Summary
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Abstract
Este método se basa en la inyección intravenosa de azul de Evans en ratones como modelo animal de ensayo. El azul de Evans es un colorante que se une a la albúmina. En condiciones fisiológicas el endotelio es impermeable a la albúmina, por lo azul de Evans albúmina permanece unido restringidos dentro de los vasos sanguíneos. En condiciones patológicas que promueven el aumento de la permeabilidad células endoteliales vasculares pierden parcialmente sus contactos estrechos y el endotelio se vuelve permeable a pequeñas proteínas tales como albúmina. Esta condición permite la extravasación de azul de Evans en los tejidos. Un endotelio sano previene la extravasación del colorante en los tejidos vascularizados vecinos. Los órganos con aumento de la permeabilidad mostrará coloración azul aumentó significativamente en comparación con los órganos con endotelio intacto. El nivel de permeabilidad vascular se puede evaluar por simple visualización o por medición cuantitativa del colorante incorporado por miligramo de tejido de control versus animal experimental / tejido. Dos Powerful aspectos de este ensayo son su simplicidad y características cuantitativas. Colorante azul de Evans se puede extraer de los tejidos mediante la incubación de una cantidad específica de tejido en formamida. Evans Blue es el máximo de absorción a 620 nm y la absorbancia es mínimo a 740 nm. Mediante el uso de una curva estándar para el azul de Evans, medidas de densidad óptica se puede convertir en colorante capturado miligramo por miligramo de tejido. El análisis estadístico se debe utilizar para evaluar las diferencias significativas en la permeabilidad vascular.
Introduction
Formación y mantenimiento de barreras permeables selectivas son esenciales para el desarrollo adecuado de los órganos y 1,2 rendimiento. Las células endoteliales recubren el lumen del vaso sanguíneo y forman una barrera semi-permeable que es esencial en el transporte selectivo entre la sangre y el espacio intersticial de todos los órganos. Una barrera de permeabilidad adecuada se mantiene a través de estrechos célula a célula uniones que están estrictamente controladas por factores de crecimiento, citoquinas y otras moléculas relacionadas con el estrés 3. La interrupción de la barrera de células endoteliales puede resultar en aumento de la permeabilidad vascular y las fugas. Estos efectos se observan en diversos estados de enfermedad y la comprensión de la señalización molecular subrayado requiere métodos multidisciplinarios 4,5. En este artículo, se describe un método in vivo para medir la permeabilidad de los vasos utilizando un modelo de ratón.
El ensayo que se describe, también conocido como ensayo de Miles, es un bien establISHED método para probar la permeabilidad vascular in vivo. El ensayo se basa en el hecho de que, bajo condiciones fisiológicas basales, la albúmina no cruza la barrera endotelial. Evans Blue, un colorante azoico con alta afinidad para la albúmina, se inyecta en la corriente sanguínea de un animal experimental, y bajo condiciones fisiológicas, se espera a ser restringido dentro de los vasos sanguíneos. Cuando un estímulo permeabilidad vascular se añade, ya sea tópica o sistémica, los vasos sanguíneos comienzan a gotear proteína y, por tanto, también el azul de Evans que se une a la albúmina. Esto resulta en una coloración azulada rápida de los tejidos que tienen vasos permeables.
Inyección exitosa del colorante en la vena lateral de la cola del ratón es crítica para el buen resultado del experimento. Vena de la cola técnica de inyección requiere una amplia práctica y debe ser dominado antes de iniciar el experimento.
Permeabilidad de los vasos es altamente dependiente de la edad y el peso de la unaimal, por lo que cuando se comparan diferentes cepas de ratón, es imperativo que los ratones u otros sujetos de prueba tienen cerca de las fechas de nacimiento y el peso idénticas. Otros factores que influyen en la permeabilidad de la barrera endotelial son las condiciones ambientales tales como temperatura, humedad, y muy importante, el estrés del manejo del ratón. Debido a la multitud de factores que pueden influir en el resultado del experimento es siempre aconsejable que el experimento se repitió al menos tres veces y el análisis estadístico realizado.
Este ensayo puede ser utilizado para comparar o permeabilidad de los vasos de ratones que han sido modificadas genéticamente, así como los ratones con diferentes fondos genéticos. La permeabilidad puede ser evaluada en presencia o ausencia de un estímulo, dependiendo de la función del gen que se modula. Este ensayo también se puede usar o para probar el efecto de diferentes compuestos sobre la permeabilidad de los vasos.
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Protocol
1. La inyección intravenosa de azul de Evans en la vena lateral de la cola de ratones
- Preparar una solución de 0,5% estéril de azul de Evans en PBS. Si es necesario, filtro-esterilizar la solución para eliminar cualquier material particulado que no se ha disuelto.
- Aspirar 200 l Evans solución azul en una jeringa. Evitar todas las burbujas de aire que podrían haber escapado a la jeringa.
- Coloque los ratones que son 8-12 semanas de edad en un dispositivo de retención para que el animal no es libremente móvil, pero la cola puede ser manejado.
- Coloque el dispositivo de sujeción del ratón sobre su lado para que la vena lateral de la cola es fácilmente visible y están mirando hacia arriba.
- Apóyese en la cola con la mano no dominante entre el pulgar y el índice.
- Insertar la aguja (calibre pequeño, 27-30) en un avance 10-15 grados de ángulo, bisel hacia arriba, en la vena lateral de la cola hacia la dirección de la cabeza. Mantener la aguja y la jeringa paralela a la cola.
- Do No se aplica la presión de retorno para confirmar la colocación adecuada, ya que podría colapsar la vena.
- Inyecte lentamente 200 l solución Evans Blue en la vena de la cola del ratón.
- Observar la facilidad con la que avanza el émbolo, ya que esta es la prueba de la colocación correcta de la aguja en la vena.
- Ponga el ratón de nuevo en su jaula y observarla durante 30 min.
2. Colección de órganos y extracción de Evans Blue de los Órganos
- El sacrificio de los ratones mediante dislocación cervical. Para fines de ensayo Miles dislocación cervical se recomienda ya que limita la interferencia significativa con la permeabilidad vascular. Sacrificar todos los ratones al mismo tiempo, tan rápido como sea posible. Trabaja con cohortes de 6 ratones o menos, porque poco después de la muerte vasos sanguíneos se vuelven más permeables.
- Coloque los ratones en sus espaldas y ponen sus pies sobre una superficie blanca.
- Abra la cavidad abdominal y torácica para exponer thorACIC y órganos abdominales.
- Tome fotografías representativas para mostrar las diferencias en Evans extravasación de azul. Incluyen todos los ratones en el mismo campo con el fin de tener idénticas condiciones de iluminación para todos los ratones.
- Recoge los órganos de interés y los puso en tubos de 1,5 ml
- Pesar un tubo vacío y llevar el valor del balance a cero.
- Transferir la muestra de tejido y ponderar la misma. Repita para todas las muestras de tejido. Los tejidos pueden ser secadas al aire para eliminar la variabilidad del contenido de agua entre los diferentes órganos.
- . Añadir 500 l de formamida a cada tubo de muestra de tejido.
- Transferir todos los tubos a un baño de agua a 55 ° C o bloque de calor. Incubar durante 24-48 horas para extraer tejido de azul de Evans.
3. La cuantificación de azul de Evans extravasado en el tejido intersticial
- Centrifugar la formamida / mezcla de azul de Evans para sedimentar los fragmentos de tejidos restantes.
- Medir la absorbancia a 610nm. Utilizar 500 l formamida como blanco.
- Calcular ng azul de Evans extravasado por mg de tejido.
- Trazar todos los datos en un gráfico.
- Realizar análisis estadístico para determinar diferencias significativas.
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Representative Results
Hemos utilizado un ensayo de permeabilidad in vivo para probar las fugas buque en ratones 8-12 semanas de edad. Esta prueba es útil para comparar la permeabilidad relativa vascular entre los animales del fondo genético diferente o en una sola cepa de ratones sometidos a tratamientos que afectan a la vasculatura. Nuestros resultados muestran que una cepa de ratones genéticamente modificados que hemos creado en nuestro laboratorio cuenta con un endotelio más permeable en comparación con ratones de tipo salvaje. Estos cambios son evidentes a nivel macroscópico en muchos órganos (Figura 1).
Hemos sido capaces de cuantificar la diferencia en la permeabilidad de los vasos por la medición de la spectophotometricaly azul de Evans que fue capturado por gramo de tejido en diferentes órganos. Como se observa en la figura 2 diferentes órganos muestran una respuesta diferente a las señales inductoras de permeabilidad y así mostrar acumulación tinte diferente. Esta es también una función de los niveles de vascularización en diferentes tejidos.
Figura 1. Evans extravasación de azul en los tejidos. 30 minutos después de inyección de azul de Evans ratones fueron sacrificados por dislocación cervical. Imágenes representativas de los órganos de interés fueron tomadas.
Figura 2. La cuantificación de la extravasación de azul de Evans en diferentes tejidos. 50-100 mg de tejido se incubaron con 500 l de formamida para extraer el azul de Evans extravasado. La densidad óptica se midió a 610 nm y las mediciones transformar en colorante extravasado ng por mg de tejido. El experimento se repitió tres veces.
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Discussion
La permeabilidad vascular es un marcador crítico para el estado de los vasos sanguíneos. Aumento de la permeabilidad vascular se ha demostrado que está presente en varias enfermedades sistémicas, incluyendo la diabetes, la hipertensión y las enfermedades autoinmunes 6,7,8. Aumento de la permeabilidad vascular ha demostrado ser mediada por esfuerzo cortante, factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento endotelial vascular y el factor de crecimiento de fibroblastos, mediadores de la inflamación como la serotonina, la histamina y la bradiquinina 9. La extravasación de agua y las moléculas pequeñas se cree que ocurre a través de pequeñas aberturas entre las células endoteliales. La fuerza de las uniones célula a célula está estrictamente regulada por la interacción entre las moléculas 10.
En condiciones fisiológicas endotelio es permeable al agua y los iones, e impermeable a las proteínas. Por lo tanto, en ausencia de estímulos inflamatorios, albúmina está restringido al flujo de sangre y no se mueve en el fluido extracelular. Mediante la inyección de Efurgonetas Blue, un tinte que se une a la albúmina, se puede supervisar el grado de pérdida de proteínas de la corriente de sangre en el tejido intersticial.
Una versión modificada de este ensayo utiliza microesferas marcadas con fluorescencia. Mediante el uso de diferente tamaño de microesferas o diferente peso molecular fluorescente marcada con dextrano (4-70 KDa) uno puede evaluar mejor el grado de lesión endotelial. Sin embargo, esta opción elimina la facilidad de visualización y requiere la fijación de los tejidos y formación de imágenes de microscopía fluorescente, o la medida usando un lector de placas de fluorescencia.
En estudios in vitro de permeabilidad de los vasos se han utilizado con éxito en la bibliografía 11. Un ingrediente esencial de cualquier estudio de permeabilidad in vitro es una monocapa de células intactas, células confluentes. Estos ensayos utilizan una cámara de doble clásica donde las células endoteliales se cultivan en una monocapa sobre una membrana permeable situada en la cámara superior. Un colorante se aplica a la parte superiorcámara y la permeabilidad de las células endoteliales se evalúa midiendo la cantidad de colorante que llega a la cámara inferior. Los resultados imitar en la mayoría de los casos en los resultados del ensayo in vivo. Sin embargo, carecen del contexto fisiológico apropiado y con ello se complica por la complejidad de los resultados. El enfoque in vitro también elimina el papel de los pericitos, células que, en tejidos vivos, están en estrecho contacto con las células endoteliales y enviar señales para la proliferación de células endoteliales, el crecimiento de vasos y la ramificación.
Los resultados de las pruebas Miles idealmente deberían ir acompañadas de estudios moleculares que examinar más a fondo la hipótesis de que se está probando. Como se ha mencionado, en un organismo completo, la permeabilidad vascular depende de muchas variables, y por lo tanto los resultados de un ensayo de permeabilidad in vivo deben ser interpretadas a la luz de la complejidad del sistema analizado.
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Disclosures
Los autores no tienen conflicto o competencia de los intereses financieros.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud, R01CA142928.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 | |
References
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