Summary
हम पेश कर रहे हैं
Abstract
इस पद्धति का परीक्षण पशु मॉडल के रूप में चूहों में इवांस ब्लू की नसों में इंजेक्शन पर आधारित है. इवांस नीले एक डाई कि albumin बांधता है. शर्तों के तहत शारीरिक endothelium albumin के लिए अभेद्य है, तो रक्त वाहिकाओं के भीतर प्रतिबंधित इवांस नीले बाध्य albumin बनी हुई है. वैकृत शर्तों है कि बढ़ संवहनी पारगम्यता endothelial कोशिकाओं को बढ़ावा देने में आंशिक रूप से उनके निकट संपर्क खो और endothelium albumin जैसे छोटे प्रोटीन पारगम्य हो जाता है. इस हालत इवांस ब्लू के ऊतकों में परिस्त्राव के लिए अनुमति देता है. एक स्वस्थ पड़ोसी vascularized ऊतकों में endothelium डाई परिस्त्राव रोकता है. बढ़ पारगम्यता के साथ अंग बरकरार endothelium साथ अंगों की तुलना में काफी वृद्धि हुई नीले रंगाई दिखा देंगे. संवहनी पारगम्यता के स्तर साधारण दृश्य या रंग की मात्रात्मक माप प्रयोगात्मक पशु / ऊतक बनाम नियंत्रण के ऊतकों की milligram प्रति शामिल द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. दो poweइस परख के rful पहलुओं अपनी सादगी और मात्रात्मक विशेषताओं हैं. इवांस ब्लू डाई Formamide में एक ऊतक के विशिष्ट राशि incubating द्वारा ऊतकों से निकाला जा सकता है. इवांस ब्लू absorbance अधिकतम 620 एनएम पर है और absorbance न्यूनतम 740 एनएम है. इवांस ब्लू के लिए एक मानक वक्र का उपयोग करके, ऑप्टिकल घनत्व माप milligram ऊतक के milligram प्रति कब्जा कर लिया डाई में परिवर्तित किया जा सकता है. सांख्यिकीय विश्लेषण संवहनी पारगम्यता में महत्वपूर्ण अंतर का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
Introduction
और चयनात्मक पारगम्य बाधाओं का गठन के रखरखाव के उचित अंग विकास और प्रदर्शन 1,2 के लिए आवश्यक हैं. Endothelial कोशिकाओं रक्त वाहिका लुमेन लाइन और अर्द्ध पारगम्य एक बाधा है कि रक्त और सभी अंगों के बीचवाला अंतरिक्ष के बीच परिवहन में चयनात्मक आवश्यक है के रूप में. एक पर्याप्त पारगम्यता बाधा तंग सेल करने वाली सेल जंक्शनों कि कड़ाई से वृद्धि कारकों, साइटोकिन्स और अन्य तनाव संबंधित 3 अणुओं द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं के माध्यम से बनाए रखा है. Endothelial सेल बाधा के विघटन बढ़ पारगम्यता और संवहनी रिसाव में परिणाम कर सकते हैं. इन प्रभावों को विभिन्न रोग राज्यों में देखा जाता है और रेखांकित आणविक संकेतन की समझ multidisciplinary तरीकों 4,5 की आवश्यकता है. इस अनुच्छेद में, हम vivo एक माउस मॉडल का उपयोग करने के लिए पोत पारगम्यता माप पद्धति में एक का वर्णन करता है.
हम वर्णन कर रहे हैं, परख भी मीलों परख के रूप में जाना जाता है, एक अच्छी तरह से establ हैvivo में संवहनी पारगम्यता परीक्षण विधि दंडित. परख तथ्य यह है कि बेसल शारीरिक शर्तों के तहत, albumin endothelial बाधा पार नहीं करता है पर आधारित है. इवांस ब्लू, albumin लिए उच्च आत्मीयता के साथ एक azo डाई, एक प्रयोगात्मक जानवर के रक्त प्रवाह में इंजेक्ट किया जाता है, और शर्तों के तहत शारीरिक, यह रक्त वाहिकाओं के भीतर प्रतिबंधित होने की उम्मीद है. संवहनी पारगम्यता प्रोत्साहन जोड़ा जाता है, जब या तो topically या प्रणालीबद्ध, रक्त वाहिकाओं के लिए प्रोटीन का रिसाव शुरू करने और इस प्रकार, यह भी इवांस ब्लू कि albumin करने के लिए बाध्य है. ऊतकों कि पारगम्य वाहिकाओं है की एक तेजी से नीले रंगाई में यह परिणाम है.
माउस पार्श्व पूंछ नस में डाई के इंजेक्शन सफल प्रयोग के अच्छे परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है. पूंछ नस इंजेक्शन तकनीक व्यापक अभ्यास की आवश्यकता है और पहले प्रयोग प्रारंभ करने में महारत हासिल किया जाना चाहिए.
पोत पारगम्यता और एक की उम्र और वजन पर अत्यधिक निर्भर हैimal, इसलिए जब अलग माउस उपभेदों की तुलना यह जरूरी है कि चूहों या अन्य परीक्षण विषयों के समान जन्म तिथि और वजन करीब है. अन्य कारकों कि endothelial बाधा की पारगम्यता को प्रभावित तापमान, नमी के रूप में पर्यावरण शर्तों रहे हैं, और बहुत महत्वपूर्ण है, माउस के तनाव से निपटने के. कारक है कि प्रयोग के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं की भीड़ के कारण यह हमेशा सलाह दी जाती है कि प्रयोग को दोहराया है कम से कम तीन बार और सांख्यिकीय विश्लेषण किया.
इस परख या इस्तेमाल किया जा सकता है और पोत पारगम्यता चूहों कि आनुवंशिक रूप से संशोधित किया गया है, साथ ही विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ चूहों की तुलना. पारगम्यता उपस्थिति या एक प्रोत्साहन के अभाव में मूल्यांकन किया जा सकता है, जीन है कि संग्राहक के समारोह पर निर्भर करता है. इस परख भी या पोत पारगम्यता पर विभिन्न यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Protocol
1. माउस पार्श्व पूंछ नस में इवांस ब्लू की नसों में इंजेक्शन
- एक 0.5% पीबीएस में इवांस ब्लू बाँझ समाधान तैयार करें. यदि आवश्यक हो, किसी भी कण बात है कि भंग नहीं किया है को दूर करने के लिए समाधान फिल्टर बाँझ.
- एक सिरिंज में 200 μl इवांस ब्लू समाधान Aspirate. सभी हवाई बुलबुले है कि सिरिंज में बच गए सकता से बचें.
- जगह चूहों कि एक संयम डिवाइस में 8-12 सप्ताह पुराने हैं इतना है कि पशु मुक्त रूप से मोबाइल नहीं है, लेकिन इसकी पूंछ संभाला जा सकता है.
- अपने पक्ष पर माउस संयम युक्ति पार्श्व पूंछ नस रखें ताकि आसानी से दिखाई दे रहे हैं और ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है.
- अंगूठे और तर्जनी के बीच गैर प्रमुख हाथ के साथ पूंछ पर पकड़ो.
- सिर के दिशा पार्श्व पूंछ नस में एक 10-15 डिग्री कोण, बेवल, अग्रिम में सुई (छोटे गेज, 27-30) डालें. सुई और सिरिंज पूंछ के समानांतर रखें.
- डीओ के लिए उचित स्थान की पुष्टि के रूप में इस नस पतन हो सकता है दबाव लागू नहीं वापस.
- धीरे धीरे माउस की पूंछ नस में 200 μl इवांस ब्लू समाधान इंजेक्षन.
- जिस आसानी के साथ सवार अग्रिम, इस रूप में नस में सुई के सही स्थान का सबूत है को ध्यान से देखें.
- माउस वापस अपने पिंजरे में डाल दिया है और यह 30 मिनट के लिए निरीक्षण.
2. अंग और अंग से इवांस ब्लू के निष्कर्षण संग्रह
- ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से चूहों बलिदान. मीलों परख प्रयोजनों के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के रूप में यह संवहनी पारगम्यता के साथ महत्वपूर्ण हस्तक्षेप की सीमा की सिफारिश की है. एक ही समय में सभी चूहों बलिदान, जितनी जल्दी हो सके. के बाद शीघ्र ही मृत्यु रक्त वाहिकाओं अधिक पारगम्य हो जाते हैं, क्योंकि कम 6 या चूहों के साथियों के साथ काम करते हैं.
- उनकी पीठ पर चूहों प्लेस और एक सफेद बोर्ड पर अपने पैरों को पिन.
- पेट और वक्ष गुहा thor बेनकाब खोलेंACIC और पेट अंगों.
- प्रतिनिधि तस्वीरें ले लो के लिए इवांस ब्लू परिस्त्राव में मतभेदों को दिखाने के लिए. एक ही क्षेत्र में सभी चूहों को शामिल क्रम में सभी चूहों के लिए समान प्रकाश व्यवस्था की स्थिति है.
- हित के अंगों को ले लीजिए और उन्हें 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में डाल दिया
- एक खाली ट्यूब वजन और शून्य शेष मूल्य लाने.
- स्थानांतरण ऊतक का नमूना और यह वजन. सभी ऊतकों के नमूनों के लिए दोहराएँ. ऊतकों हो सकता है हवा के विभिन्न अंगों के बीच पानी की सामग्री परिवर्तनशीलता को खत्म करने के लिए सूखे.
- . प्रत्येक ऊतक नमूना ट्यूब 500 μl Formamide जोड़ें.
- सभी ट्यूबों को एक 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान या गर्मी ब्लॉक में स्थानांतरित. 24-48 घंटे के लिए सेते ऊतक से इवांस ब्लू निकाल.
3. इवांस ब्लू की मात्रा अंतरालीय ऊतक में Extravasated
- Formamide / गोली किसी भी शेष ऊतक के टुकड़े को इवांस ब्लू मिश्रण अपकेंद्रित्र.
- 610 में absorbance उपायएनएम. रिक्त के रूप में 500 μl Formamide का प्रयोग करें.
- गणना एनजी इवांस ब्लू मिलीग्राम ऊतक प्रति extravasated.
- एक ग्राफ में सभी डेटा प्लॉट.
- सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण मतभेद का निर्धारण.
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Representative Results
हम vivo पारगम्यता परख में इस्तेमाल करने के लिए 8-12 सप्ताह पुराने चूहों में पोत रिसाव का परीक्षण. इस परीक्षण अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के पशुओं के बीच या उपचार है कि vasculature को प्रभावित करने के लिए अधीन चूहों के एक ही तनाव में रिश्तेदार संवहनी पारगम्यता की तुलना में उपयोगी है. हमारे परिणाम बताते हैं कि आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों हम अपनी प्रयोगशाला में बनाया एक तनाव एक जंगली प्रकार के चूहों की तुलना में अधिक पारगम्य endothelium है. इन परिवर्तनों के कई अंगों में macroscopic स्तर (1 चित्रा) में स्पष्ट कर रहे हैं.
हम पोत पारगम्यता में spectophotometricaly इवांस ब्लू कि विभिन्न अंगों में ऊतक के प्रति ग्राम पर कब्जा कर लिया गया था मापने के द्वारा अंतर यों करने में सक्षम थे. जैसा कि हम चित्रा में मनाया 2 विभिन्न अंगों पारगम्यता inducer संकेतों को अलग प्रतिक्रिया दिखाते हैं और इस प्रकार विभिन्न डाई संचय दिखा. यह भी विभिन्न ऊतकों में vascularization के स्तर के एक समारोह है.
चित्रा 1. इवांस ऊतकों में ब्लू extravasation इवांस नीले इंजेक्शन चूहों के बाद 30 मिनट. ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से बलिदान किया गया. ब्याज के अंगों के प्रतिनिधि तस्वीरें ले जाया गया.
चित्रा 2. Quantitation इवांस ब्लू परिस्त्राव के विभिन्न ऊतकों में 50-100 मिलीग्राम ऊतक. 500 μl extravasated इवांस ब्लू निकाल Formamide के साथ incubated किया गया था. ऑप्टिकल घनत्व 610 एनएम और एनजी प्रति मिलीग्राम ऊतक extravasated डाई में परिवर्तित माप पर मापा गया था. प्रयोग तीन बार दोहराया गया था.
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Discussion
संवहनी पारगम्यता रक्त वाहिनियों की स्थिति के लिए एक महत्वपूर्ण मार्कर है. बढ़ संवहनी पारगम्यता मधुमेह, उच्च रक्तचाप, और autoimmune 6,7,8 रोगों सहित कई प्रणालीगत रोगों में उपस्थित होना दिखाया गया है. बढ़ संवहनी पारगम्यता कतरनी तनाव द्वारा मध्यस्थता होना दिखाया गया है, संवहनी endothelial वृद्धि कारक और fibroblast वृद्धि कारक, serotonin histamine, और 9 bradykinin जैसे भड़काऊ मध्यस्थों की तरह वृद्धि कारक है. पानी और छोटे अणुओं की extravasation endothelial कोशिकाओं के बीच छोटे खुलने के माध्यम से होने लगा है. सेल करने वाली सेल जंक्शनों की ताकत 10 अणुओं के बीच बातचीत के द्वारा कड़ाई से नियंत्रित किया जाता है.
शारीरिक स्थितियों में endothelium पानी और आयनों के लिए पारगम्य, और प्रोटीन के लिए अभेद्य है. इस प्रकार, भड़काऊ उत्तेजनाओं के अभाव में, रक्त के प्रवाह को albumin प्रतिबंधित है और बाह्य तरल पदार्थ में नहीं ले. इंजेक्शन लगाने के द्वारा ईवैन ब्लू, एक डाई कि albumin बांधता है, हम बीचवाला ऊतकों में रक्त प्रवाह से प्रोटीन रिसाव की सीमा की निगरानी कर सकते हैं.
इस परख का एक संशोधित संस्करण फ्लोरोसेंट लेबल microspheres का उपयोग करता है. विभिन्न आकार microspheres या अलग आणविक भार फ्लोरोसेंट लेबल dextran (4-70 केडीए) का उपयोग करके एक बेहतर endothelial क्षति की हद तक का आकलन कर सकते हैं. हालांकि, इस विकल्प दृश्य के आराम और समाप्त यह ऊतकों और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग, या माप एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर का उपयोग फिक्सिंग करने की आवश्यकता है.
इन विट्रो में पोत पारगम्यता अध्ययन 11 साहित्य में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. इन विट्रो पारगम्यता अध्ययन में किसी की एक आवश्यक घटक एक अक्षुण्ण, संगामी सेल monolayer है. इन assays एक क्लासिक डबल चैम्बर जहां endothelial कोशिकाओं एक monolayer में ऊपरी सदन में स्थित एक पारगम्य झिल्ली पर संवर्धित कर रहे हैं का उपयोग करें. डाई ऊपरी करने के लिए लागू किया जाता हैकक्ष और endothelial सेल पारगम्यता डाई की राशि है कि निचले सदन तक पहुँच को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया है. परिणाम vivo परख परिणामों में ज्यादातर मामलों में नकल. हालांकि, वे उपयुक्त शारीरिक संदर्भ की कमी और जिससे परिणामों की जटिलता से जटिल हैं. इन विट्रो दृष्टिकोण में भी pericytes, कोशिकाओं है कि जीवित ऊतकों में, endothelial कोशिकाओं के साथ निकट संपर्क में हैं और endothelial सेल प्रसार, वाहिका विकास और शाखाओं में बंटी के लिए संकेतों को भेजने की भूमिका समाप्त.
मीलों परीक्षण के परिणाम के लिए आदर्श पढ़ाई आणविक के साथ किया जाना चाहिए कि आगे परिकल्पना है कि जांच की जा रही है जांच. के रूप में उल्लेख किया है, एक पूरे जीव में, संवहनी पारगम्यता कई चर पर निर्भर है, और इस प्रकार पारगम्यता vivo परख में एक का परिणाम प्रणाली की जटिलता के प्रकाश का विश्लेषण में व्याख्या करने की आवश्यकता है.
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Disclosures
लेखक कोई संघर्ष या वित्तीय हितों की प्रतिस्पर्धा है.
Acknowledgments
इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों, R01CA142928 से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 | |
References
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