Summary
Мы представляем
Abstract
Этот метод основан на внутривенном введении Evans Blue мышей в качестве модели испытаний на животных. Эванс синий краситель, который связывается альбумином. В физиологических условиях эндотелий является непроницаемой для альбумина, так Эванса синего связанного альбумина остается ограниченным в кровеносных сосудах. В патологических условиях, которые способствуют повышение сосудистой проницаемости эндотелиальных клеток частично теряют свои тесные контакты и эндотелий становится проницаемой для небольших белков, таких как альбумин. Это условие позволяет экстравазации Evans Blue в тканях. Здоровый эндотелий предотвращает кровоизлияние красителя в соседние ткани васкуляризированной. Органы с повышенной проницаемостью покажет значительно увеличилось синюю окраску по сравнению с органов с интактным эндотелием. Уровень проницаемости сосудов можно оценить по простой визуализации или количественного измерения красителя включены на миллиграмм ткани контроля в сравнении с экспериментальными животными / ткань. Два Пауrful аспекты этого анализа являются его простота и количественных характеристик. Evans Blue красителей могут быть извлечены из тканей путем инкубации определенное количество ткани в формамида. Evans Blue максимум поглощения находится при 620 нм и поглощения минимум при 740 нм. С помощью стандартной кривой для Evans Blue, измерения оптической плотности могут быть преобразованы в миллиграммах красителя захватили на миллиграмм ткани. Статистический анализ должен быть использован для оценки существенных различий в проницаемости сосудов.
Introduction
Формирование и поддержание избирательный проницаемые барьеры, необходимые для нормального развития органов и производительностью 1,2. Эндотелиальные клетки линии просвета кровеносных сосудов и образуют полупроницаемый барьер, который играет важную роль в избирательный перевозок между кровью и интерстициальным пространством всех органов. Адекватный барьер проницаемости поддерживается благодаря тесной клетки к клетке соединений, которые строго контролируются факторы роста, цитокины и другие связанные со стрессом молекулы 3. Нарушение эндотелиального барьера клетки может привести к увеличению проницаемости сосудистой и утечки. Эти эффекты проявляются в различных болезненных состояний и понимание подчеркивание молекулярного сигнального требует междисциплинарных методов 4,5. В этой статье мы опишем в естественных условиях метод измерения проницаемости судна с помощью мыши модели.
Анализ, который мы описываем, также известный как анализ Майлз, это хорошо establбедных и обнищавших слоев метод для тестирования проницаемости сосудов в естественных условиях. Анализ основан на том факте, что при физиологических условиях базальная, альбумин не пересекает эндотелиального барьера. Evans Blue, азокрасителя с высоким сродством к альбумина, вводится в кровоток подопытных животных, и в физиологических условиях, как ожидается, будет ограничен в пределах кровеносных сосудов. При сосудистой проницаемости стимул добавляется, либо местно или системно, кровеносные сосуды начинают течь белка и, таким образом, также синего Эванса, который связан с альбумином. Это приводит к быстрому голубовато окраска тканей, которые имеют проницаемые сосуды.
Успешное введение красителя в мышь латеральную хвостовую вену имеет решающее значение для хорошего результата эксперимента. Хвостовую вену инъекцию техника требует обширной практики и должны быть освоены до начала эксперимента.
Судно проницаемость сильно зависит от возраста и весамальных, так что при сравнении различных линий мышей важно, что у мышей или других испытуемых имеют близкие к идентичным даты рождения и весом. Другие факторы, которые влияют на проницаемость эндотелиального барьера условий окружающей среды, таких как температура, влажность, и очень важно, обработка стресс мыши. В связи с множеством факторов, которые могут повлиять на результаты эксперимента это всегда желательно, что эксперимент повторяется не менее трех раз и статистический анализ выполняется.
Этот анализ может быть использован либо для сравнения судна проницаемость мышей, которые были генетически модифицированы, а также мышей с различным генетическим фоном. Проницаемость может быть оценена в присутствии или в отсутствии стимула, в зависимости от функции генов, которые модулируют. Этот анализ также может быть использован и для проверки влияния различных соединений на судне проницаемость.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Внутривенное введение Evans Blue в мышь латеральную хвостовую вену
- Подготовка 0,5% стерильный раствор голубого Эванса в PBS. При необходимости фильтр-стерилизовать раствором для удаления любых твердых частиц, которые не растворяются.
- Аспирируйте 200 мкл Evans Blue раствор в шприц. Избегайте пузырьков воздуха, которые могли бы бежал в шприц.
- Место мышей, 8-12 недель в удерживающего устройства так, чтобы животное не является свободно мобильный, но ее хвост может быть обработано.
- Поместите устройство мыши сдержанность на бок, так латеральную хвостовую вену хорошо видно и вверх.
- Держи хвост с не доминирующей руки между большим и указательным пальцами.
- Вставьте иглу (малый калибр, 27-30) на 10-15 градусов, скосом вверх, продвижение в латеральную хвостовую вену в направлении головы. Держите иглу и шприц параллельно хвост.
- Рео не применять обратное давление, чтобы подтвердить правильность размещения, так как это может рухнуть в вену.
- Медленно вводят 200 мкл Evans Blue решение в хвостовую вену мыши.
- Обратите внимание на легкость, с которой поршень достижений, так как это является доказательством правильное размещение иглы в вену.
- Наведите обратно в свою клетку и соблюдать его в течение 30 мин.
2. Коллекция органной и добыча Evans Blue от органов
- Жертва мышей через смещения шейных позвонков. Для целей анализа Miles смещения шейных позвонков рекомендуется, поскольку он ограничивает значительное вмешательство проницаемость сосудов. Жертва всех мышей в то же время, как можно быстрее. Работа с когортами 6 мышей или меньше, потому что вскоре после смерти сосудов крови становятся более проницаемыми.
- Поместите мышь на спину и связывают свои ноги на белой доске.
- Откройте брюшной и грудной полости подвергать ТорACIC и органов брюшной полости.
- Возьмите представитель фотографии, чтобы показать различия в экстравазации Evans Blue. Включить все мышей в той же области, чтобы иметь одинаковые условия освещения для всех мышей.
- Сбор органах интерес и положить их в пробирки на 1,5 мл
- Взвесьте пустой трубы и привести балансовую стоимость до нуля.
- Передача образца ткани и веса он. Повторите для всех образцов ткани. Ткани могут быть сушат на воздухе, устранить изменчивость содержания воды между различными органами.
- . Добавить 500 мкл формамида в каждую пробирку образец ткани.
- Перенесите все трубы на 55 ° C ванну воды или тепла блока. Выдержите в течение 24-48 часов, чтобы извлечь Evans Blue из ткани.
3. Количественное Evans Blue Extravasated в интерстициальной ткани
- Центрифуга Формамид / Evans Blue смесь гранул оставшихся фрагментов ткани.
- Измерьте абсорбцию при 610нм. Используйте 500 мкл Формамид как пустые.
- Расчет нг Evans Blue extravasated в тканях мг.
- Постройте все данные в виде графика.
- Выполнить статистический анализ для определения существенных различий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы использовали в анализе проницаемость естественных для проверки судна утечки на мышах 8-12 недель. Этот тест полезен при сравнении относительной проницаемости сосудов между животными разных генетических фоне или в один штамм мышей, подвергавшихся лечения, которые влияют на сосудистую систему. Наши результаты показывают, что штамм генетически модифицированных мышей, которые мы создали в нашей лаборатории имеет более проницаемыми эндотелия по сравнению с мышами дикого типа. Эти изменения очевидны на макроскопическом уровне во многих органах (рис. 1).
Мы смогли определить разницу в емкости проницаемости spectophotometricaly измерения Evans Blue, который был захвачен на грамм ткани в различных органах. Как мы видели на рисунке 2 различных органов показывают разные реакции на сигналы проницаемость индуктора и таким образом показать различные накопления красителя. Это также зависит от уровня васкуляризации в различных тканях.
Рисунок 1. Evans Blue Экстравазация в тканях. Через 30 минут после мышам инъекции голубого Эванса были принесены в жертву путем смещения шейных позвонков. Представитель изображения органов интересов были приняты.
Рисунок 2. Количественный экстравазации Evans Blue в различных тканях. 50-100 мг ткани инкубировали с 500 мкл формамида для извлечения extravasated Evans Blue. Оптическая плотность измеряли при 610 нм и измерения преобразуются в нг красителя в ткань extravasated мг. Эксперимент был повторен три раза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Проницаемости сосудов является важным маркером для крови статуса судна. Повышенная проницаемость сосудов, как было показано присутствовать в нескольких системных заболеваний, включая диабет, гипертонию и аутоиммунных заболеваний 6,7,8. Повышенная проницаемость сосудов была показана при посредничестве напряжения сдвига, факторы роста, как фактор роста эндотелия сосудов и фактора роста фибробластов, воспалительных медиаторов, как серотонин, гистамин и брадикинин 9. Экстравазация воды и небольших молекул, как полагают, происходит через небольшие отверстия между клетками эндотелия. Сила клетки к клетке переходы строго регламентируется взаимодействие между молекулами 10.
В физиологических условиях эндотелий является проницаемой для воды и ионов и непроницаема для белков. Таким образом, при отсутствии воспалительных стимулов, альбумин ограничивается приток крови и не двигается во внеклеточной жидкости. Вводя Eфургоны синий, краситель, который связывается альбумином, мы можем контролировать степень утечки белка из крови в интерстициальную ткань.
Модифицированная версия этого анализа используются флуоресцентные-меченных микросфер. При использовании различных размеров микросфер или различной молекулярной массой флуоресцентного-меченого декстрана (4-70 кДа), можно лучше оценить степень повреждения эндотелия. Однако этот вариант исключает простоты визуализации и она требует фиксации тканей и флуоресцентной микроскопии изображений, или измерение с помощью флуоресцентного ридере.
В лабораторных исследованиях судна проницаемости были успешно использованы в литературе 11. Важным элементом любого исследования в пробирке проницаемость является нетронутым, сливающийся монослой клеток. Эти анализы использовать классическую двойную камеру, где эндотелиальные клетки культивируют в монослое на мембране расположены в верхней палате. Краситель наносится на верхнееКамера и эндотелиальной проницаемости клеточных оценивают путем измерения количества красителя, который достигает нижней палаты. Результаты имитировать в большинстве случаев в естественных результатах анализа. Тем не менее, они не имеют соответствующих физиологических контекст и тем самым осложняется сложностью результаты. В пробирке подход также устраняет роль перициты, клетки, которые, в живых тканей, находятся в тесном контакте с эндотелиальные клетки и посылать сигналы на пролиферацию эндотелиальных клеток, судно роста и ветвления.
Результаты тестов Miles в идеале должна сопровождаться молекулярных исследований, что дальнейшее изучение гипотезы, что проходит испытания. Как уже упоминалось, в целом организме, проницаемость сосудов зависит от многих переменных, и, следовательно, результаты анализа в естественных условиях проницаемости необходимо интерпретировать в свете сложности системы анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никакого конфликта или конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья, R01CA142928.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 | |
References
- Beck, K. F., et al. Inducible NO synthase: role in cellular signaling. J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).
- Bertglia, S., Giusti, A. Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).
- Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs. J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).
- Weis, S. M. Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer. Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).
- Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation. Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).
- Scheppke,, et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability. J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).
- Dvorak, A. M. Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle. Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).
- Le Guelte, A., Gavard, J. Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability. Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).
