Published: March 16, 2013 doi: 10.3791/50062

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Maria Radu¹, Jonathan Chernoff¹

¹Fox Chase Cancer Center

Summary

אנו מציגים

Abstract

שיטה זו מבוססת על הזרקה תוך ורידית של אוונס הכחול בעכברים כמודל חית המבחן. אוונס הכחול הוא צבע שנקשר אלבומין. בתנאים פיסיולוגיים האנדותל בלתי חדיר לאלבומין, כך שרידי אלבומין כריכה כחולה אוונס מוגבל בתוך כלי דם. בתנאים פתולוגיים שמקדמים חדירות תאי אנדותל כלי דם מוגבר באופן חלקי לאבד הקשר הקרוב שלהם והאנדותל הופך חדיר לחלבונים קטנים כגון אלבומין. מצב זה מאפשר לextravasation של אוונס הכחול ברקמות. האנדותל בריא מונע extravasation של הצבע ברקמות כלי הדם הסמוכות. איברים עם חדירות מוגברות יציגו צבע כחול גדל באופן משמעותי בהשוואה לאיברים עם האנדותל בשלמותה. רמת חדירות כלי דם יכולה להיות מוערכת על ידי הדמיה פשוטה או על ידי מדידת כמותית של הצבע המשולבת למיליגרם של רקמה של שליטה מול חיים / רקמות ניסיוניות. שני poweהיבטי rful של assay זה הם הפשטות שלו ומאפייני כמותיים. אוונס הכחול צבע ניתן לחלץ מרקמות על ידי דוגר כמות מסוימת של רקמה בפוראמיד. מרבית הספיגה הכחולה אוונס הוא בעמ '620 ננומטר וספיגה מינימאלית היא ב740 ננומטר. באמצעות עקומת סטנדרט עבור אוונס הכחול, מדידות צפיפות אופטיות ניתן להמיר את צבע מיליגרם כבש למיליגרם של רקמה. ניתוח סטטיסטי יש להשתמש כדי להעריך הבדלים משמעותיים בחדירות כלי דם.

Introduction

גיבוש ותחזוקה של מחסומים חדירים סלקטיבית הם חיוניים להתפתחות איבר תקין ^ו1,2 ביצועים. תאי האנדותל קו לום כלי הדם ויוצרים מחסום חדיר למחצה כי הוא חיוני בהובלה סלקטיבית בין הדם למרחב ביניים של כל האיברים. מחסום חדירות נאותות נשמר באמצעות צומת תא לתא צפופים הנשלטים בקפידה על ידי גורמי גדילה, ציטוקינים ומולקולות הקשורות מתח אחרות ^3. שיבוש של מכשול התא האנדותל יכול לגרום לחדירות מוגברות ודליפה של כלי דם. תופעות אלו נצפות במצבי מחלה שונים וההבנה של האיתות המולקולרית הקו התחתונה דורשת שיטות רבות תחומיות ^4,5. במאמר זה, אנו מתארים בשיטת vivo למדוד חדירות כולים תוך שימוש במודל עכבר.

הבדיקה שאנחנו מתארים, הידוע גם כassay מיילס, היא-establ גםished שיטה לבדיקת חדירות כלי דם בגוף חי. הבדיקה מתבססת על העובדה שבתנאים פיסיולוגיים בסיסיים, אלבומין אינו חוצה את מחסום אנדותל. אוונס הכחול, צבע אזו עם זיקה חזקה לאלבומין, מוזרק לזרם הדם של בעלי חיים הניסיונות, ובתנאים פיסיולוגיים, אך הוא צפוי להיות מוגבל בתוך כלי דם. כאשר גירוי חדירות כלי דם נוסף, או topically או מערכתי, כלי דם מתחילים לדלוף חלבון ובכך, גם הכחול אוונס שהוא חייב אלבומין. התוצאה היא גוון כחלחל מהיר של רקמות שיש להם כולים חדירים.

זריקה מוצלחת של הצבע בוריד זנב העכבר לרוחב היא קריטית לתוצאות הטובות של הניסוי. טכניקת הזרקת וריד זנב דורשת תרגול רב וצריכה להיות שולטת לפני תחילת הניסוי.

חדירות כלי תלויות מאוד בגיל ובמשקל שלimal, ולכן כאשר משווים זנים שונים של עכברים הוא הכרחי כי העכברים או נושאים אחרים יש מבחן קרוב לתאריכי לידה זהים ומשקל. גורמים אחרים המשפיעים על החדירות של מחסום אנדותל הם תנאים סביבתיים כגון טמפרטורה, לחות, ומאוד חשוב, מתח הטיפול בעכבר. בשל ריבוי גורמים שיכולים להשפיע על התוצאה של הניסוי זה תמיד רצוי שהניסוי חוזר על עצמו לפחות שלוש פעמים וניתוחים סטטיסטיים בוצעו.

בדיקה זו יכולה לשמש או להשוואת חדירות כלי של עכברים שעברו שינוי גנטי, כמו גם עכברים עם רקע גנטי שונה. חדירות ניתן להעריך בנוכחותו או היעדריו של גירוי, בהתאם לפונקציה של הגן שהוא מווסת. assay זה יכול לשמש גם או כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות שונות בחדירות כלי דם.

Protocol

1. הזרקה תוך ורידית של אוונס הכחול בוריד זנב העכבר לרוחב

1. הכן 0.5% תמיסה סטרילית של אוונס הכחול ב PBS. במידת צורך, מסנן-לעקר את הפתרון כדי להסיר כל חומר חלקיקים שאינו מומס.
2. לשאוב פתרון 200 μl אוונס הכחול לתוך מזרק. הימנע מכל בועות האוויר שאולי נמלטו לתוך המזרק.
3. עכברי מקום שהם ישנים 8-12 שבועות לתוך מכשיר איפוק כדי שבעל החיים אינם חופשי ניידים אבל זנבו ניתן לטפל.
4. הנח את מכשיר איפוק העכבר על צידו כך וריד הזנב לרוחב הוא נראה בקלות והם פונים כלפי מעלה.
5. להחזיק את הזנב עם היד הלא הדומיננטית בין האגודל לאצבע המורה.
6. הכנס את המחט (מד קטן, 27-30) בזווית של 10-15 מעלות, שיפוע למעלה, מראש לתוך וריד הזנב לרוחב לכיוונו של הראש. שמור מקביל מחט מזרק ועד הזנב.
7. Do לא תחול שוב לחץ לאישור המיקום נכון שכן דבר עלול לכווץ את הווריד.
8. לאט לאט להזריק פתרון 200 μl אוונס הכחול בוריד הזנב של העכבר.
9. הקפד על קלות שבה התקדמות הבוכנה, כמו זה היא ההוכחה למיקום נכון של המחט בווריד.
10. שים את העכבר בחזרה לכלוב שלו ולבחון אותו למשך 30 דקות.

2. אוסף איברים והפקת אוונס הכחול מהאיברים

1. להקריב את העכברים דרך נקע בצוואר רחם. למטרות assay מיילס נקע צוואר רחם מומלץ משום שהוא מגביל את התערבות משמעותית בחדירות כלי דם. להקריב את כל העכברים באותו הזמן, מהר ככל האפשר. עבודה עם קבוצות של 6 עכברים או פחות, משום שזמן קצר לאחר שכלי הדם של מוות נעשים חדירים יותר.
2. מקם את העכברים על גבם ולהצמיד את רגליהם על לוח לבן.
3. פתח את חלל הבטן ובית החזה כדי לחשוף Thorאיברי acic ובטן.
4. קח תמונות מייצגות כדי להראות הבדלים בextravasation הכחול אוונס. כלול את כל העכברים באותו השדה כדי שתהיה לי תנאי תאורה זהות לכל העכברים.
5. איסוף איברים של עניין ולשים אותם בצינורות 1.5 מ"ל
6. שוקל צינור ריק ולהביא את ערך האיזון לאפס.
7. העברת דגימת הרקמה ומשקלו. חזור על פעולה עבור כל דגימות הרקמה. רקמות יכולות להיות אוויר יבש כדי לחסל את שונות תכולת המים בין איברים שונים.
8. . הוסף פוראמיד μl 500 לכל צינור דגימת רקמה.
9. להעביר את כל הצינורות לאמבטית 55 ° C מים או בלוק חום. דגירה במשך 24-48 שעות כדי לחלץ אוונס הכחול מרקמות.

3. כימות של אוונס הכחול Extravasated ברקמות ביניים

1. צנטריפוגה פוראמיד / התערובת הכחולה אוונס לגלולה כל ברי רקמה נותרות.
2. מדוד ספיגה ב610ננומטר. השתמש פוראמיד μl 500 כריקים.
3. חישוב ng אוונס הכחול extravasated לרקמת מ"ג.
4. עלילה כל הנתונים בגרף.
5. ביצוע ניתוח סטטיסטי כדי לקבוע הבדלים משמעותיים.

Representative Results

אנחנו השתמשנו בבדיקת חדירות vivo לבדוק זליגת כלי בעכברים 8-12 שבועות ישנים. בדיקה זו היא שימושית בהשוואת חדירות כלי דם היחסיות בין בעלי חיים של רקע גנטי שונה או בזן אחד של עכברים הנתונים לטיפולים המשפיעים על מערכת כלי הדם. התוצאות שלנו מראות כי זן של עכברים מהונדסים גנטי שנוצרנו במעבדה שלנו יש האנדותל חדיר יותר בהשוואה לעכברי סוג פראי. שינויים אלה ניכרים ברמת מקרוסקופית באיברים רבים (איור 1).

היינו מסוגל לכמת את ההבדל בחדירות כולים ידי מדידת אוונס הכחול שנתפס לגרם של רקמות באיברים שונים spectophotometricaly. כפי שראינו באיור 2 מראים איברים שונים תגובה שונה לאותות inducer חדירות ובכך להראות הצטברות צבע שונה. זו גם פונקציה של הרמות של כלי דם ברקמות שונות.

= Fo "jove_content": לשמור-together.within עמודים = "תמיד">
איור 1. Extravasation אוונס הכחול ברקמות. 30 דקות לאחר הזרקת עכברים כחולים אוונס הוקרבו דרך נקע בצוואר רחם. תמונות מייצגות של איברים של עניין בו צולמה.

איור 2. לכמת את extravasation הכחול אוונס ברקמות שונות. רקמת 50-100 מ"ג הודגר עם פוראמיד μl 500 לחלץ extravasated אוונס הכחול. צפיפות אופטית נמדדה ב 610 ננומטר והמדידות להמרה לצבע ng extravasated לרקמת מ"ג. הניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים.

Discussion

חדירות כלי דם היא סמן קריטי למצב כלי דם. חדירות כלי דם מוגבר הוכחה להיות נוכח בכמה מחלות מערכתיות, כולל סוכרת, יתר לחץ דם, ומחלות אוטואימוניות ^6,7,8. חדירות כלי דם מוגבר הוכחה להיות מתווכות על ידי מאמץ גזירה, גורמי גדילת כלי דם האנדותל כמו גורם גדילה ופקטור גדילה פיברובלסטים, מתווכים דלקתיים כמו סרוטונין, היסטמין וbradykinin ^9. Extravasation של מים ומולקולות קטנות הוא חשב להתרחש דרך פתחים קטנים בין תאי האנדותל. כוחו של צומת תא לתא מווסת בקפדנות על ידי אינטראקציה בין מולקולות ^10.

בתנאים פיסיולוגיים האנדותל הוא חדיר למים ויונים, ובלתי חדיר לחלבונים. לפיכך, בהיעדר גירויים דלקתיים, אלבומין מוגבל לזרימת הדם ולא זז לנוזל החוץ התאי. באמצעות הזרקת Eטנדרים כחולים, צבע שנקשר אלבומין, אנו יכולים לפקח על היקף דליפת חלבון מזרם הדם לרקמת ביניים.

גרסה שונה של assay זה משתמשת microspheres ניאון שהכותרת. באמצעות הגודל microspheres השונה או משקל מולקולרי שונה ניאון מתויג-dextran (4-70 KDA) אחד טוב יותר יכול להעריך את מידת ניזק אנדותל. עם זאת, אפשרות זו מבטלת את ההקלות של הדמיה וזה דורש תיקון הרקמות וההדמיה מיקרוסקופית ניאון, או המדידה באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי.

במבחנת מחקרים של חדירות כולים שמשו בהצלחה בספרות ^11. מרכיב חיוני של כל מחקר בחדירות מבחנה הוא monolayer תא שלם, מתלכד. מבחנים אלה משתמשים בתא כפול קלסי שבו תאי אנדותל מתורבתים בשכבה בקרום חדיר ממוקם בחדר העליון. צבע מוחל העליוןקאמרי וחדירות תא האנדותל מוערכים על ידי מדידת הכמות של צבע המגיעה לתא התחתון. התוצאות לחקות ברוב המקרים בתוצאות assay vivo. עם זאת, הם חסרים את ההקשר הפיזיולוגי המתאים ובכך מסובכים על ידי המורכבות של תוצאות. בגישת המבחנה גם מבטל את התפקיד של pericytes, תאים שברקמות חיות, נמצאים בקשר הדוק עם תאי אנדותל ולשלוח אותות לשגשוג אנדותל תא, גידול כלי ומסתעף.

תוצאות בדיקת המיילים באופן אידיאלי צריכות להיות מלווה במחקרים מולקולריים שעוד יותר את ההשערה שנבדקה. כאמור, בכל אורגניזם, חדירות כלי דם היא תלויות במשתנים רבים, ולכן התוצאות בבדיקת חדירות vivo צריכות להתפרש לאור המורכבות של המערכת המנותחת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENT
EVANS BLUE	SIGMA	E2129
FORMAMIDE	INVITROGEN	15515-026
PBS			0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4
EQUIPMENT
SPECTROPHOTOMETER	EPPENDORF	952000006
MOUSE RESTRAINT DEVICE	HARVARD APPARATUS	340012
SYRINGE	BD	309659
NEEDLES	BD	305106	The gauge of the needle depends on the size of the animal.
BALANCE	DENVER INSTRUMENT	TP-64