Summary
Biz sunuyoruz
Abstract
Bu yöntem, deney hayvan modeli olarak, farelerde Evans Blue intravenöz enjeksiyon esas alınmaktadır. Evans mavisi albümin bağlayan bir boyadır. Fizyolojik koşullarda endotel albümin geçirmez, yani Evans mavisi ciltli albümini kalıntıları kan damarları içinde sınırlı. Artmış vasküler permeabilite endotel hücreleri teşvik patolojik koşullarda kısmen onların yakın temas kaybetmek ve endotel albumin gibi küçük proteinlerin geçirgen hale gelir. Bu durum dokularda Evans Mavisi ekstravazasyonu sağlar. Sağlıklı bir endotelin komşu damarlı dokularda boya ekstravazasyonu önler. Artan geçirgenlik sahip organlar sağlam endotel ile organlara kıyasla önemli ölçüde artmıştır mavi rengi gösterecektir. Vasküler permeabilite seviyesi basit görselleştirme veya deneysel hayvan / doku karşı kontrol doku miligram başına dahil boya kantitatif ölçümü ile değerlendirilebilir. İki poweBu testin rful yönlerini sadeliği ve kantitatif özellikleri vardır. Evans mavisi formamid doku belirli bir miktarda bekletilmeleri ile ekstrakte edilebilir. Evans Blue absorbans maksimum 620 nm'de ve absorbans asgari 740 nm'de olduğunu. Evans Mavisi için bir standart eğri kullanılarak, optik yoğunluk ölçümleri doku başına miligram çekilen miligram boya haline dönüştürülebilir. İstatistiksel analiz vasküler geçirgenliği önemli farklılıkları değerlendirmek için kullanılmalıdır.
Introduction
Seçici geçirgen engellerin Oluşumu ve bakım uygun organ gelişimi ve performansı 1,2 için gereklidir. Endotel hücreleri hattı damar lümeni ve kan ve tüm organları interstisyel boşluk arasında seçici ulaşım esastır yarı geçirgen bir bariyer oluşturur. Yeterli bir geçirgenlik bariyer sıkı bir şekilde büyüme faktörleri, sitokinler ve diğer stres bağlantılı moleküllerin 3 tarafından kontrol edilmektedir sıkı hücre-hücre birleşme yoluyla korunur. Endotel hücre bariyerin bozulması artmış geçirgenlik ve vasküler sızmasına neden olabilir. Bu etkiler, çeşitli hastalık durumlarında görülür ve altı çizili olan moleküler sinyalizasyonun anlayış multidisipliner yöntemlerin 4,5 gerektirir edilir. Bu yazıda, bir fare modeli kullanılarak damar geçirgenliğini ölçmek için in vivo yöntemi bir tarif.
Ayrıca Miles test olarak bilinir tanımlamakta olduğumuz testi, iyi establ olduğunuin vivo vasküler permeabilite test yöntemi ished. Tahlil bazal fizyolojik koşullar altında, albümin endotel bariyer çapraz değil, gerçeğine dayanır. Evans Mavisi, albümin için yüksek afinitesi olan bir azo boyası, deneysel bir hayvan, kan dolaşımında enjekte edilir, ve fizyolojik koşullar altında, bu kan damarları içinde sınırlı olması beklenmektedir. Bir vasküler geçirgenlik uyarıcı eklendiği zaman, ya da topikal veya sistemik olarak, kan damarlarını albümin bağlı Evans mavisi da, böylece protein sızdırmaya başlar ve. Geçirgen damarlar vardır dokuların hızlı bir mavi renk elde edilir.
Fare yanal kuyruk damarı içinde boya başarılı bir şekilde enjeksiyon deney iyi sonuç için kritik önem taşır. Kuyruk ven enjeksiyon tekniği kapsamlı uygulama gerektirir ve deney başlamadan önce hakim olmalıdır.
Gemi geçirgenliği bir yaşına ve ağırlığına son derece bağlıdırolmuş bölgeler, çok farklı fare suşları karşılaştırırken bu fareler veya diğer deneklere aynı doğum tarihleri ve kilosuna yakın olması şarttır. Endotel bariyer geçirgenliğini etkileyen diğer faktörler, sıcaklık, nem gibi çevresel koşullar ve çok önemlisi, fare kullanımı stres. Deney sonucunu etkileyebilecek faktörlerin çokluğu nedeniyle bu deney en az üç kez ve istatistiksel analiz yapılır tekrarlanır olduğunu her zaman tavsiye edilir.
Bu tahlil, damar genetik olarak modifiye edilmiş farelerin geçirgenlik yanı sıra, farklı genetik geçmişe sahip fareler veya karşılaştırmak için kullanılabilir. Geçirgenlik modüle edilen gen fonksiyonu bağlı olarak, bir uyarıcı varlığında ya da yokluğunda bir biçimde tespit edilebilir. Bu tahlil, ayrıca damar geçirgenliğini farklı bileşiklerin etkisini test etmek için ya da kullanılabilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fare Yanal Tail Ven içinde Evans Blue İntravenöz Enjeksiyon
- PBS içinde Evans mavisi% 0.5 'lik steril çözelti hazırlayın. Gerekirse, çözünmüş henüz herhangi bir partikül madde kaldırmak için çözüm filtre sterilize.
- Bir enjektöre 200 ul Evans Blue çözüm aspire. Şırıngaya kaçmış olabilir tüm hava kabarcıkları kaçının.
- Hayvan serbestçe mobil değil ama kendi kuyruğunu ele alınabilir böylece bir kısıtlama cihaza 8-12 hafta eski il fareler.
- Böylece lateral kuyruk ven kolayca görülebilir ve yukarı bakacak şekilde yan fare emniyet cihazı yerleştirin.
- Başparmak ve işaret parmağı arasında baskın olmayan elle Kuyruğunu tut.
- Baş yönünde yanal kuyruk ven içine 10-15 derecelik açı, eğim yukarı, önceden de iğne (küçük ölçü, 27-30) yerleştirin. Kuyruk iğne ve şırınga paralel tutun.
- Do Bu damar çökebilir olarak uygun yerleştirme onaylamak için basınç geri geçerli değildir.
- Yavaşça fare kuyruk ven 200 ul Evans Blue enjekte çözüm.
- Piston gelişmeler, bu gibi damar iğnenin doğru yerleştirme kanıtıdır kolaylığını gözlemleyin.
- Onun kafesine geri fare koyun ve 30 dakika için bunu gözlemlemek.
2. Organ Organ Toplama ve Evans Blue Ekstraksiyon
- Servikal dislokasyon yoluyla farelerin Kurban. Bu damar geçirgenliği ile önemli girişim sınırlar gibi Miles tahlil amacıyla servikal dislokasyon önerilir. Mümkün olduğunca hızlı ve aynı zamanda tüm fareler kurban edin. Ölüm kan damarlarının daha geçirgen hale kısa bir süre sonra, çünkü 6 fareler veya daha az tabur ile çalışın.
- Sırtlarında fareler yerleştirin ve bir beyaz tahta üzerinde kendi ayakları pin.
- Thor maruz karın ve göğüs boşluğu açınacic ve karın organları.
- Evans Blue ekstravazasyonu farklılıkları göstermek için temsili fotoğraflar çekin. Tüm fareler için aynı aydınlatma koşullarına sahip olmak için aynı alanda tüm fareler ekleyin.
- Ilgi organları toplayın ve 1.5 ml tüpler koydu
- Boş tüp tartılır ve sıfır bakiye değer getirmek.
- Doku örneği aktarın ve kilo. Tüm doku örnekleri için yineleyin. Dokular hava farklı organlar arasında su içeriği değişkenlik ortadan kaldırmak için kurutulabilir.
- . Her doku örneği tüpüne 500 ul formamid ekleyin.
- 55 ° C su banyosu veya ısıtma bloğu tüm tüpler aktarın. Dokudan Evans Blue ayıklamak için 24-48 saat süreyle inkübe edin.
3. Evans Blue Kantitasyonu İnterstisyel Doku ekstravaze
- Pelet kalan doku parçaları için Formamid / Evans Blue karışımı santrifüjleyin.
- 610 absorbans ölçülürnm. Boş olarak 500 ul Formamid kullanın.
- Hesapla ng Evans Blue mg doku başına ekstravaze.
- Bir grafikte tüm veriler çizilir.
- Önemli farklılıklar belirlemek için istatistiksel analiz gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz 8-12 hafta Yaşlı farelerde damar kaçaklarının tespitinde in vivo geçirgenliği tayininde kullanılır. Bu test, farklı genetik arka plan hayvanlar arasında veya damar sistemi etkileyen işlemlere tabi fareler tek bir gerilme içinde göreli damar geçirgenliğini karşılaştıran yararlıdır. Bizim sonuçlar bizim laboratuarda yaratılmış genetiği değiştirilmiş farelerin bir gerginlik yabani tip farelere göre daha geçirgen endotele sahip olduğunu göstermektedir. Bu değişiklikler birçok organda makroskopik düzeyde (Şekil 1) belirgindir.
Bu spectophotometricaly çeşitli organlarda gram doku başına yakalandığı Evans Mavisi ölçülmesi ile damar geçirgenliğinde fark ölçmek mümkün. Biz Şekil görüldüğü gibi 2 farklı organ geçirgenliği indükleyici sinyal için farklı tepki gösterebilir ve böylece farklı boya birikimini göstermektedir. Bu ayrıca farklı dokularda vaskülarizasyon seviyelerinin bir fonksiyonudur.
Şekil 1. Dokularda Evans Blue ekstravazasyonu. Evans mavisi enjeksiyonu fareler 30 dakika sonra servikal dislokasyon ile sakrifiye edildi. Ilgi organlarının Temsilcisi fotoğraf çekildi.
Şekil 2. Evans Mavisi ekstravazasyon kantitasyonu farklı dokularda. 50-100 mg doku damar dışına Evans Mavisi elde etmek için 500 ul formamid ile inkübe edildi. Optik yoğunluk 610 nm ve mg doku başına ekstravaze ng boya dönüştürülmüş ölçümleri ölçüldü. Deney üç kez tekrarlandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Damar geçirgenliği kan damarı durumu için kritik bir göstergesidir. Artan vasküler permeabilite diyabet, hipertansiyon ve otoimmün hastalıklar 6,7,8 dahil olmak üzere çeşitli sistemik hastalıklar, mevcut olduğu gösterilmiştir. Artan vasküler permeabilite kayma gerilmesi aracılık gösterilmiştir, vasküler endotelyal büyüme faktörü ve fibroblast büyüme faktörü, serotonin, histamin ve 9 bradikinin gibi yangı benzeri büyüme faktörleri. Su ve küçük moleküller ekstravazasyonu endotel hücreleri arasında küçük deliklerden oluştuğu düşünülmektedir. Hücre-hücre birleşme kuvveti kesinlikle moleküller 10 arasındaki etkileşim ile düzenlenir.
Fizyolojik koşullarda endotel su ve iyon geçirgen ve proteinleri geçirmez. Böylece, enflamatuar uyarıcı yokluğunda, albümin kan akımı ile sınırlıdır ve hücre dışı sıvı içine hareket etmez. E enjekte ederekvanlar Mavi, albümin bağlayan bir boya, biz interstisyel doku içine kan akışı protein kaçağı ölçüde izleyebilirsiniz.
Bu testte değiştirilmiş bir versiyonu floresan-etiketli mikrosferler kullanır. Farklı boyut mikroküreler veya farklı moleküler ağırlık floresan-etiketli dekstran (4-70 kDa) kullanarak tek bir iyi endotelyal hasarın boyutunu değerlendirmek olabilir. Ancak, bu seçenek görselleştirme kolaylığı ortadan kaldırır ve bir floresan plak okuyucu kullanarak dokuları ve floresan mikroskobu görüntüleme, veya ölçme sabitleme gerektirir.
In vitro damar geçirgenliği çalışmaları literatürde 11 başarıyla kullanılmaktadır. Vitro permeabilite çalışmada herhangi bir temel madde bozulmamış bir, birleşik hücre monolayer olduğunu. Bu testler endotel hücreleri üst odasında bulunan bir geçirgen zarın üzerinde tek tabaka halinde kültüre klasik çift hazne kullanın. Bir boya üst uygulanankamara ve endotel hücre geçirgenliği alt kanadı ulaşır boya miktarını ölçerek değerlendirilir. Elde edilen sonuçlar, in vivo tahlil sonuçları, çoğu durumda taklit eder. Ancak, uygun fizyolojik içerikten yoksun ve böylece sonuçların karmaşıklığı ile komplike olur. Vitro yaklaşım da perisitler, canlı dokularda, endotel hücreleri ile yakın temas halinde olduklarını ve endotel hücre proliferasyonu, damar büyüme ve dallanma için sinyalleri göndermek hücrelerin rolünü ortadan kaldırır.
Miles test sonuçları ideal daha fazla test ediliyor hipotezini incelemek moleküler çalışmalara eşlik etmelidir. Belirtildiği gibi, bütün bir organizma içinde, vasküler geçirgenlik birçok değişkene bağlıdır, ve bu nedenle in vivo olarak bir geçirgenlik deneyi sonuçları analiz sisteminin karmaşıklığı ışığında yorumlanacaktır gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çatışma veya rekabet mali çıkarları var.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, R01CA142928 bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 | |
References
- Beck, K. F., et al. Inducible NO synthase: role in cellular signaling. J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).
- Bertglia, S., Giusti, A. Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).
- Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs. J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).
- Weis, S. M. Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer. Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).
- Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation. Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).
- Scheppke,, et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability. J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).
- Dvorak, A. M. Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle. Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).
- Le Guelte, A., Gavard, J. Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability. Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).
