를 모두 준비하는 것이 좋습니다, 감각 RNA 프로브가 표시됩니다 배경 신호의 레벨). 다음 단계의 모든에서는, (예 : 물, 먼저 70 %의 에탄올 또는 상업적 RNAse의 오염 제거 솔루션으로 모든 벤치 공간과 장비를 청소하고 RNAse 무료 물자를 사용하여 오염 ribonucleases (RNAses)에 의해 잠재적 인 저하를 방지하기 위해 큰주의를 기울여야한다 팁, microcentrifuge 튜브).
엄마terials
- 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 (Abgene, 로체스터, NY, USA 고양이. 번호 0900)
- 젤 - 추출 키트 (QIAGEN, Mississauga, ON, 캐나다,. 고양이 번호 28706).
- RNAse 무료 물 (Wisent 주식회사 고양이. 번호 809-115-CL)
- RNA의 polymerases (T3 T7, 또는 SP6). (20 U / μl, Fermentas Biosciences. 고양이. 번호 EP0101, EP0111, EP0131).
- RNAse-OUT Ribonuclease 억제제 (40 U / μl), (Invitrogen, 버 링턴. Canada.Cat. 번호 10777-019 ON).
- Digoxigenin (파) 염기 믹스 (파-11-UTP, 로슈 응용 Biosciences, 라발, QC, 캐나다. 고양이. No.11209256910).
장비
- 테이블 상단 마이크로 원심 분리기
- 젤 - 전기 장치
- PCR은 게놈 DNA, cDNA, 또는 박테리오파지 T7, T3 또는 SP6 발기인 시퀀스으로 둘러싸인 선형 PCR 제품을 생성하는 플라스미드 DNA로부터 유전자 특정 순서를 증폭. PCR 조건에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오.
- 품질과시 확인아가로 오스 겔 전기 영동하여 PCR 제품의 ZE. 추천을 생산하고 버퍼 50 μl에 제품을 elute에 따라 표준 젤 추출 키트를 사용 소비세 및 정화 PCR 제품입니다.
- 3M의 아세트산 나트륨 (산도 5.2)과 얼음 차가운 100 % 에탄올 150 μl의 5 μl를 추가하여 PCR 제품을 침전하고, -70 ° C 하룻밤에 튜브를 놓습니다. 4 ° C에서 10 분 동안 13,000 XG에서 튜브를 원심 분리기와 70 %의 에탄올과 펠렛을 씻는다. 다시 돌려, 에탄올과 공기 펠렛을 건조의 모든 흔적을 제거합니다. RNAse 무료 물 25-50 μl에 Resuspend.
- 10X T7 스크립트 버퍼 2 μl (Invitrogen), RNAse 억제제, 2 μl 해봐 - NTP 믹스 1 μl (20 U / μl) : 다음과 같이 20 μl 반응 200-500 NG 정화 PCR 제품을 사용 파 - 라벨 프로브를 고쳐 쓰다 , 2 μl T7 RNA 중합 효소의 (20 U / μl). RNAse 무료 물을 20 μl로 최종 볼륨을 가져와. 3-4 시간에 37 ° C에서 전사 반응을 품다.
- transc을 조정RNAse 무료 물을 50 μl로 ription 믹스와는 4 단계에서 설명 해봐 - 라벨 RNA 프로브를 침전. RNAse 무료 물 100 μl에 씻은 RNA 펠렛을 Resuspend. -70 ° C.에 resuspended 샘플을 저장
- nanodrop 분광 광도계를 사용하여 프로브를 수량화. 프로브 품질을 확인하려면 ethidium 브로마이드와 1~2% 아가로 오스 겔 스테인드에 1-2 μl 샘플을 실행합니다.
2. Drosophila의 배아의 수집 및 고정
개요 :이 섹션은 무대 Drosophila의 배아를 수확 및 처리를 위해 단계를 설명합니다. 필요한 배아의 수에 따라 파리는 다양한 크기의 인구 케이지 유지 될 수 있습니다. 컬렉션은 100mm 사과 주스 수집 플레이트를 사용하여 900cm 3 원통형 새장을 사용하여 수행을위한 다음 단계는 다음과 같습니다. 적절한 고정은 배아를 둘러싼이 보호 층의 제거를 필요 바깥 쪽 융모막과 내부 vitellin전자 막 13. 일단 수확, 태아가 처음 융모막을 제거 할 수있는 50 % 표백제 용액에 목욕 있으며, 그때는 헵탄 (vitelline 막을 permeabilizes) 및 PBS는 3.7 %의 포름 알데히드를 포함하는를 포함하는 biphasic 솔루션에 혼합되어 있습니다. vitelline 막 나서 금과 헵탄과 메탄올의 biphasic 혼합으로 배아를 전송하여 제거됩니다. 적절한 배아 고정 및 vitelline 막 제거는 하류 물고기 절차의 성공을 위해 중요합니다.
자료
- 사과 주스 허름한 크기의 효모 붙여 넣기와 한천 플레이트 (40 % 사과 주스, 4 %의 자당, 3.5 %의 한천, 0.3 % 메틸 paraben) (베이커의 효모는 버터의 일관성을 물과 혼합)
- 가루 paraformaldehyde (전자 현미경 과학, 하트 필드, PA, USA,. 고양이 번호 19208)
- 헵탄
- 메타놀
- 3 % 표백제 솔루션
- 20 ML 유리 병 섬광 (캐나다, ON 열 피셔 과학, 오타와,,. 고양이 번호 03-337-15).
장비
- 인구 케이지
- 컬렉션 바구니 (Nitex 메쉬와 구멍이 뚜껑으로 잘라되었습니다 된 컷 50 ML의 폴리 프로필렌 튜브의 상단 부분을 사용하여 만든).
- 작은 페인트 브러시
- 표 상단 소용돌이
- 25 1 시간을위한 신선한 사과 주스 / 효모 판으로 미리 명확 잘 자란 인구 케이지 ° C.
- 초기 단계의 배아를 수확하기 위해 케이지에 새로운 사과 주스 / 효모 판을 추가합니다. 25 4 시간의 새장을 길러 ° C (수집 시간이 원하는 단계에 따라 조절 될 수 있다는주의).
- 3.7 g의 paraformaldehyde 가루, 2N 코 70 μl, 그리고 화학 후드 아래에 유리 섬광 병에 milliQ 물 7.3 ML를 결합하여 새로운 37%의 포름 알데히드 용액을 준비한다. paraformaldehyde 분말이 완전히 용해 될 때까지 새로운 섬광 유리 병에 실내 온도와 필터 그리고 시원한 솔루션을 끓일.
- 하여 biphasic 고정 솔루션을 준비다음 헵탄의 7.5 ML를 추가, 섬광 유리 병 37 %의 포름 알데히드 250 ML에 1X PBS의 2.25 ML을 결합.
- 케이지에서 사과 주스 판을 수확하고 객실 온도 수돗물의 비트를 추가하고 섬세 페인트 브러시와 함께 접시에서 배아를 닦고하여 배아를 수집합니다. 바구니에 resuspended 배아를 전송하고 미지근한 수돗물로 씻어.
- 표백제 용액에서 컬렉션 바구니를 수영 90 초 동안 Dechorionate 배아는 다음 미지근한 수돗물 (표백제 냄새가 사라질 때까지)로 철저하게 린스.
- 수집 바구니를 분해, 부드럽게 붓을 사용하여 배아를 수집하고 biphasic 고정 솔루션으로도 양도 할 수 없습니다. 배아는 PBS와 헵탄 층 사이의 인터페이스에서 축적됩니다.
- 인감 섬광 튜브와 와류 믹서에 고정. 가장 낮은 설정을 20 분 동안 흔들어.
- 제거하고 파스퇴르 피펫을 사용하여 낮은 PBS와 상부 헵탄 단계의 대부분을 폐기합니다. 대기음피펫에 남아있는 PBS / 헵탄 / 배아 혼합물. dropwise 패션에서 배아를 제거하지 돌보는, 피펫에서 낮은 PBS 단계를 폐기하십시오. 500 μl 헵탄의 biphasic 솔루션 (상위 단계), 500 μl 메탄올 (낮은 단계)이있는 1.5 ML 튜브로 배아를 입금.
- vitelline 세포막을 자극 30-45 초를 위해 손으로 힘차게 튜브를 흔들어. 일단 금이 간, 배아는 메탄올로 가라 앉을 것입니다.
- 헵탄 / 메탄올의 계면에서 상단 헵탄 위상 및 uncracked 배아를 폐기하고, 메탄올 500 μl를 추가합니다. 5 초에 흔들어.
- 메탄올로 3 회 씻고 -20 ° C (이 시점에서 배아는 주 / 개월 동안 저장 될 수있다)에있는 배아를 저장합니다.
3. 후 고정 처리, 하이브리드 및 사후 하이브리드 세차
개요 : 생선이 절 세부 배아 permeabilization에 대한 처리 단계 이전에, 사전 하이브리드,RNA 프로브 및 사후 하이브리드 세차와 하이브리드. 초기 permeabilization 단계의 경우 배아는 단일 관 (단계 아래 1-9, 정착 태아 / 샘플의 10-15 μl를 목표로)에 수영장으로 처리되지만, 그들은 96 - 웰 PCR 플레이트의 개인 우물에 aliquoted 아르 사전 하이브 리다이 제이션 단계 (아래 10 단계)로 진행하기 전에. 이 실험의 초기 단계에있는 모든 배아의도 치료를 보장하는 데 도움이됩니다. 물고기 실험을 설정하면 각각의 실험에서 배경 신호의 레벨을 결정하기 위해 부정적인 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 이를 위해, 우리는 섹션 1, 일반적으로 '노 프로브'조건에 필적하는 신호를 제공합니다 '의미'RNA 프로브와 hybridized 샘플에 명시된 바와 같이 '노 프로브'샘플을 포함시키는 것이 좋습니다합니다.
자료 :
- 메타놀
- 인산염은 0.1 % 십대 초반 - 20 (PBT)와 염분 버퍼
- Proteinase-K 1 MG / ML 주식 솔루션 (시그마 알드리치, 옥빌, ON, 캐나다. 카탈로그 번호 P2308)
- 글리신 (20 MG / ML 주식 솔루션)
- 하이브리드 솔루션 : 50 % 포름 아미드, 5 배 SSC, 0.1 % 십대 초반 - 20 빠졌어 연어 정자 DNA의 100 G / ML, 100 μg / ML 헤파린.
- 0.2 ML 96 - 잘 PCR 플레이트, Abgene, 로체스터, NY, USA 고양이를 halfskirted. 0900 없음) 없음
장비
- 56 조정 하이브 리다이 제이션 오븐, 디지털 가열 블록이나 물 목욕 ° C, 80 ° C 또는 100 ° C, 또는 PCR 기계.
- 멀티 채널 pipettors (세정 단계를 단순화하는 것이 좋습니다)
- 믹서를 Nutating
- PBT에 두 번 한 후 PBT, 그리고 : 메탄올의 1:1 혼합물에 다음 메탄올에 배아를 씻어.
- PBT는 nutator에 일정한 흔들와 3.7 %의 포름 알데히드를 (11 단계에 설명 된대로 신선하게 조리 된) 포함 1 ML의 20 분의 배아를 해결했습니다.
- PBT에서 2 분 흔들면서 3 번 배아를 씻으십시오.
- 3 μg / PBT에 희석 proteinase K (PK)의 ML의 솔루션을 준비하고 추가샘플에 대한 솔루션 500 μl. 흔들림없이 실내 온도에서 10 분에 샘플을 품다. 피펫으로 분사하거나 부드럽게 반전 튜브의 배아마다 2 분을 섞는다.
- 1 시간에 얼음 배아 샘플을 전송합니다.
- 실내 온도에 샘플을 이동 PK 솔루션을 제거합니다. PBT + 2 밀리그램 / ML 글리신의 1 ML과 2 분에 2 번 씻으십시오.
- 요동와 PBT + 3.7 %의 포름 알데히드의 1 ML에 샘플 20 분 문제를 해결했습니다. 태아에게 PBT 5 번 씻어.
- PBT 및 Hyb 솔루션의 1:1 혼합물의 1 ML과 배아를 씻어. 백퍼센트 Hyb 솔루션 (이 단계에서 배아는 -20 ° C에서 몇 일 / 주 동안 저장 될 수 있습니다)의 0.5-1 ML로 대체합니다.
- 96 - 웰 플레이트 (/ 잘 배아 손상을 방지하기 위해 폭 넓은 조리개 팁을 사용하는데주의를 기울여야 해결 배아의 ~ 10-15 μl를위한 목표)의 각 우물에 나누어지는의 배아.
- 5 분을위한 얼음에 시원 후 5 분에 있고 Hyb 솔루션 100 μl / 샘플을 끓일. 이 솔루션은 (사전 Hyb) 샘플 사전 하이브 리다이 제이션에 사용됩니다.
- 사전 Hyb 솔루션 100 μl / 샘플을 추가하고 56에서 최소한 2 시간에 품다 ° C.
- 각 샘플을 보려면 Hyb 솔루션 100 μl에 프로브의 ~ 100 NG를 희석. 80 예선 5 분 (온수 프로브는 몇 시간 동안 얼음에 보관하실 수 있습니다)에 얼음 이후 쿨 3 분에 대한 ° C.
- 배아에서 사전 Hyb 솔루션을 제거하고 RNA 프로브 솔루션으로 교체하십시오.
- 12-16 시간에 56 ° C에서 잡종을 만들다.
- 56에서 사전 따뜻하고 다음 세척 솔루션 ° C : (A) 200 Hyb 솔루션의 μl / 샘플 (B) Hyb의 3시 1분 혼합의 100 μl / 샘플 : PBT,의 (C) 100 μl / 샘플 Hyb의 1시 1분 혼합 : PBT, (D) Hyb의 1시 3분 혼합의 100 μl / 샘플 : PBT (E) PBT 400 μl / 샘플.
- 세탁 솔루션 100 μl와 함께 샘플을 씻어 후 15 분마다 56의 솔루션 AD 100 μl / 샘플과 세척 단계 ° C를 수행합니다. 그런 다음, 56 ° C.에서 솔루션 E의 100 μl / 샘플 5 분에 샘플 4 번 씻어
- 실내 온도에 차가운 샘플.
개요 :이 섹션은 RNA 프로브 신호 다음 하이브 리다이 제이션의 분포를 감지하고 시각화하는 데 사용되는 항체를 검출 시약을 설명합니다. 이 단계는 그림 2에 개략적으로 설명되어 있습니다. 여기 우리는 강력한 신호 증폭에 사용하는 표준 검출 시약 만 제시하지만, 단백질 RNA 두 번에 동시에 서로 다른 RNAs를 공동 감지 두 번 생선 실험을 수행 할 때 특히 다양한 대안으로 사용할 수 있습니다 상업적으로 이용 가능한 시약을 존재 착색. 이 프로토콜로 얻어진 결과의 예는 그림 3의 mRNA 표현 / 현지화 패턴 모자이크에 표시됩니다.
자료
- HRP-복합 마우스 단클론 항 파 (잭슨 ImmunoResearch 연구소 주식회사 고양이. 번호 200-032-156)
- 비오틴 - 복합 마우스 단클론 항 파 (잭슨 ImmunoResearch 연구소 주식회사 고양이. 번호 200-062-156)
- Streptavidin-HRP 공액 (분자 프로브, 유진 OR, USA, 고양이. No.S991)
- Cy3-tyramide의 conjugates (Perkin 엘머 생명 과학, 보스톤, MA, 미국, 고양이. 번호 SAT704A)
- DABCO이 솔루션을 설치 : 50 ML 튜브에 DABCO의 1.25 g 희석 (1,4-diazabicyclo [2.2.2] 옥탄을, 시그마 D-2522) 완전 할 때까지 1X PBS의 15 ML에 한 다음 35 글리세롤의 ML와 혼합을 추가 균질. PBS로 premixing으로 DABCO 분말은 매우 신속하게 용해된다. -20 ° C.에 상점 장착 솔루션
- 유리 슬라이드, coverslips
장비
- 믹서를 Nutating
- 멀티 채널 pipettor
- 형광 현미경
- PBT를 포함하는 PBTB 솔루션 + 1 % 비 지방 건조 우유를 (보통 50-100 ML 모든 검색 시약 보육 및 세정 단계 충분합니다) 준비합니다.
- nutator에 흔들하면서 100 μl PBTB / 샘플의 온도는 실온에서 10 분 동안 샘플을 차단합니다. <리> 락 100 μl / 샘플 단클론 비오틴 안티 - 파 항체 솔루션 (PBTB에 혈통이 4백분의 1을 희석)로 실온에서 1.5-2 시간에 태아 및 배양 샘플에서 차단 솔루션을 제거합니다.
- 각 흔들 100 μl PBTB / 샘플 5 분에 샘플 6 번 씻으십시오.
- 락과 streptavidin-HRP 솔루션 (PBTB, 10 μg / ML 최종 농도 혈통 1백분의 1을 희석)의 75 ML / 샘플 실온에서 1.5 시간을 품다.
- 샘플 씻어 5 분 6 번 흔들어 (DNA의 counterstaining에 대해 PBTB의 1X 작업 농도에 DAPI를 희석하고 첫 번째 세척 단계에서이 솔루션을 사용) 100 μl PBTB / 샘플.을
- PBT와 배아를 씻어 후 PBS로 5 분을 위해 2 번을 씻는다.
- Cy3-tyramide 솔루션 (Tyramide 증폭 버퍼에 50분의 1 희석)의 50 μl / 샘플과 nutator에 실온에서 2 시간 동안 샘플을 품다. 에서이 단계에서, 밝은 차폐 소켓에 샘플을 보관해야합니다. <이/ 리>
- 5 분마다 nutator에 100 μl PBS / 샘플과에 샘플 6 번 씻으십시오.
- PBS를 제거하고 70 % 글리세롤 및 2.5 % (DABCO)를 포함 장착 솔루션의 100-125 μl / 샘플을 추가 할 수 있습니다. 스토어 샘플 4에 ° C. 이 샘플은 몇 년 동안 저장 될 수 있습니다.
- 넓은 보어 팁을 사용하여 부드럽게 샘플을 pipetting하여 배아를 resuspend과 유리 슬라이드로 배아의 25 μl를 전송 한 후 손톱 폴란드어와 슬라이드로 배아 및 인감 이상 coverslip를 놓습니다.
- 형광 현미경을 사용하여 배아 샘플을 분석합니다.
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Representative Results
성공적으로 수행되면,이 절차는 초기 Drosophila의 embryogenesis 동안 유전자 발현 및 mRNA의 현지화 역학의 spatio - 시간적 분석의 상세 놀랍도록 향상된 수준을 제공합니다. 클래식 쌍 - 규칙 유전자 꼬마 (실행)를도 3a에 도시 된 바와 같이 실제로, 하나는 핵을 표현 그룹의 초기 스크립트 foci의 검출을 통해 유전자 발현 이벤트를 관찰 할이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 또한, 그림의 3B의 배아 모자이크에 도시 된 바와 같이, 상기 방법은 높은 해상도의 mRNA의 현지화 기능의 시각화 할 수 있습니다.
1 그림. RNA 프로브 준비 절차의 개요. 체외 전사 쓰겠다고에 의해 해봐 - 라벨 RNA 프로브를 합성에 대한 전략 (A) 개략도GA 선형의 DNA 템플릿은 박테리오파지 RNA의 효소 프로모터 요소와 둘러싸인. (B) 표준 1퍼센트 아가로 오스 겔은 히스톤 h2a, 실행 및 문서 transposon의 RNAs를위한 체외 베꼈 RNA 프로브에서의 예를 보여주는 그림. 우리는 일반적으로 PCR 템플릿 및 RNA 프로브 모두 나란히 전기 영동을 수행합니다. RNA는 일반적으로 템플릿에 비해 높은 이동성과 강렬한 분리 된 밴드로 표시
그림 2. 물고기 방법에 프로브 감지 단계의 개략도. 처리 배아에 대한 프로브 하이브 리다이 제이션 후는, 해봐 - 라벨 프로브 그런 다음 HRP-복합 streptavidin에 complexed되는 biotinylated α-해봐 항체를 사용하여 인식하고 있습니다. Tyramide 신호 증폭 (TSA)은 다음 자유 래디칼의 형태의 t에 tyramide 시약의 변화의 결과로 수행됩니다hrough HRP의 활동합니다. Transiently 반응 tyramide 자유 래디칼은 covalently 프로브 위치에서의 확산을 멀리 방지 인근 단백질의 아로마 잔류 물에 바인딩. tyramide 기판은 형광 현미경에 의해 감지 할 수 있습니다 형광 염료에 complexed 수 있습니다.
그림 3. Drosophila의 배아에서 mRNA의 표현과 subcellular 지방화 패턴의 다양성을 강조이 물고기 절차를 사용하여 얻은 결과의 예. (A) embryogenesis의 독특한 단계에서 실행 쌍 - 규칙 유전자의 물고기 분석 중반 부분에 어떻게 초기 폭 넓은 표현을 나타 배아 단계에서 배아 중 4 나중에 단계에서 분할 스트라이프 패턴으로 세련되어 있습니다. (B) 생선 결과의 모자이크 묘사는 mRNA의 localizatio의 다른 종류를 표시단계 4-7 배아의 N 패턴. 생선은 biotinylated 방지 해봐 항체, streptavidin-HRP와 Cy3 tyramide과 연속 incubations에 의해 hybridized와 발견되었습니다 해봐 - 표시 안티센스 프로브를 사용하여 수행되었습니다. RNA = 파란색, DNA = 붉은 색. 의 스케일 바 (A) = 25 μM, 그 동안의 (B) = 50 μM.
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Discussion
프로브 합성 단계의 경우, 우리는 일반적으로 Drosophila 유전자 컬렉션 (DGC), 다음 웹 사이트에서 설명하는 자원에서 발견 plasmids의 증폭 전체 길이 Drosophila의 cDNAs에서 체외 스크립트에 의해 실행 - 오프 안티센스 RNA 프로브를 생성 : http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 페이지 14,15. 이 접근 방식은 플라이 배아 9,16의 매핑 유전자 표현과 mRNA의 현지화 패턴을 대상으로 대규모 틱 연구에서 널리 사용되었습니다. DGC의 plasmids은 Drosophila 게놈 자원 센터 (주문하실 수 있습니다 https://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/ ). 자료를 시작하고 T7, SP6, 또는 T3 overhangs 사용자 정의 프리 머를 설계의 유연성은 특정 mRNA의 isoforms (예 : 대안 spliced 변형) O를 감지 한 쉽게 프로브를 생성 할 수 있습니다R 비 코딩 표준 cDNA 모음에 표시되지 않습니다 RNAs 있습니다. 디자인 이소 형 특정 프로브를 고려할 때, 우리는 250-1,000 기지에 이르기까지 템플릿 뛰어난 생선 결과를 얻을 수 있다는 것을 발견했습니다.
플라이 배아에서 물고기를 들어, 탄산 처리에 의해 조각의 프로브를하지 않으며 우리는 500-5,000 기지 사이의 크기로 다양 전체 길이 실행 - 오프 스크립트를 사용합니다. 대형 프로브에 덜 투과성 않은 다른 조직에 생선을 수행 할 때, 분할 참 프로브 침투를 선호 할 수 있습니다. 그러나, 우리는 작은 PCR-증폭 DNA 템플릿을 사용하여 프로브를 준비하거나, 여러 개의 개별적으로 합성 작은 프로브를 풀링보다는 변수 결과를주고 전체 프로브의 품질을 줄일 수 큰 프로브의 화학 조각을 수행 할 수있는 옵션을 선호합니다.
배아 수집 단계에 설명한 바와 같이, 우리는 일반적으로 배아 컬렉션 판에 효모 붙여 넣기를 추가합니다. 효모 붙여 넣기가 크게됩니다계란 생산 영양 환경 17에 따라 달라집니다로, 파리에서 알을 낳고의 수를 늘리십시오. 또한, Drosophila의 파리가 자주 직접 효모 붙여 넣기에 자신의 알을 낳는 것입니다. 이 배아는 쉽게 작은 페인트 브러시를 사용하여 물에 붙여 넣기 효모를 해산하고 수집 바구니를 통해 혼합물을 전달하여 수집 할 수 있습니다. dechorionation 단계, 물과 상업 표백 (일반적으로 6 % 농도) 1:1 diluting하여 준비 3 %의 표백제 솔루션, 대부분의 프로토콜 13,18,19에서 사용됩니다. 우리의 경험에서, 우리는 90 초 동안 3 %의 표백제 용액으로 배아를 잠복기하는 효율적인 dechorionation을 제공하는 것으로 확인되었습니다. 이 매개 변수는 사용할 수있는 상용 표백 솔루션에 따라 조정해야 할 수도 있습니다,하지만 이번이 샘플을 손상시킬 수 있기 때문에 하나는 표백제로 배아를 지나치게 노출하다하지주의를 기울여야한다. 더 자세히 dechorionation 절차를 모니터링하려면, 그것은 현미경 t에서 배아 살펴 할 수 있습니다O는 dechorionation 반응이 완료 있는지 확인 그들이 dechorionated 때 태아가 자신의 등쪽 부속을 잃게 즉. 기존 솔루션 침전물 경향으로 마지막으로, 적절한 배아 고정을 보장하기 위해, 우리는 신선하게 조리 된 포름 알데히드 솔루션을 사용합니다. 자세한 참조를 들어,이 절차는 이전 방법 기사 13,18,19에 설명되어 있습니다.
proteinase K, 또는 항체를이 프로토콜에 설명 된 dilutions을 사용하여 Cy3-Tyramide, 우리가 발견 한 최적의 결과로 검출 시약과 배아 조직의 permeabilization에 관한 단계. 그러나, 실험실 환경과 시약 주식의 변화로 인해, 우리는 각각의 연구실은 경험적으로 자신의 특정 요구에 가장 적합한 작업 농도를 결정하기 위해 자신의 시약을 테스트하는 것이 좋습니다. 또한, 우리는 최적의 시약 농도는 분석 조직에 따라 다를 수 있습니다 발견했습니다.
그 물고기 절차를 보장하기 위해 전s이 (가) 지속적으로 재현 결과를 제공, 우리는 항상 잘 정의 된 표현 / 현지화 패턴 (예 : 실행)와 스크립트에 대한 프로브를 포함 할 수있는 분석에 여러 가지 긍정적 인 컨트롤을 추가하는 것이 좋습니다. 초기 Drosophila의 embryogenesis 동안 인상적인 mRNA 현지화 패턴과 성적은 플라이 피쉬 웹 사이트 (에서 확인하실 수 있습니다 http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca/ ). 반대로, 위에서 언급 배경 신호 감지를위한 제어 할 수 하나는 '노 프로브'및 / 또는 감각 RNA 프로브 샘플을 포함해야합니다.
이 프로토콜에 설명 된 Cy3 tyramide의 공액뿐만 아니라, 여러 가지 빛깔의 영상 실험에 대한 추가 유연성을 제공 할 수 있습니다 Perkin 엘머 생명 과학이나 분자 프로브 (Invitrogen, 캐나다, Inc의)에서 다른 상업적으로 이용 가능한 fluorochrome - 복합 tyramide 시약의 다양한 있습니다 . 이 방법은 우리의 기본 proced을 설명하는 동안단일 RNA의 생선,이 방법의 변형에 대한 우레는 이러한 이중 RNA 물고기 나 RNA-단백질 공동 감지와 같은보다 복잡한 실험을 위해 구현 될 수있다. 이러한 절차에 관한 자세한 내용은, 우리는 기존의 생선 방법 서류 18-20에 설명 된 절차에 따라하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
Lécuyer 실험실에서 실시 작품은 국립 과학 캐나다의 공학 협의회 (NSERC), 건강 연구 (CIHR)와 Fonds 드 공들인 실내 Santé 뒤 퀘벡 (FRSQ)의 캐나다 연구소에서 자금을 지원합니다. 캐롤 Iampietro는 안젤로 Pizzagalli 박사 교제를 지원하는 동안 파비오 알렉시스 Lefebvre와 게일 Moquin - Beaudry은 NSERC 학부 연구 studentships에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
References
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