Summary
우리는을 받게된다고?
Abstract
이 메소드는 테스트 동물 모델 쥐 에반스 블루의 정맥 주사를 기준으로합니다. 에반스 블루는 알부민 결합 염료입니다. physiologic 조건 내피는 알부민에 불 투과성이기 때문에, 에반스 블루 바운드 알부민 유적은 혈관 내에 제한. 증가 혈관 투과성 내피 세포를 촉진 pathologic 조건에서 부분적으로 자신의 가까이에 연락처를 잃게 내피는 알부민과 같은 작은 단백질 투과성이됩니다. 이 조건은 조직의 에반스 블루의 넘쳐 흐름 할 수 있습니다. 건강한 내피는 인근 vascularized의 조직에 염료의 넘쳐 흐름을 방지합니다. 증가 투자율과 기관은 그대로 내피와 장기에 비해 크게 증가 파란 착색를 표시합니다. 혈관 투과성의 수준은 간단한 시각화 또는 실험 동물 / 조직 대 제어 조직의 밀리그램 당 통합 염료의 양적 측정에 의해 평가 될 수있다. 두 포웨이 분석의 rful 측면은 단순성과 양적 특성입니다. 에반스 블루 염료는 포름 아미드의 조직의 특정 금액을 잠복기에 의해 조직에서 추출 할 수 있습니다. 에반스 블루 흡광 최대 620 나노 미터에 있으며 흡광도 최소 740 nm의에 있습니다. 에반스 블루에 대한 표준 곡선을 사용하여 광학 밀도 측정은 조직의 밀리그램 당 캡처 밀리그램 염료로 변환 할 수 있습니다. 통계 분석은 혈관 투과성에 큰 차이를 평가하기 위해 사용되어야합니다.
Introduction
선택적 투과성 장벽의 형성 및 유지 보수 적절한 장기 개발 및 성능 1,2에 필수적입니다. 내피 세포 라인 혈관 내강하고 혈액 모든 기관의 중간 공간 사이의 선택 전송에 필수적인 반 투과성 장벽을 형성하고 있습니다. 적절한 투과 장벽은 엄격하게 성장 요인 크린 시토 킨 및 기타 스트레스 관련 분자 세에 의해 제어됩니다 꼭 휴대 전화의 접합을 통해 유지됩니다. 내피 세포 장벽의 파괴가 증가 투자율과 혈관 누출이 발생할 수 있습니다. 이러한 효과는 다양한 질병 상태에서 볼 수 있으며 밑줄 분자 신호의 이해 학제 방법은 4,5이 필요합니다. 이 문서에서는, 우리는 마우스 모델을 사용 선박 투자율을 측정하는 생체 방법에 대해 설명합니다.
또한 마일 분석으로 알려진 우리가 설명하는 분석은 잘 establ입니다생체에 혈관 투과성을 테스트하는 방법을 ished. 검정은 기초 생리 조건 하에서, 알부민은 내피 장벽을 통과하지 않는 사실에 기반을두고 있습니다. 에반스 블루, 알부민 높은 친 화성이있는 아조 염료는 실험 동물의 혈액 스트림에 주입되고, physiologic 조건 하에서,이 혈관 내에서 제한 될 것으로 예상된다. 혈관 투과성의 자극이 추가되면, 어느 붙이기 또는 체계적으로, 혈관은 알부민에 바인딩 된 에반스 블루는 또한, 따라서 단백질을 누설하기 시작합니다. 투과성의 혈관이 조직의 급속한 푸른 착색에있는이 결과.
마우스 측면 꼬리 정맥에있는 염료를 성공적으로 주입 실험의 좋은 결과에 중요합니다. 꼬리 정맥 주입 기술은 광범위한 연습이 필요하고 실험을 시작하기 전에 마스터해야합니다.
선박 투자율은의 연령과 체중에 크게 의존imal 때문에 다른 마우스 변종을 비교하면은 마우스 또는 기타 시험 과목이 동일 출생 날짜와 무게에 가까운 있다는 필수적입니다. 내피 장벽의 투과성에 영향을 미치는 다른 요소는 온도, 습도 등의 환경 조건이며, 매우 중요한 마우스의 처리 스트레스. 실험의 결과에 영향을 미칠 수 요인의 다양한 때문에이 실험은 적어도 세 배 및 통계 분석 수행 반복되는 항상 좋습니다.
이 분석은 선박 유전자 변형 된 쥐 투자율뿐만 아니라 다른 유전 배경을 가진 쥐를 비교하거나 사용할 수 있습니다. 투자율이 변조되는 유전자의 기능에 따라 자극의 유무에 평가 될 수있다. 이 분석은 또한 혈관 투과성에 대한 서로 다른 화합물의 효과를 테스트하거나 사용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 마우스 측면 꼬리 정맥에 에반스 블루의 정맥 주사
- PBS에서 에반스 파란색의 0.5 % 살균 솔루션을 준비합니다. 필요한 경우, 용해되지 않은 미립자를 제거 할 수있는 솔루션을 필터 소독.
- 주사기에 200 μl 에반스 블루 솔루션을 기음. 주사기로 탈출했을 수도 모든 기포를 사용하지 마십시오.
- 동물이 자유롭게 이동하지 않지만 꼬리가 처리 할 수 있도록 구속 장치에 8-12주 오래된 곳 마우스.
- 그래서 측면 꼬리 정맥을 쉽게 볼 수 있으며 위쪽으로 직면하고있다 그 쪽 마우스 덮개 장치를 놓습니다.
- 엄지와 집게 손가락 사이의 비 지배적 인 손으로 정신 차려라.
- 머리의 방향에 대한 측면 꼬리 정맥에 10 ~ 15도 각도, 베벨까지 사전에있는 바늘 (작은 게이지, 27-30)를 삽입합니다. 꼬리에 바늘과 주사기 병렬세요.
- 디O이 정맥을 축소 하듯이 적절한 위치를 확인하는 압력을 다시 적용하지.
- 천천히 마우스의 꼬리 정맥에 200 μl 에반스 블루 솔루션을 주입.
- 플런저 진보가이 같은 정맥에 바늘의 올바른 위치의 증명되는 편의성을 관찰합니다.
- 그 케이지에 다시 마우스를 넣고 30 분 동안을 관찰합니다.
2. 기관에서 장기 수집 및 에반스 블루의 추출
- 자궁 경부 전위를 통해 쥐를 희생. 이 혈관 투과성과 상당한 간섭을 제한 마일 분석을 위해 자궁 경부 전위 권장합니다. 한 빨리 가능한 한 같은 시간에 모든 쥐를 희생. 죽음의 혈관이 더 융화가 될 직후에 있기 때문에, 6 생쥐 이하의 동료들과 협력합니다.
- 자신의 뒤를에 마우스를 놓고 화이트 보드에 발을 고정.
- 토르을 폭로 할 수있는 복부 및 흉부 캐 버티를 엽니 다acic 및 복부 기관.
- 에반스 블루 넘쳐 흐름의 차이를 보여 대표 사진을 찍습니다. 모든 마우스에 동일한 조명 조건이하기 위해 같은 필드에있는 모든 쥐를 포함합니다.
- 관심 장기를 수집하고 1.5 ML 튜브에 넣어
- 빈 관을 무게 0으로 균형 값을 가져.
- 조직 샘플을 전송하고 무게. 모든 조직 샘플에 대한 반복합니다. 조직은 공기가 다른 장기 사이의 물 내용 변화를 제거하기 위해 건조 할 수 있습니다.
- . 각 조직 샘플 튜브에 500 μl 포름 아미드를 추가합니다.
- 55 ° C의 물을 욕조 또는 열 블록에 대한 모든 튜브를 전송합니다. 조직에서 에반스 블루를 추출 할 수 있도록 24-48 시간에 품다.
3. 에반스 블루의 정량화는 중간 조직에 Extravasated
- 펠렛 남아있는 조직 조각에 포름 아미드 / 에반스 블루 혼합물을 원심 분리기.
- 610에서 흡광도를 측정NM. 빈으로 500 μl 포름 아미드를 사용합니다.
- 계산 NG 에반스 블루 MG 조직 당 extravasated.
- 그래프의 모든 데이터를 하겠나.
- 큰 차이를 결정하기 위해 통계 분석을 수행합니다.
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Representative Results
우리는 8~12주 기존 마우스에 혈관 누출을 테스트하기 위해 생체의 투자율 분석에를 사용했습니다. 이 테스트는 서로 다른 유전 배경의 동물 간 또는 vasculature에 영향을 미칠 치료를 받게 마우스의 단일 변종에 상대적으로 혈관 투과성을 비교에 유용합니다. 우리의 결과는 우리 실험실에서 만든 유전자 변형 쥐의 변종이 야생 형 생쥐에 비해 좀 더 투과성의 내피를 가지고 보여줍니다. 이러한 변화는 많은 기관에서 매크로 레벨 (그림 1)에 분명합니다.
우리는 spectophotometricaly 다른 기관에 조직 g 당 캡처 된 에반스 블루를 측정하여 혈관 투과성의 차이를 정할 수있었습니다. 우리가 그림에서 관찰로 2 개의 다른 기관 투과 유도 인자 신호에 다른 응답을 보여하므로 서로 다른 염료 축적을 보여줍니다. 이것은 또한 다른 조직의 vascularization의 수준의 기능입니다.
1 그림. 조직에서 에반스 블루 넘쳐 흐름. 에반스 푸른 사출 마우스 후 30 분은 자궁 경부 전위를 통해 희생되었다. 관심 기관의 대표 사진은 촬영 된 것입니다.
그림 2. 에반스 블루 넘쳐 흐름의 Quantitation 다른 조직 인치 50-100 MG 조직은 extravasated 에반스 블루의 압축을 풉니 500 μl 포름 아미드와 incubated되었습니다. 광학 밀도는 610 nm의와 MG 조직 당 extravasated 것이다 색소로 변환 측정에서 측정되었다. 실험은 세 번 반복되었다.
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Discussion
혈관 투과성는 혈관 상태에 대한 중요한 표시입니다. 증가 혈관 투과성은 당뇨병, 고혈압, 그리고 면역 질환 6,7,8 등 여러 조직 질환에 존재하는 표시되었습니다. 증가 혈관 투과성이 전단 응력에 의해 중재 할 수 표시되었습니다 혈관 내피 성장 인자와 섬유 아세포 성장 인자, 세로토닌, 히스타민, 9 bradykinin과 같은 염증성 중재자 같은 성장 요인에 따라 결정됩니다. 물과 작은 분자의 넘쳐 흐름은 내피 세포 사이의 작은 구멍을 통해 발생하는 것으로 생각됩니다. 휴대 전화의 접합의 강도는 엄격히 분자 열 간의 상호 작용에 의해 조절된다.
생리적 조건에서 내피 물과 이온에 대한 투과성, 그리고 단백질에 불 침투성입니다. 따라서, 염증 자극의 부재에서, 알부민은 혈액의 흐름을 제한하고 세포 외액으로 이동하지 않습니다. E를 주입하여밴 블루, 알부민 결합 염료, 우리는 중간 조직에 혈액 스트림에서 단백질 누출의 범위를 모니터링 할 수 있습니다.
이 분석의 수정 버전은 형광등이라는 마이크로을 사용합니다. 다른 크기의 마이크로 나 다른 분자량 형광등 표시 dextran을 (4-70 KDa)를 사용하여 하나는 더 나은 내피 손상의 정도를 평가 할 수 있습니다. 그러나,이 옵션은 시각화의 용이성을 제거하며 형광 플레이트 리더를 사용하여 조직 및 형광 현미경 이미징, 또는 측정을 수정해야합니다.
체외에서 혈관 투과성의 연구 문헌 11에서 성공적으로 사용되었습니다. 체외 투과 연구에서의 필수 요소는 그대로, 합류 세포 monolayer입니다. 이러한 assays는 내피 세포가 상부 챔버에 위치한 투과 막에 monolayer에서 배양되는 클래식 더블 챔버를 사용합니다. 염료는 상부에 적용됩니다챔버 및 내피 세포의 투과성이 낮은 챔버에 도달 염료의 양을 측정하여 평가된다. 결과는 생체 분석 결과에서 대부분의 경우에 모방. 그러나, 적절한 생리적 맥락이 부족함으로써 결과의 복잡성에 의해 복잡합니다. 체외 접근은 pericytes, 생활 조직에서 내피 세포들과 긴밀한 연락을하고 내피 세포 증식, 혈관 성장과 분기에 대한 신호를 보내 세포의 역할을 제거합니다.
마일리지 시험 결과는 이상적으로 더 테스트중인 가설을 확인하는 분자 연구와 함께해야합니다. 언급 한 바와 같이, 전체 유기체에서, 혈관 투과성은 많은 변수에 의존하며, 따라서 생체 투과성 분석에서의 결과는 분석 시스템의 복잡성에 비추어 해석해야합니다.
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Disclosures
저자는 갈등이나 경쟁 금융 이익이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원, R01CA142928의 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 | |
References
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