Summary
Vi præsenterer et
Abstract
Denne metode er baseret på den intravenøse injektion af Evans Blue i mus som forsøgsdyr model. Evans blåt er et farvestof, som binder albumin. Under fysiologiske betingelser endotelet er uigennemtrængelig for albumin, så Evans Blue bundne albumin rester restriktioner i blodkar. I patologiske tilstande, der fremmer forøget vaskulær permeabilitet endotelceller delvist mister den tætte kontakt og endotelet bliver permeabel for små proteiner, såsom albumin. Denne betingelse giver mulighed for ekstravasation af Evans Blue i væv. En sund endotel forhindrer ekstravasation af farvestoffet i de omkringliggende vaskulariserede væv. Organer med forøget permeabilitet vil vise signifikant forøget blåfarvning i forhold til organer med intakt endothelium. Niveauet af vaskulær permeabilitet kan bestemmes ved simpel visualisering eller ved kvantitativ måling af farvestoffet inkorporeret milligram af væv af kontrol versus forsøgsdyr / væv. To powerful aspekter af dette assay er dens enkelhed og kvantitative egenskaber. Evans Blue farvestoffet kan ekstraheres fra væv ved inkubation af en særlig mængde væv i formamid. Evans Blue absorbansmaksimum er på 620 nm og absorbansen minimum er på 740 nm. Ved anvendelse af en standardkurve for Evans Blue, kan målinger af optisk densitet omdannes til milligram farvestof fanget milligram af væv. Statistisk analyse bør anvendes til at vurdere signifikante forskelle i vaskulær permeabilitet.
Introduction
Dannelse og vedligeholdelse af selektive permeable barrierer er afgørende for korrekt orgel udvikling og resultater 1,2. Endotelceller line blodkarret lumen og danner en semipermeabel barriere, som er afgørende i den selektive transport mellem blod og det interstitielle rum af alle organer. En passende permeabilitetsbarriere opretholdes gennem stramme celle-til-celle-kryds, som er strengt kontrolleret af vækstfaktorer, cytokiner og andre stressrelaterede molekyler tre. Afbrydelse af den endotelcelle-barrieren kan resultere i øget permeabilitet og vaskulær lækage. Disse virkninger ses i forskellige sygdomstilstande og forståelsen af den understregningen molekylære signalering kræver tværfaglige metoder 4,5. I denne artikel beskriver vi en in vivo metode til at måle fartøj permeabilitet ved hjælp af en musemodel.
Assayet vi beskriver, også kendt som Miles-assay, er et godt established metode til at teste vaskulær permeabilitet in vivo. Assayet er baseret på det faktum, at, under basale fysiologiske betingelser, er albumin ikke krydse den endotele barriere. Evans Blue, et azofarvestof med høj affinitet for albumin, indsprøjtes i blodstrømmen i et forsøgsdyr, og under fysiologiske betingelser, forventes den at være begrænset i blodkar. Når en vaskulær permeabilitet stimulus tilsættes, enten topisk eller systemisk, blodkar begynder at lække protein og dermed også Evans-blåt, der er bundet til albumin. Dette resulterer i en hurtig blålig farvning af væv, der har permeable fartøjer.
Vellykket injektion af farvestoffet i mus laterale halevene er kritisk for godt resultat af forsøget. Haleveneinjektion teknik kræver omfattende praksis og bør beherskes før du starter eksperimentet.
Fartøjets permeabilitet er meget afhængig af alderen og vægten af enimal, så når man sammenligner forskellige musestammer er det bydende nødvendigt, at de mus eller andre forsøgspersoner har tæt på identiske fødselsdatoer og vægt. Andre faktorer, der påvirker permeabiliteten af den endotheliale barriere er miljømæssige forhold såsom temperatur, luftfugtighed, og meget vigtigt, håndtering stress på musen. På grund af de mange faktorer, der kan påvirke resultatet af forsøget er det altid tilrådeligt at eksperimentet gentages mindst tre gange og statistiske analyser udført.
Dette assay kan anvendes, eller for at sammenligne kar permeabiliteten af mus, der er blevet genetisk modificeret, samt mus med forskellige genetiske baggrunde. Permeabilitet kan vurderes i nærvær eller fravær af en stimulus, afhængigt af funktionen af genet, der er moduleret. Dette assay kan også anvendes, eller til at teste virkningen af forskellige forbindelser på fartøjet permeabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Intravenøs injektion af Evans Blue i mus laterale halevene
- Der fremstilles en 0,5% steril opløsning af Evans blåt i PBS. Om nødvendigt filter-sterilisere opløsningen til fjernelse af eventuelle partikler, der ikke opløses.
- Aspirer 200 pi Evans Blue opløsning i en sprøjte. Undgå alle luftbobler, der kunne have sluppet ind i sprøjten.
- Place-mus, der er 8-12 uger gamle i en fastspændingsanordning således at dyret ikke er frit bevægelig, men halen kan håndteres.
- Placere musen fastspændingsanordning på siden, så den laterale halevene er let synlig, og vender opad.
- Hold på halen og den ikke-dominerende hånd mellem tommel-og pegefinger.
- Indsætte nålen (lille gauge, 27-30) på en 10-15 graders vinkel, facet op, forhånd i den laterale halevene i den retning af hovedet. Hold kanylen og sprøjten parallelt med halen.
- Do ikke tilbage pres for at bekræfte korrekt placering, da dette kan skjule venen.
- Injicer langsomt 200 pi Evans Blue-opløsning i halevenen på musen.
- Observere den lethed, hvormed stemplet fremskridt, da dette er bevis for korrekt placering af kanylen i venen.
- Sæt musen tilbage til sit bur og observere den i 30 minutter.
2. Organ indsamling og brydning af Evans Blue fra organer
- Sacrifice musene gennem cervikal dislokation. For Miles assayformål halsdislokation anbefales, da det begrænser betydelig påvirkning vaskulær permeabilitet. Ofre alle musene samtidig, så hurtigt som muligt. Arbejde med kohorter af 6 mus eller mindre, fordi kort efter døden blodkar bliver mere gennemtrængelig.
- Placer mus på ryggen og pin deres fødder på en hvid bord.
- Åbn den abdominale og brysthulen at eksponere thoracic og abdominal organer.
- Udtage repræsentative billeder, som viser forskelle i Evans Blue ekstravasation. Omfatte alle mus inden for samme område for at have identiske lysforhold for alle mus.
- Saml organer af interesse og sætte dem i 1,5 ml rør
- Afvej et tomt rør og bringe balanceværdi til nul.
- Overfør vævsprøven og vægte den. Gentag for alle vævsprøver. Væv kan lufttørres at fjerne vandindholdet variabilitet mellem forskellige organer.
- . Der tilsættes 500 pi formamid til hver vævsprøve rør.
- Overføre alle rør til et 55 ° C vandbad eller varmeblok. Inkuberes i 24-48 timer for at ekstrahere Evans Blue fra væv.
3. Kvantificering af Evans Blue ekstravasaterede i Interstitiel Tissue
- Centrifugeres formamid / Evans Blue blanding for at pelletere eventuelle resterende vævsfragmenter.
- Mål absorbans ved 610nm. Brug 500 pi Formamid som blank.
- Beregne ng Evans Blue ekstravaseret per mg væv.
- Plot alle data i en graf.
- Statistisk analyse til at bestemme signifikante forskelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brugte en in vivo permeabilitet assay til at teste fartøj lækage i mus 8-12 uger gamle. Denne test er anvendelig til at sammenligne den relative vaskulær permeabilitet mellem dyr med forskellig genetisk baggrund eller i en enkelt stamme af mus udsat for behandlinger, der påvirker vaskulaturen. Vores resultater viser, at en stamme af genetisk modificerede mus vi skabt i vort laboratorium har en mere permeabel endotel sammenlignet med vildtypemus. Disse ændringer er tydelige på makroskopisk niveau i mange organer (figur 1).
Vi kunne kvantificere forskellen i beholderen permeabilitet ved spectophotometricaly måle Evans Blue, der blev fanget pr gram væv i forskellige organer. Som vi har observeret i figur 2 forskellige organer viser forskellig respons på permeabilitet inducer signaler og dermed vise forskellige farvestof akkumulering. Dette er også en funktion af niveauet af vaskularisering i forskellige væv.
Figur 1. Evans blue-ekstravasation i væv. 30 minutter efter Evans Blue injektion blev musene aflivet ved cervikal dislokation. Repræsentative billeder af organer af interesse blev taget.
Figur 2. Kvantificering af Evans Blue extravasation i forskellige væv. 50-100 mg væv blev inkuberet med 500 pi formamid at ekstrahere ekstravaseret Evans Blue. Optiske densitet blev målt ved 610 nm og målingerne omsættes til ng farvestof ekstravaseret per mg væv. Eksperimentet blev gentaget tre gange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vaskulær permeabilitet er en kritisk markør for blodkar status. Forøget vaskulær permeabilitet har vist sig at være til stede i adskillige systemiske sygdomme, herunder diabetes, hypertension og autoimmune sygdomme 6,7,8. Forøget vaskulær permeabilitet har vist sig at være medieret af forskydningsspænding, vækstfaktorer såsom vaskulær endotelvækstfaktor og fibroblastvækstfaktor, inflammatoriske mediatorer som serotonin, histamin og bradykinin 9. Ekstravasation af vand og små molekyler menes at opstå gennem små åbninger mellem endotelceller. Styrken af celle-til-celle-kryds er nøje reguleret af interaktion mellem molekyler 10.
Under fysiologiske betingelser endotel er permeabel for vand og ioner, og uigennemtrængeligt for proteiner. Således, i fraværet af inflammatoriske stimuli, er albumin begrænset til blodgennemstrømningen og bevæger sig ikke til den ekstracellulære væske. Ved at injicere Evarevogne Blue, et farvestof, som binder albumin, kan man overvåge omfanget af protein lækage fra blodstrømmen ind i det interstitielle væv.
En modificeret version af dette assay anvendes fluorescens-mærkede mikrosfærer. Ved at bruge forskellige størrelser mikrosfærer eller forskellig molekylvægt fluorescent-mærket dextran (4-70 kDa) kan man bedre vurdere omfanget af endotelødelæggelse. Denne mulighed eliminerer lette visualiseringen og den kræver fastsættelse af væv og fluorescensmikroskopi billeddannelse eller målinger ved anvendelse af en fluorescenspladelæser.
In vitro undersøgelser af kar permeabiliteten er blevet anvendt med succes i litteraturen 11. En essentiel ingrediens i et in vitro permeabilitet undersøgelse er en intakt, sammenflydende cellemonolag. Disse analyser anvender en klassisk dobbelt kammer, hvor endotelceller dyrkes i et monolag på en permeabel membran beliggende i det øvre kammer. Et farvestof påføres den øvrekammer og endotelcelle permeabilitet vurderes ved at måle mængden af farvestof, der når det nedre kammer. Resultaterne efterligne i de fleste tilfælde in vivo-analysen. De mangler imidlertid den passende fysiologisk kontekst og derved kompliceres af kompleksiteten af resultaterne. In vitro metode eliminerer også den rolle, pericytter, celler, i levende væv, er i tæt kontakt med endothelceller og sende signaler til endotelcelleproliferation, karvækst og forgrening.
De Miles testresultater bør ideelt være ledsaget af molekylære undersøgelser, der yderligere at undersøge den hypotese, at der testes. Som nævnt, i en hel organisme, er vaskulær permeabilitet afhænger af mange variabler og således resultaterne af en in vivo permeabilitet assay skal fortolkes i lyset af kompleksiteten af systemet analyseret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikt eller konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institutes of Health, R01CA142928.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 | |
References
- Beck, K. F., et al. Inducible NO synthase: role in cellular signaling. J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).
- Bertglia, S., Giusti, A. Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).
- Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs. J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).
- Weis, S. M. Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer. Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).
- Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation. Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).
- Scheppke,, et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability. J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).
- Dvorak, A. M. Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle. Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).
- Le Guelte, A., Gavard, J. Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability. Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).
