Summary
نحن نقدم ل
Abstract
ويستند هذا الأسلوب على حقن الوريد الأزرق ايفانز في الفئران كما اختبار نموذج حيواني. ايفانز الأزرق هو صبغة التي تربط الزلال. في ظل ظروف الفسيولوجية البطانة غير منفذ لالزلال، لذلك ايفانز الأزرق بقايا الزلال محدد مقيد داخل الأوعية الدموية. في ظروف مرضية تعزز زيادة الخلايا البطانية نفاذية الأوعية الدموية تفقد جزئيا اتصالاتهم وثيقة والبطانة تصبح قابلة للاختراق للبروتينات صغيرة مثل الزلال. هذا الشرط يسمح لانصباب الأزرق ايفانز في الأنسجة. A البطانة صحية تمنع تسرب للصباغة في الأنسجة المجاورة أوعية دموية. سوف الأجهزة مع زيادة نفاذية تظهر تلوين الزرقاء زيادة كبيرة مقارنة مع أجهزة البطانة سليمة. ويمكن تقييم مستوى نفاذية الأوعية الدموية عن طريق التصور بسيطة أو عن طريق القياس الكمي للصباغة أدرجت في مليغرام من أنسجة حيوانات التجارب التحكم مقابل / الأنسجة. اثنين باورجوانب من هذا الاختبار rful هي بساطتها والخصائص الكمية. ويمكن استخراج ايفانز الأزرق الصبغة من الأنسجة احتضان كمية معينة من الأنسجة في الفورماميد. ايفانز أقصى امتصاص الأزرق هو 620 نانومتر في الدنيا والامتصاص هو في 740 نانومتر. باستخدام منحنى القياسية لايفانز الأزرق، يمكن تحويل القياسات الكثافة البصرية في صبغ مليغرام لكل مليغرام من القبض على الأنسجة. وينبغي استخدام التحليل الإحصائي لتقييم فروق ذات دلالة إحصائية في نفوذية الأوعية الدموية.
Introduction
تشكيل وصيانة الحواجز نفاذية انتقائية ضرورية لتطوير الجهاز السليم و1،2 الأداء. الخلايا البطانية المبطنة للتجويف الأوعية الدموية وتشكل حاجزا شبه منفذ التي لا غنى عنها في نقل الدم بين الانتقائية والفضاء الخلالي من جميع الأجهزة. يتم الاحتفاظ حاجز النفاذية الكافية من خلال تقاطعات خلية الى خلية الضيق الذي تخضع للرقابة الصارمة من قبل عوامل النمو، السيتوكينات والجزيئات الأخرى. 3 الإجهاد. يمكن تعطيل الجدار الخلية البطانية يؤدي إلى زيادة نفاذية الأوعية الدموية والتسرب. وينظر في هذه الآثار الحالات المرضية المختلفة وفهم الإشارات الجزيئية التسطير يتطلب أساليب متعددة التخصصات 4،5. في هذه المقالة، ونحن تصف طريقة في الجسم الحي لقياس نفاذية الأوعية باستخدام نموذج الفأر.
الفحص نحن تصف، المعروف أيضا باسم فحص مايلز، هو جيد أنشأناished طريقة لاختبار نفاذية الأوعية الدموية في الجسم الحي. ويستند الفحص على حقيقة أنه في ظل الظروف الفسيولوجية القاعدية، الزلال لا عبور حاجز غشائي. يتم حقن ايفانز الأزرق، وهي صبغة الآزو مع تقارب عالية لالزلال، في مجرى الدم لحيوانات التجارب، وتحت ظروف الفسيولوجية، ومن المتوقع أن تكون مقيدة داخل الأوعية الدموية. عند إضافة التحفيز نفاذية الأوعية الدموية، إما موضعيا أو جهازيا، والأوعية الدموية تبدأ في تسرب البروتين، وبالتالي، أيضا الأزرق ايفانز المنضم إلى الألبومين. وهذا يؤدي إلى تلون مزرق السريع للأنسجة التي لديها سفن نفاذية.
حقن صبغة الناجح لفي ذيل الماوس الوريد الوحشي هو أمر حاسم لنتيجة جيدة من التجربة. تقنية حقن الوريد ذيل يتطلب ممارسة واسعة ويجب أن يتقن قبل بدء التجربة.
نفاذية الأوعية تعتمد بشكل كبير على عمر ووزن علىIMAL، لذلك عند مقارنة سلالات الفئران مختلفة لا بد أن الفئران أو غيرها من المواضيع اختبار مقربة من تواريخ الميلاد متطابقة والوزن. العوامل الأخرى التي تؤثر على نفاذية حاجز غشائي هي الظروف البيئية مثل الرطوبة ودرجة الحرارة، والأهم من ذلك،. الضغط التعامل مع الماوس بسبب العديد من العوامل التي يمكن أن تؤثر على نتائج التجربة أنه من المستحسن دائما أن يتم تكرار التجربة ثلاث مرات على الأقل ويقوم التحليل الإحصائي.
ويمكن استخدام هذا الاختبار لمقارنة أو نفاذية الأوعية من الفئران التي تم تعديلها وراثيا، وكذلك الفئران مع خلفيات وراثية مختلفة. ويمكن تقييم النفاذية في وجود أو عدم وجود التحفيز، وهذا يتوقف على وظيفة الجين الذي هو التضمين. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا الفحص أو لاختبار تأثير مركبات مختلفة على نفاذية الأوعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. في الوريد حقن الأزرق ايفانز في ذيل الماوس الجانبي وريد
- إعداد محلول 0.5٪ من اللون الأزرق العقيمة ايفانز في برنامج تلفزيوني. إذا لزم الأمر، فلتر تعقيم الحل لإزالة أي الجسيمات التي لم المنحل.
- نضح 200 ميكرولتر حل الأزرق ايفانز في حقنة. تجنب كل فقاعات الهواء التي قد هربوا إلى الحقنة.
- الفئران هي المكان الذي 8-12 أسابيع من العمر في جهاز ضبط النفس حتى يتسنى للحيوانات بحرية غير متحرك ولكن يمكن التعامل معها ذيله.
- وضع الجهاز ضبط النفس الماوس على جانبها حتى الذيل الأفقي السياق مرئيا بسهولة وتواجه التصاعدي.
- التمسك الذيل مع اليد غير المسيطرة بين الإبهام والسبابة و.
- إدراج إبرة (قياس صغيرة، 27-30) في 10-15 درجة زاوية مسبقا، حتى شطبة، في الوريد الذيل الأفقي نحو اتجاه الرأس. إبقاء موازية الإبر والمحاقن الى الذيل.
- Dس يتم تطبيق الضغط مرة أخرى للتأكد من تحديد المكان المناسب لأن ذلك قد تنهار في الوريد.
- حقن ببطء 200 ميكرولتر حل الأزرق ايفانز في الوريد ذيل الماوس.
- مراقبة السهولة التي الغطاس التقدم، وهذا هو دليل على التنسيب الصحيح للإبرة في الوريد.
- وضع الماوس مرة أخرى إلى قفصه والالتزام به لمدة 30 دقيقة.
2. كوكتيل الجهاز واستخراج الأزرق ايفانز من هيئات
- التضحية الفئران من خلال خلع عنق الرحم. لأغراض الفحص ينصح مايلز خلع عنق الرحم كما أنه يحد تدخل كبير مع نفوذية الأوعية الدموية. تضحية جميع الفئران في نفس الوقت، في أسرع وقت ممكن. العمل مع الأفواج من 6 الفئران أو أقل، لأنه بعد وقت قصير من وفاة الأوعية الدموية تصبح أكثر نفاذا.
- وضع الفئران على ظهورهم ويعلقون أقدامهم على لوحة بيضاء.
- فتح تجويف البطن والصدر للكشف عن ثورمايا والبطن الأجهزة.
- التقاط صور ممثل لإظهار الاختلافات في التسرب الأزرق ايفانز. تشمل جميع الفئران في نفس المجال من أجل الحصول على ظروف الإضاءة مماثلة لجميع الفئران.
- جمع أجهزة الفائدة ووضعها في أنابيب 1.5 مل
- تزن أنبوب فارغ وتقديم قيمة الرصيد إلى الصفر.
- نقل عينات الأنسجة والوزن عليه. تكرار لجميع عينات الأنسجة. يمكن أن تكون الأنسجة الهواء المجفف للقضاء على التباين بين المحتوى المائي أجهزة مختلفة.
- . إضافة 500 ميكرولتر الفورماميد إلى كل الأنسجة أنبوب العينة.
- نقل جميع أنابيب إلى 55 درجة مئوية أو حمام مائي كتلة الحرارة. احتضان لمدة 24-48 ساعة لاستخراج ايفانز الأزرق من الأنسجة.
3. Extravasated الكمي للالأزرق ايفانز في النسيج الخلالي
- أجهزة الطرد المركزي لالفورماميد / إيفانز خليط الأزرق إلى أي شظايا بيليه الأنسجة المتبقية.
- قياس الامتصاصية في 610نانومتر. يستعملون 500 ميكرولتر الفورماميد كما فارغة.
- حساب نانوغرام ايفانز الأزرق extravasated في الأنسجة ملغ.
- رسم كافة البيانات في الرسم البياني.
- تحليل احصائى لتحديد فروق ذات دلالة إحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدمنا في فحص النفاذية المجراة لاختبار تسرب السفينة في الفئران 8-12 أسابيع من العمر. هذا الاختبار مفيد في المقارنة بين النفاذية النسبية الأوعية الدموية بين الحيوانات من الخلفية الجينية المختلفة أو في سلالة واحدة من الفئران التعرض للعلاجات التي تؤثر على الأوعية الدموية. نتائجنا تظهر أن سلالة من الفئران المعدلة وراثيا التي صنعناها في المختبر لديه البطانة أكثر نفاذية مقارنة البرية من نوع الفئران. هذه التغييرات واضحة على المستوى العيانية في العديد من الأجهزة (الشكل 1).
كنا قادرين على قياس الفرق في نفاذية الأوعية عن طريق قياس spectophotometricaly ايفانز الأزرق التي تم التقاطها لكل غرام من النسيج في مختلف الأجهزة. كما لاحظنا في الشكل 2 مختلف الأجهزة تظهر استجابة لإشارات مختلفة محفز النفاذية وبالتالي تظهر صبغة مختلفة تراكم. وهذا هو أيضا وظيفة من مستويات الأوعية الدموية في الأنسجة المختلفة.
= "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 1. تمت التضحية ايفانز الأزرق التسرب في الأنسجة. بعد 30 دقيقة الفئران حقن ايفانز الأزرق من خلال خلع عنق الرحم. أخذت الصور ممثل أجهزة الفائدة.
الشكل 2. تحديد الكميات من التسرب الأزرق ايفانز في الأنسجة المختلفة. وحضنت 50-100 ملغ الأنسجة مع 500 ميكرولتر الفورماميد لاستخراج extravasated ايفانز الأزرق. وقد تم قياس الكثافة البصرية في 610 نانومتر وتحويلها إلى قياسات صبغ نانوغرام في الأنسجة extravasated ملغ. وتكرر التجربة ثلاث مرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نفاذية الأوعية الدموية هو علامة حاسمة للحصول على مركز الأوعية الدموية. وقد تبين زيادة نفوذية الأوعية الدموية لتكون موجودة في العديد من الأمراض الجهازية، بما في ذلك مرض السكري وارتفاع ضغط الدم، وأمراض المناعة الذاتية 6،7،8. وقد تبين زيادة نفوذية الأوعية الدموية التي تتوسط فيها إجهاد القص، عوامل النمو مثل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية وعامل نمو الخلايا الليفية، مثل الهستامين وسطاء التهابات، والسيروتونين براديكينين 9. ويعتقد تسرب المياه والجزيئات الصغيرة أن تحدث من خلال فتحات صغيرة بين الخلايا البطانية. وينظم بدقة قوة الخلية الى خلية تقاطعات بواسطة التفاعل بين جزيئات 10.
في الظروف الفسيولوجية البطانة هي منفذة للماء وأيونات، وغير منفذة للبروتينات. وهكذا، في غياب المحفزات التهابات، ويقتصر الزلال لتدفق الدم ولا ينتقل الى السائل خارج الخلية. عن طريق حقن Eعربات الأزرق، الذي يربط صبغة الزلال، يمكننا رصد مدى تسرب البروتين من مجرى الدم إلى الأنسجة الخلالية.
وهناك نسخة معدلة من هذا الاختبار يستخدم الفلورسنت التي تحمل علامات المجهرية. باستخدام مختلف المجهرية الحجم أو الوزن الجزيئي مختلفة الفلورسنت التي تحمل علامات ديكستران (4-70 كيلو دالتون) يمكن للمرء أن إجراء تقييم أفضل لمدى الضرر البطانية. ومع ذلك، فإن هذا الخيار يلغي سهولة التصور ويتطلب إصلاح الأنسجة والتصوير المجهري الفلورسنت، أو القياس باستخدام قارئ لوحة مضان.
في المختبر استخدمت دراسات نفاذية الأوعية بنجاح في الأدب 11. عنصرا أساسيا في أي دراسة في المختبر نفاذية هو سليمة، أحادي الطبقة خلية متموجة. هذه المقايسات استخدام غرفة كلاسيكية مزدوجة حيث يتم استزراع الخلايا البطانية في أحادي الطبقة على نفاذية غشاء تقع في مجلس الشيوخ. يتم تطبيق الصبغة إلى الأعلىويتم تقييم وغرفة البطانية نفاذية الخلية عن طريق قياس كمية الصبغة التي تصل إلى مجلس النواب. نتائج تقليد في معظم الحالات في نتائج الفحص الجسم الحي. ومع ذلك، فإنها تفتقر إلى إطار مناسب الفسيولوجية ومعقدة وبالتالي من تعقيد النتائج. والنهج في المختبر كما يلغي دور pericytes، الخلايا التي، في الأنسجة الحية، على اتصال وثيق مع الخلايا البطانية وإرسال إشارات لانتشار الخلايا البطانية، ونمو الأوعية المتفرعة.
ينبغي من الناحية المثالية نتائج الاختبار مايلز تكون مصحوبة الدراسات الجزيئية التي يواصل النظر في الفرضية التي يتم اختبارها. كما ذكر، في الحي كله، نفاذية الأوعية الدموية يعتمد على العديد من المتغيرات، وبالتالي النتائج لفحص النفاذية في الجسم الحي لابد من تفسيرها في ضوء تعقيد النظام تحليلها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم الصراع أو المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعاهد القومية للصحة، R01CA142928.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 | |
References
- Beck, K. F., et al. Inducible NO synthase: role in cellular signaling. J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).
- Bertglia, S., Giusti, A. Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).
- Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs. J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).
- Weis, S. M. Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer. Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).
- Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation. Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).
- Scheppke,, et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability. J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).
- Dvorak, A. M. Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle. Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).
- Le Guelte, A., Gavard, J. Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability. Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).
