Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hele Mount RNA Fluorescent Published: January 30, 2013 doi: 10.3791/50057
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), 2Department of Biochemistry, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en hel-mount fluorescerende

Abstract

Assessing uttrykket mønster av et gen, samt subcellulære lokalisering egenskaper av sine transkriberte RNA, er sentrale funksjoner for å forstå den biologiske funksjon under utvikling. RNA in situ hybridisering (RNA-ISH) er en kraftig metode som brukes for å visualisere RNA distribusjon egenskaper, det være seg på organismebiologi, mobil eller subcellulære nivå 1. RNA-ISH er basert på hybridisering av en merket nukleinsyresonde (f.eks antisens RNA, oligonukleotider) komplementær til sekvensen av en mRNA eller en ikke-kodende RNA mål av interesse 2. Som prosedyren krever primære sekvensen informasjon alene å generere sekvensspesifikke prober, kan den være universelt anvendt til et bredt spekter av organismer og vevsprøver 3. Faktisk har en rekke store ISH studier er gjennomført for å dokumentere genuttrykk og RNA lokalisering dynamikk i ulike modellorganismer, som har ført tiletablering av viktige samfunnets ressurser 4-11. Mens en rekke probe merking og gjenkjenning strategier har blitt utviklet gjennom årene, kombinert bruk av fluorescently-merket deteksjon reagenser og enzymatiske signalamplifikasjon trinn gi betydelige forbedringer i følsomhet og oppløsning av prosedyren 12. Her beskriver vi en optimalisert fluorescerende in situ hybridisering metode (FISH) ansette tyramide signal forsterkning (TSA) for å visualisere RNA uttrykk og lokalisering dynamikk i iscenesatt Drosophila embryo. Prosedyren utføres i 96-brønns PCR-plate-format, som i stor grad letter den samtidige behandling av et stort antall prøver.

Protocol

1. RNA Probe Forberedelse

Oversikt: Følgende avsnitt beskriver trinn for trinn hvordan Digoxigenin (Dig)-merkede RNA prober egnet for fisk. Det første trinnet omfatter kloning eller PCR amplifisering av en sekvens som korresponderer til den transkriberte regionen av et gen av interesse som skal bli brukt for å generere en sekvens-spesifikk probe. Dette kan oppnås ved først å klone gensegment i et plasmid hvori multippel kloningssete er flankert av bakteriofag promoter elementer (T7, T3 eller SP6), som deretter kan tjene som en mal for PCR ved anvendelse av flankerende primere som inneholder de promoter sekvenser , og dermed generere en lineær PCR produkt med ulike promoter sekvenser på hver ekstremitet (figur 1A). Alternativt, for å unngå den kloning trinnet, kan man også utføre PCR forsterkning fra genomisk DNA eller cDNA med oligonukleotider som inkluderer T7, T3 eller SP6 sekvenser ved deres 5 'ekstremiteter (f.eks T7:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '; T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; SP6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '). De lineære PCR produktene blir deretter brukt som maler for å gjøre Dig-merket forstand eller antisens RNA prober ved avrenning in vitro transkripsjon med riktig polymerase (figur 1B). Når du gjør prober for spesifikke gener, anbefaler vi forbereder både forstand og antisens RNA sonder bruker distinkte polymeraser, som vil være nyttig for å vurdere fiskeekkoet spesifisitet (dvs. mindre genet av interesse er transkribert i antisens orientering, vil den forstand RNA sonde avsløre bakgrunnsstøy-signal). I alle de følgende steg bør man ta stor forsiktighet for å unngå potensiell nedbrytning av forurensende ribonucleases (RNAses) ved først å rense alle benk områder og utstyr med 70% etanol eller kommersielle RNase dekontaminering løsninger og ved å bruke RNase-frie forsyninger (f.eks vann, tips, mikrosentrifugerør).

Materials

  • 1,5 ml mikrosentrifugerør, (Abgene, Rochester, NY, USA Cat. No 0900)
  • Gel-utvinning kits (QIAGEN, Mississauga, ON, Canada,. Art.nr. 28706).
  • RNase gratis vann (Wisent, Inc. Kat. Nr 809-115-CL)
  • RNA polymeraser (T7, T3 eller SP6). (20 U / ul, Fermentas biovitenskap. Kat. EP0101 No EP0111, EP0131).
  • RNase-OUT ribonuklease hemmere (40 U / ul), (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. Nei 10777-019).
  • Digoxigenin (DIG) nukleotid blandinger (DIG-11-UTP, Roche Applied biovitenskap, Laval, QC, Canada. Cat. No.11209256910).

Utstyr

  • Bordplaten mikro-sentrifuge
  • Gel-elektroforese apparat
  1. PCR forsterke gen-spesifikk sekvens fra genomisk DNA, cDNA, eller plasmid DNA til å generere en lineær PCR produkt flankert av bakteriofag T7, T3 eller SP6 promoter sekvenser. Følg produsentens anbefalinger for PCR forhold.
  2. Kontrollere kvaliteten og size av PCR produktet ved agarosegelelektroforese. Avgiftsdirektoratet og rense PCR-produkt med en standard gel-utvinning kit ifølge produserer anbefalinger og eluere produktet i 50 pl buffer.
  3. Utfelle PCR produktet ved å tilsette 5 ul 3M natriumacetat (pH 5,2) og 150 pl iskald 100% etanol, og plasser rørene ved -70 ° C over natten. Sentrifugerørene ved 13.000 xg i 10 min ved 4 ° C og vaske pelleten med 70% etanol. Spinne igjen, fjerne alle spor av etanol og luft tørk pellet. Resuspender i 25-50 pl RNase-fritt vann.
  4. Transkribere Dig-merket probe ved hjelp av 200-500 ng renset PCR-produkt i en 20 ul reaksjon som følger: 2 ul 10X T7 transkripsjon buffer (Invitrogen), 1 pl (20 U / ul) av RNase inhibitor, 2 ul Dig-NTP mix , og 2 ul T7 RNA polymerase (20 U / ul). Bring sluttvolumet til 20 ul med RNase-fritt vann. Inkuber transkripsjon reaksjonen ved 37 ° C i 3-4 timer.
  5. Juster transcription miks til 50 ul med RNase-fritt vann og utfelle Dig-merket RNA-probe som beskrevet i Trinn 4. Resuspender den vaskede RNA pelleten i 100 pl RNase-fritt vann. Oppbevar resuspenderte prøvene ved -70 ° C.
  6. Kvantifisere sonden med en NanoDrop spektrofotometer. Å verifisere sonden kvalitet, kjøre en 1-2 pl prøven på en 1-2% agarosegel farget med etidiumbromid.

2. Innsamling og Fiksering av Drosophila embryo

Oversikt: Denne delen beskriver fremgangsmåten for fangst og foredling iscenesatt Drosophila embryo. Avhengig av antall av embryoer som trengs, kan fluer bli opprettholdt i befolkningen merdene av ulike størrelser. Følgende trinn er for samlinger utføres med 900 cm 3 sylindriske bur med 100mm eple juice samling plater. Riktig fiksering krever fjerning av to beskyttende lag rundt embryoet: det ytre og det indre Chorion vitelline membran 13. Når de er høstet, embryoene blir først badet i en 50% blekemiddel å fjerne chorion, da de er blandet i en bifasisk oppløsning inneholdende heptan (permeabilizes den vitelline membran), og PBS inneholdende 3,7% formaldehyd. Den vitelline membranen blir deretter sprakk og fjernet ved overføring embryoene i en tofase-blanding av heptan og metanol. Riktig embryo fiksering og fjerning av vitelline membranen er kritisk for å lykkes med nedstrøms FISH prosedyren.

Materialer

  • Eple-juice agarplater (40% eplejuice, 4% sukrose, 3,5% agar, 0,3% metylparaben) med krone størrelse gjær lim (bakegjær blandes med vann til smør konsistens)
  • Pulverisert paraformaldehyd (elektronmikroskopi Sciences, Hatfield, PA, USA,. Art.nr. 19208)
  • Heptan
  • Metanol
  • 3% blekemiddel
  • 20 ml glass scintillasjonsglass (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada,. Art.nr. 03-337-15).

Utstyr

  • Befolkningen bur
  • Collection kurver (laget ved hjelp av en Nitex mesh og den øverste delen av et kutt 50 ml polypropylenrør i hvilken et hull er blitt kuttet i lokket).
  • Liten pensel
  • Bordplate vortex
  1. Pre-klare velfødde befolkningen bur med en frisk eplejuice / gjær plate for 1 time ved 25 ° C.
  2. Legg til en ny eplejuice / gjær plate til buret for å høste tidlig stadium embryoer. Inkuber buret for 4 timer ved 25 ° C (merk at samling ganger kan justeres avhengig av ønsket stadiene).
  3. Forbered en frisk 37% formaldehyd-løsning ved å kombinere 3,7 g paraformaldehyd pulver, 70 pl 2N KOH og 7,3 ml milliQ vann i et glass scintillasjonskyvette under en kjemisk hette. Kok løsningen inntil paraformaldehyd pulveret er fullstendig oppløst, deretter avkjøles til romtemperatur og filter inn ny scintillasjonskyvette.
  4. Utarbeide en bifasisk fiksering løsning vedkombinere 2,25 ml 1X PBS med 250 ml 37% formaldehyd i en scintillasjonskyvette, deretter legge 7,5 ml heptan.
  5. Høste eplejuice plate fra buret og samle embryoer ved å legge litt av romtemperatur vann fra springen og delikat børsting embryoene av platen med pensel. Overfør resuspenderte embryoer i en kurv og skyll med lunkent vann fra springen.
  6. Dechorionate embryoer for 90 sek ved bading samlingen kurver i blekemiddel, skyll grundig med lunkent vann fra springen (til blekemiddel lukten er borte).
  7. Demonter samling kurv, samle embryo forsiktig ved hjelp av en pensel og overføre dem inn i bifasisk fiksering løsning. Embryoene vil akkumulere ved grenseflaten mellom PBS og heptan lag.
  8. Seal scintillasjonsglass og fest til en virvelblander. Rist i 20 min på laveste innstilling.
  9. Fjern og kast de fleste av de nedre og øvre PBS heptan faser ved hjelp av en Pasteur-pipette. Aspirergjenværende PBS / heptan / embryo blandingen inn i pipetten. I en dråpevis mote, kast den nedre PBS fasen fra pipette, tar seg ikke å eliminere embryoer. Deponere embryoene i et 1,5 ml rør som inneholder en bifasisk oppløsning av 500 pl heptan (øvre fase) og 500 pl metanol (lavere fase).
  10. Rist rør kraftig for hånd i 30-45 sekunder for å knekke vitelline membraner. Gang sprakk vil embryoene synke inn i metanol.
  11. Kast den øvre heptan fase og uncracked embryoer på heptan / metanol interfase, og tilsett 500 ul av metanol. Rist i 5 sek.
  12. Vask 3 ganger med metanol og lagre embryoer ved -20 ° C (i dette punktet embryo kan lagres i uker / måneder).

3. Post-fiksering Processing, hybridisering og Post-hybridisering vasker

Oversikt: Denne delen beskriver behandlingen steg for embryo permeabilization før FISH, pre-hybridisering,hybridisering med RNA prober og post-hybridisering vasker. For de første permeabilization trinnene embryoene blir håndtert som et basseng i et enkelt rør (trinn 1-9 nedenfor, sikter for 10-15 ul bosatte embryoer / prøve), men de er alikvoteres i individuelle brønner på et 96-brønners PCR plate før du fortsetter med pre-hybridisering trinn (trinn 10 nedenfor). Dette bidrar til å sikre jevn behandling av alle embryoer i de innledende fasene av eksperimentet. Når du setter opp en fisk eksperiment, er det viktig å ta med negative kontroller for å bestemme nivået av bakgrunnssignal i individuelle eksperimenter. For dette anbefaler vi at du inkluderer et 'no-probe' prøve og, som nevnt i § 1, en prøve hybridisert med "fornuft" RNA probe, som typisk vil gi et signal sammenlignes med "no-probe" tilstand.

Materialer:

  • Metanol
  • Fosfatbuffret saltløsning med 0,1% Tween-20 (PBT)
  • Proteinase-K 1 mg / ml stamoppløsning (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Canada. Katalog No P2308)
  • Glycin (20 mg / ml stamoppløsning)
  • Hybridisering løsning: 50% formamid, 5X SSC, 0,1% Tween-20, 100 g / ml skåret laksesperm DNA, 100 ug / ml heparin.
  • 0,2 ml halfskirted 96-brønners PCR-plater, Abgene, Rochester, NY, USA Cat. No 0900)

Utstyr

  • Hybridisering ovn, digital varmeblokk eller vannbad justerbar til 56 ° C, 80 ° C eller 100 ° C, eller en PCR-maskin.
  • Multikanal pipetter (anbefalt å forenkle vasketrinnene)
  • Risteapparat
  1. Skyll embryoene i metanol, deretter i en 1:1 blanding av metanol: PBT, og deretter to ganger i PBT.
  2. Fest embryoene i 20 min i 1 ml av PBT inneholdende 3,7% formaldehyd (ferskt fremstilt som beskrevet i trinn 11) med konstant rocking på nutator.
  3. Vask embryoer for 3 ganger for 2 min i PBT mens rock.
  4. Forbered en oppløsning av 3 ug / ml proteinase K (PK) fortynnet i PBT og legge500 ul løsning til prøver. Inkuber prøvene i 10 minutter ved romtemperatur uten risting. Bland embryoer hver 2 minutter med jetting med en pipette eller ved forsiktig inverterende rørene.
  5. Overføre embryoer prøvene på is i 1 time.
  6. Flytt prøvene til romtemperatur og fjern PK løsning. Vask 2 ganger i 2 min med en ml PBT + 2 mg / ml glycin.
  7. Fix prøvene 20 min i 1 ml av PBT + 3,7% formaldehyd med vuggende. Skyll embryo 5 ganger i PBT.
  8. Skyll embryoer med 1 ml av en 1:1 blanding av PBT og Hyb løsning. Erstatte med 0,5-1 ml av 100% Hyb løsning (på dette trinnet embryoene kan lagres i flere dager / uker ved -20 ° C).
  9. Delmengde embryoer i enkelte brønner på et 96-brønners plate (mål for ~ 10-15 ul bosatte embryoer / godt, ta vare å bruke stor blenderåpning tips for å unngå å skade befruktede egg).
  10. Koke 100 pl / prøve av Hyb løsning i 5 minutter og deretter avkjøles på is i 5 min. Denne løsning anvendes for sample pre-hybridisering (Pre-Hyb).
  11. Tilsett 100 pl / prøve av Pre-Hyb løsning og inkuberes i minst 2 timer ved 56 ° C.
  12. For hver prøve fortynnes ~ 100 ng av probe i 100 mikroliter Hyb løsning. Varme ved 80 ° C i 3 min, deretter avkjøles på is i 5 min (oppvarmede sonder kan holdes på is i flere timer).
  13. Ta av Pre-Hyb løsning fra embryoer og erstatte med RNA probe løsning.
  14. Hybridisere ved 56 ° C i 12-16 timer.
  15. Forvarme følgende vask løsningene ved 56 ° C: (A) 200 ul / prøve av Hyb løsning, (B) 100 ul / prøve av en 3:1 blanding av Hyb: PBT, (C) 100 pl / prøve av en 01:01 blanding av Hyb: PBT, (d) 100 ul / prøve av en 1:3 blanding av Hyb: PBT, (E) 400 pl / prøve av PBT.
  16. Skyll prøver med 100 ul vaskeløsning A, deretter utføre vasketrinnet med 100 ul / prøve av løsninger AD ved 56 ° C i 15 minutter hver. Deretter vaskes prøvene 4 ganger i 5 min med 100 ul / prøve av oppløsning E ved 56 ° C.
  17. Kule prøvene til romtemperatur.

Oversikt: Dette avsnittet beskriver antistoffer og deteksjons reagenser brukes til å påvise og visualisere fordelingen av RNA sonde signalet følgende hybridisering. Disse trinnene er skissert skjematisk i figur 2.. Her vi bare presentere standard deteksjons reagenser som vi bruker for robust signalamplifikasjon, men det eksisterer en rekke kommersielt tilgjengelige reagenser som kan brukes som alternativer, særlig ved utføring dobbel FISH eksperimenter å co-detektere forskjellige RNAer samtidig for protein-RNA dobbelt farging. Eksempler på resultater oppnådd med denne protokollen vises i mRNA uttrykket / lokalisering mønster mosaikk i figur 3.

Materialer

  • HRP-konjugert monoklonalt anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. No 200-032-156)
  • Biotin-konjugert monoklonalt anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. Nei 200-062-156)
  • Streptavidin-HRP-konjugat (Molecular Probes, Eugene OR, USA, kat. No.S991)
  • Cy3-tyramide konjugater (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA, Cat. No SAT704A)
  • DABCO montering løsning: I en 50 ml rør, fortynn 1,25 gram DABCO (1,4-diazabicyklo [2.2.2] oktan; Sigma D-2522) i 15 ml 1X PBS, deretter legge 35 ml glycerol og bland til fullt homogen. Ved forblanding med PBS, blir DABCO pulveret oppløst meget raskt. Butikken monteringsløsning ved -20 ° C.
  • Glass-slides, dekkglass

Utstyr

  • Risteapparat
  • Multikanalpipette
  • Fluorescensmikroskop
  1. Forbered PBTB løsning inneholdende PBT + 1% ikke-fett tørrmelk (vanligvis 50-100 ml er tilstrekkelig for alle gjenkjennings reagens inkubering og vasketrinnene).
  2. Blokkere prøver i 10 minutter ved romtemperatur i 100 ul PBTB / prøve mens rock på nutator.
    3. <li> Fjern blokkering løsning fra embryoer og inkuber prøver for 1,5 til 2 timer ved romtemperatur med 100 ul / prøve det monoklonale biotin anti-DIG antistoff løsning (fortynnet 1/400 fra lager i PBTB) med rocking.
  3. Vask prøver 6 ganger i 5 min hver med 100 pl PBTB / prøven med rocking.
  4. Inkuber 1,5 time ved romtemperatur med 75 ml / prøve av streptavidin-HRP-løsning (fortynnet 1/100 fra lager i PBTB, 10 ug / ml endelig konsentrasjon) med vuggende.
  5. Vask prøver 6 ganger for 5 min hver 100 ul PBTB / prøve med rocking (for DNA kontrafarging, fortynne DAPI til 1X arbeidskonsentrasjon i PBTB og bruke denne løsningen i første vask trinn).
  6. Skyll embryoer med PBT, vask deretter to ganger i 5 min med PBS.
  7. Inkuber prøvene i 2 timer ved romtemperatur på nutator med 50 pl / prøve av Cy3-tyramide løsning (fortynnet 1/50 i Tyramide forsterkning buffer). Fra dette trinnet på, sørg for å holde prøvene i en lys skjermet kontakt. </ Li>
  8. Vask prøver 6 ganger i 5 min hver med 100 ul PBS / prøve på nutator.
  9. Fjern PBS og legg 100-125 pl / prøve av montering oppløsning inneholdende 70% glycerol og 2,5% (DABCO). Oppbevar prøver ved 4 ° C. Disse prøvene kan lagres i flere år.
  10. Bruke et bredt-boring spissen, resuspender embryoene ved å forsiktig pipettering av prøvene og overføre 25 pl av embryoer bort på et glass lysbilde, og deretter plassere et dekkglass over embryoer og tetningen på lysbildet med neglelakk.
  11. Analyser embryo prøver ved hjelp av en fluorescens mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når utført riktig, tilbyr denne prosedyren et påfallende økt nivå av detaljer i spatio-temporal analyse av genuttrykk og mRNA lokalisering dynamikk under tidlig Drosophila embryogenese. Faktisk, som vist i figur 3A for den klassiske paret-regelen genet runt (run), kan man bruke denne protokollen å observere genekspresjon hendelser via detektering av begynnende transkripsjon foci i grupper av uttrykke atomkjerner. I tillegg, som vist i embryo mosaikk i Figur 3b, gjør metoden visualisering av mRNA lokalisering funksjoner i høy oppløsning.

Figur 1
Figur 1. Omrisset av RNA probe forberedelse prosedyre. (A) Skjematisk fremstilling av vår strategi for å syntetisere Dig-merkede RNA prober ved in vitro transkripsjon usinga lineære DNA mal flankert med bakteriofag RNA polymerase promoter elementer. (B) Bilde av standard 1% agarose gel viser eksempler på in vitro transkriberte RNA prober for histone h2a, løpe og doc transposon RNAS. Vi vanligvis utføre en side-ved-side elektroforese av både PCR malen og RNA-probe. RNA vises vanligvis som en intens diskret bånd med høyere mobilitet sammenlignet med malen

Figur 2
Figur 2. Skjematisk representasjon av sonden detection trinnene i FISH metoden. Etter sondehybridisering til bearbeidet embryoer, er Dig-merkede prober gjenkjent ved hjelp av en biotinylert α-Dig antistoff, som deretter kompleksbundet til HRP-konjugert streptavidin. Tyramide signal forsterkning (TSA) er deretter utført resulterer i omformingen av tyramide reagens i fritt radikal form through aktiviteten av HRP. Forbigående reaktive tyramide frie radikaler kovalent binde til aromatiske rester av nærliggende proteiner, hindre deres diffusjon bort fra sonden plasseringen. Den tyramide substratet kompleksbundet til fluorescerende fargestoffer, som kan oppdages av fluorescensmikroskopi.

Figur 3
Figur 3. Eksempler på resultater oppnådd ved hjelp av denne fisken prosedyren fremheve mangfoldet av mRNA uttrykk og subcellulære lokalisering mønstre i Drosophila embryoer. (A) FISH analyse av paret-regelen genet kjøre på forskjellige stadier av embryogenese avslører hvordan den første brede uttrykk i midten delen av embryoet i fosterstadiet 4 er raffinert til et segmentert stripemønster i senere faser. (B) Mosaic skildring av fisk gir viser ulike varianter av mRNA localization mønstre i scene 4-7 embryoer. FISH ble utført ved hjelp Dig-merkede antisens sonder som ble hybridisert og oppdaget av sekvensielle inkubasjoner med biotinylert anti-Dig antistoff, streptavidin-HRP, og Cy3 tyramide. RNA = blå, DNA = rødt. Målestokk i (A) = 25 uM, mens den i (b) = 50 uM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For probe syntese trinn, vi vanligvis genererer avrenning antisens RNA prober ved in vitro transkripsjon fra full-lengde Drosophila cDNA'ene forsterket fra plasmider finnes i Drosophila Gene Collection (DGC), en ressurs detaljert på følgende nettside: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 14,15. Denne tilnærmingen har vært brukt mye i stor skala ISH studier med sikte på kartlegging genuttrykk og mRNA lokalisering mønstre i fly embryoer 9,16. DGC plasmider kan bestilles fra Drosophila Genomic Resource Center ( https://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/ ). Fleksibiliteten i å starte materialer og utforme tilpassede primere med T7, SP6 eller T3 overheng gjør det mulig å enkelt generere sonder for å oppdage spesifikke mRNA isoformer (f.eks alternativt skjøtes varianter) or ikke-kodende RNA som ikke er representert i standard cDNA samlinger. Når de vurderer utforme isoform-spesifikke prober, har vi funnet ut at maler alt fra 250-1,000 baser kan gi utmerket fisk resultater.

For fisk i fly embryoer, gjør vi ikke fragment våre prober ved karbonat behandling, heller vi bruker full lengde avrenning karakterutskrifter, som kan variere i størrelse mellom 500-5,000 baser. Når du utfører FISH på andre vev som er mindre gjennomtrengelig til store sonder, kan fragmentering faktisk favoriserer probe penetrasjon. Men vi foretrekker muligheten til å forberede sonder bruker mindre PCR-amplifisert DNA maler, eller gruppering flere individuelt syntetiserte små sonder sammen, snarere enn å utføre kjemiske fragmentering av store sonder som kan gi varierende resultater og redusert probe kvalitet.

Som beskrevet i embryo samling trinn, vi pleier å legge gjær lim til fosteret samling plater. Gjær lim vil sterktøke antallet egg lagt av fluene, som eggproduksjon avhenger ernæringsmessige miljøet 17. I tillegg vil Drosophila fluer ofte legge sine egg direkte i gjær lim. Disse embryoer kan lett samles ved å oppløse gjær lim i vann ved hjelp av en liten pensel og passerer blandingen gjennom en samling kurv. For dechorionation trinnet, en 3% blekemiddel, fremstilt ved å fortynne kommersielt blekemiddel (typisk 6% konsentrasjon) 1:1 med vann, brukes i de fleste protokollene 13,18,19. I vår erfaring, har vi funnet ut at inkubasjon embryoer med en 3% blekemiddel for 90 sek tilbyr effektiv dechorionation. Disse parametrene kan være nødvendig å justere avhengig av kommersielle blekemiddel løsning som er tilgjengelig, men man bør være varsom med å overeksponere embryoene å bleke siden dette kan skade prøvene. Å overvåke dechorionation prosedyren nærmere, er det mulig å se på embryoer under et mikroskop to sørge for at dechorionation reaksjonen er fullstendig, dvs. embryoene mister sine dorsal vedheng når de dechorionated. Endelig, for å sikre riktig embryo fiksering, bruker vi nylagde formaldehyd løsninger, som gamle løsninger tendens til utfelling. For ytterligere referanse, har denne prosedyren blitt beskrevet i tidligere metoder artikler 13,18,19.

For trinnene vedrørende permeabilization av embryonale vev med proteinase K, eller deteksjon reagenser slik som de antistoffer og Cy3-Tyramide, har vi funnet optimale resultater ved hjelp av fortynningene beskrevet i denne protokollen. Men på grunn av variasjoner i lab-miljøer og reagenser aksjer, anbefaler vi at hvert laboratorium empirisk teste sine egne reagenser for å bestemme de beste arbeidsbetingelser konsentrasjoner for deres spesifikke behov. I tillegg har vi funnet optimale reagenssammensetninger konsentrasjoner kan variere avhengig av vev som ble analysert.

For å sikre at fisken prosedyren is gi konsekvent reproduserbare resultater, anbefaler vi alltid å legge flere positive kontroller i analysen, som kan omfatte prober for utskrifter med veldefinert uttrykk / lokalisering mønstre (f.eks løp). Transkripsjoner med slående mRNA lokalisering mønstre i tidlig Drosophila embryogenese kan bli funnet på Fly-FISH nettsted ( http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca/ ). Omvendt, for å kontrollere for bakgrunnen signaldeteksjon, som nevnt ovenfor, bør man også inkludere 'no-probe "og / eller følelse RNA probe prøver.

I tillegg til den Cy3 tyramide konjugatet beskrevet i denne protokollen, er det en rekke av andre kommersielt tilgjengelige fluorokromkonjugerte konjugerte tyramide reagenser fra Perkin Elmer Life Sciences eller Molecular Probes (Invitrogen, Canada, Inc), som kan gi ytterligere fleksibilitet for flerfarget avbildning eksperimenter . Selv om denne metoden beskriver vår grunnleggende procedure for enkelt RNA FISH, varianter av denne metoden kan implementeres for mer kompliserte eksperimenter, som for eksempel dobbel-RNA FISH eller RNA-protein co-gjenkjenning. For detaljer vedrørende disse prosedyrene, anbefaler vi at du følger prosedyrene som er beskrevet i eksisterende FISH metoder papirer 18-20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Arbeid utført i LÉCUYER laboratoriet er støttet av midler fra National Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) og Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre og Gaël Moquin-Beaudry støttes av NSERC lavere forskning studentships, mens Carole Iampietro støttes av Angelo Pizzagalli postdoktorstipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T7, T3 or SP6 RNA Polymerase Fermentas Life Sciences EP0101,EP0111,EP0131 Kits contain reaction buffer.
DIG RNA Labeling Mix Roche Applied Science 11 277 073 910
RNAguard Amersham Biosciences 27-0816-01
3M sodium acetate
Cold 100% ethanol.
Cold 70% ethanol.
Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water.
Heptane
Methanol
proteinase K Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada Catalog No. P2308
40% formaldehyde solution, freshly prepared
PBS-Tween solution (PBT) 1xPBS, 0.1% Tween-20
Glycine solution 2 mg/ ml glycine in PBT
HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc 200-032- 156 (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB
HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG Roche Applied Science, Laval, QC 1 207 733 1/500 dilution of stock solution in PBTB
Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA 200-062-156 (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB
Streptavidin-HRP conjugate Molecular Probes, Eugene OR, USA S991 (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
  2. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
  3. Lecuyer, E., Tomancak, P. Mapping the gene expression universe. Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).
  4. Tomancak, P., et al. Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).
  5. Thisse, B., et al. Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening. Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).
  6. Quiring, R., et al. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
  7. Pollet, N., et al. An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis. Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).
  8. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  9. Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  10. Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, 1183-1187 (2006).
  11. Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos. Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).
  12. Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei. Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).
  13. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protoc. , (2007).
  14. Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).
  15. Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287, 2222-2224 (2000).
  16. Tomancak, P., et al. Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 3, (2002).
  17. Terashima, J., Bownes, M. Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 1711-1719 (2004).
  18. Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).
  19. Lecuyer, E. High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila. Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).
  20. Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846 (2004).

Tags

Developmental Biology cellebiologi molekylær biologi genetikk Genomics, Embryo fluoriserende FISH Gene Expression Pattern RNA Localization RNA Tyramide signalamplifikasjon TSA knockout bananflue hele mount embryogenesen dyremodell
Hele Mount RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Legendre, F., Cody, N., Iampietro,… More

Legendre, F., Cody, N., Iampietro, C., Bergalet, J., Lefebvre, F. A., Moquin-Beaudry, G., Zhang, O., Wang, X., Lécuyer, E. Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (71), e50057, doi:10.3791/50057 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter