Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تصور mRNAs والشبكة الإندوبلازمية في خلايا الثدييات المترجمة

Published: December 17, 2012 doi: 10.3791/50066
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry, University of Toronto

Summary

نحن هنا وصف طريقة لتصور الشبكة الهيولية الباطنة المرتبطة mRNAs والثدييات في خلايا الأنسجة. هذا الأسلوب الذي ينطوي على permeabilization الانتقائي للغشاء البلازما مع ديجيتونين لإزالة محتويات حشوية تليها الفلورسنت

Abstract

في حقيقيات النوى، أكثر من الرنا المرسال (mRNAs و) التي تكود يفرز ويتم ترجمة البروتينات الغشاء على سطح الشبكة الإندوبلازمية (ER). ومع ذلك، يمكن تصور هذه mRNAs وأن يكون تحديا. هذا صحيح خصوصا عندما فقط جزء صغير من مرنا هو ER-المرتبطة بها ويتم توزيعها على عرقلة هذا عضية من النصوص (أي "الحرة") غير المستهدفة. من أجل رصد ER المرتبطة mRNAs و، وقد وضعنا طريقة التي تعامل بها مع خلايا التعرض قصيرة إلى حل استخراج ديجيتونين أن permeabilizes انتقائي غشاء البلازما، وبالتالي يزيل محتويات حشوية، مع الحفاظ في نفس الوقت على سلامة ER . عندما يقترن هذا الأسلوب مع الفلورسنت في الموقع التهجين (FISH)، يمكن للمرء تصور واضح محدد mRNAs وER بواسطة المجهر الفلورسنت. يمكن استخدام هذا البروتوكول يتم تقييم درجة ER-جمعية إما معظم النصوص (A) أو بولي mRNAs محددةوكميا حتى. في هذه العملية، يمكن للمرء أن استخدام هذا الفحص للتحقيق في طبيعة التفاعلات مرنا-ER.

Introduction

في حقيقيات النوى، ويفرز ترميز مرنا يمكن استهداف البروتينات الغشاء إلى ER شارك في translationally من الجسيمات 1،2 إشارة الاعتراف ويمكن الحفاظ على ER عن طريق التفاعل المباشر بين ريبوسوم وtranslocons خلال ترجمة 3،4. ومع ذلك، ما إذا كان يمكن توجيه mRNAs والمحافظة على ومستقلة ER إما ريبوسوم أو ترجمة غير واضح حتى وقت قريب جدا. حاولت الدراسات السابقة لمعالجة ما إذا كان هناك ارتباط ترجمة المستقلة مرنا مع ER باستخدام تقنيات تجزئة الخلوية. لأن هناك حاجة إلى ظروف قاسية الكيميائية لتنأى ريبوسوم من الحويصلات المشتقة ER، والتي قد تعطل الحساس يحتمل مرنا-ER تكوين الجمعيات، وكانت هذه الدراسات غير حاسمة، وتوفير الأدلة ل5-8 و 9،10 ضد الريباسي مستقلة رسو مرنا إلى ER .

للتحايل على هذه المشاكل وضعنا بروتوالعقيد لعزل والصورة ER محدد mRNAs و. هذا الإجراء ينطوي على معاملة استخراج خفيفة، الذي يزيل بشكل فعال كل المحتوى السيتوبلازمي للخلية (بما في ذلك mRNAs وER محدد غير) مع الحفاظ في نفس الوقت على التشكل ER وجميع من الجزيئات المرتبطة به. باستخدام هذا البروتوكول قد أثبتنا أن مجموعة فرعية من mRNAs ويتم استهداف ومن ثم الحفاظ على ER أو بشكل مستقل عن ريبوسوم ترجمة 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد مواد لاستخراج

  1. إعداد خلايا
    1. خلايا البذور زراعة الأنسجة على حمض المعالجة coverslips مدة لا تقل عن يوم واحد قبل التجربة. نستخدم COS-7 أو U2OS، حيث أن هذه الخطوط تظهر اثنين من خلية إنتاج قوية من البروتين يفرز ولها ER محددة جيدا. نلاحظ أن لتحقيق كفاءة عالية الاستخراج، الخلايا يجب أن لا تتجاوز 80٪ confluency على ساترة في يوم التجربة.
    2. إذا كان يتم التحقيق في مرنا خاصة الخارجية، وتقاس الخلايا بعد يوم واحد مع البلازميدات تحتوي على بذر الجينات ذات الاهتمام باستخدام بروتوكولات ترنسفكأيشن القياسية. ويسمح بعد ذلك للتعبير عن خلايا مرنا للا يقل عن 18 ساعة قبل الاستخراج.
  2. علاج الخلايا مع مثبطات ترجمة
    1. لاختبار تأثير ريبوسوم سليمة على الحفاظ على الرابطة مع mRNAs وER، يمكن علاج الخلايا مع مثبطات الترجمة التي تعطل الرابطةمن ريبوسوم مع مرنا 11.
    2. مثبطات بدء الترجمة، مثل homoharringtonin (HHT)، pactamycin، أو 2 - (4-الميثيل-2 ،6-dinitroanilino) - N-methylpropionamide (MDMP)، ومنع ريبوسوم جديدة من التواصل مع نص مع السماح في نفس الوقت مخطوبة لريبوسوم استكمال ترجمة 12-14. وبما أن المعدل ل معظم البروتينات في خلايا الثدييات هو 5 الأحماض الأمينية في الثانية الواحدة، بغض النظر عن الاستخدام أو كودون طول مرنا 15، وينبغي علاج من 30 دقيقة مسح ريبوسوم الخروج من الرسائل مع إطارات القراءة المفتوحة طالما 27000 النيوكليوتيدات (الترميز للبروتينات طالما الأحماض الأمينية 9000).
    3. مثبطات مثل بوروميسين تعزيز طرد المبكرة من سلسلة الوليدة، وبالتالي تعطيل polysomes 12. ومع ذلك لتعطيل تماما رابطة ريبوسوم بوروميسين المعاملة مع مرنا، يجب إضافة chelators المغنيسيوم مثل EDTA إلى المخزن المؤقت استخراج ديجيتونين 11.
      4. <لى> في هذه التجربة، يتم التعامل مع الخلايا بوروميسين ميكرومتر 200، 5 ميكرومتر HHT، أو السيطرة المتوسطة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخراج.
  3. إعداد الاحتياطي استخراج ديجيتونين. لتصور ER-المترجمة mRNAs ودون عرقلة سير (أي حشوية، غير المرتبطة ER) مجانا النصوص، ونحن permeabilize انتقائي الخلية مع ديجيتونين، غليكوزيدات الستيرويد التي تتفاعل مع تفضيلي hydroxysterols-3β. في تركيزات منخفضة، ديجيتونين permeabilizes انتقائي أجزاء من غشاء البلازما، مما تسبب في 'التسرب' 16. في المقابل، يتم ترك غشاء ER والمغلف النووية، والتي هي فقيرة في الكولسترول، سليمة 16،17.
    1. يذوب ديجيتونين (سيغما الدريتش) المسحوق في الماء المقطر في الوزن 5٪ / حجم وaliquoted هذا الحل الأسهم في كميات صغيرة وتخزينها في -20 درجة C. في تجربتنا، متعددة تجميد ذوبان الجليد دورات يقلل من كفاءة ديجيتونين المنحل.
    2. A محلول المخزون منمستعدة مع ريبونوكلياز خالية الكواشف وتخزينها في -20 ° C.: 10X العازلة CHO (115 ملي شركة الخطوط الجوية الكويتية، 25 HEPES ملي درجة الحموضة 7.4، 2.5 ملم MgCl 2، 2 مم و 150 EGTA السكروز ملي 1X تركيز العمل الحل) A الحل العمل (1X العازلة CHO) والذي أعده تمييع الحل الأسهم مع ريبونوكلياز خالية المياه ويمكن تخزينها في C. ° 4

2. ديجيتونين استخراج

  1. إعداد حلول استخراج
    1. كتلة التدفئة مع سطح مستو هو ما قبل ساخنة إلى 40 ° C والحفاظ على درجة الحرارة هذه خلال لاستخراج.
    2. لتشكيل سطح العمل مسطح وهذا هو ريبونوكلياز الحرة، هو مبلل كتلة التدفئة مع بعض الماء ومتراكبة مع قطعة جديدة من M parafilm (بيميس الشركة، المؤتمر الوطني العراقي). وممهدة فقاعات الهواء بين ورقة وparafilm كتلة التدفئة إلى استخدام ريبونوكلياز خالية القفازات وkimwipes (VWR).
    3. وتحسنت 1X العازلة CHO إلى 37 ° C بواسطة تفرخ في حمام مائي.
    4. وتستخدم 6 وحات جيدة لغسلوإصلاح الخلايا. ويستخدم كل صف من 3 آبار للغطاء واحد للانزلاق. لأول بئرين في الصف، يتم إضافة 2 مل من العازلة CHO حرارة. إلى جانب مشاركة، 2 مل من محلول التثبيت (PBS بارافورمالدهيد + 4٪ (علوم مجهر إلكترون)) يضاف. ويمكن تخزين هذه صينية في الحاضنة 37 درجة ° حتى الخلايا جاهزة للاستخراج.
    5. ويتم إعداد ديجيتونين حل استخراج من تمييع الحل ديجيتونين الأسهم إلى 0.025٪ مع العازلة CHO دافئة فقط قبل استخدامها. نلاحظ مرة اخرى ان لبوروميسين المعالجة الخلايا، ويجب أن يحتوي المخزن المؤقت استخراج بالإضافة إلى 20 ملي EDTA لتعطيل بكفاءة ريبوسوم 11. يتم وضع قطرات من 100 ميكرولتر من محلول الاستخلاص على كتلة التدفئة parafilm المغطاة مباشرة قبل الاستخراج.
  2. استخراج وتثبيت ديجيتونين الخليوي
    1. إزالة الخلايا من الحاضنة 37 درجة مئوية.
    2. أثناء عملية الاستخراج، يتم التلاعب coverslips بمساعدة ملقط jewler ل. معوملقط التقاط ساترة وتراجع إلى المخزن المؤقت للCHO أولا ثم الثاني يحتوي جيدا لغسل المتوسطة من النمو.
    3. صمة عار قبالة بسرعة العازلة الزائدة قبالة الجانب الخلفي من ساترة مع kimwipe ووضع على الفور الجانب ساترة الخلية، أسفل، على حل الاستخراج.
    4. بعد 10 ثانية، والتقاط ساترة مع ملقط ونقل على الفور، جنبا الخلية مواجهة، وإلى جانب العازلة التي تحتوي على بارافورمالدهيد تثبيت 4٪.
    5. السماح للاحتضان العينة في مثبت لمدة لا تقل 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. إعداد الخلايا السيطرة Unextracted. لتحديد المبلغ الإجمالي للمرنا في السيتوبلازم انها فكرة جيدة لإعداد العينة الضابطة unextracted.
    1. وتعد الخلايا المزروعة في coverslips على النحو الوارد أعلاه (انظر القسم 2.2)، إلا أن يتم تخطي الخطوة استخراج ديجيتونين (2.2.3).
    2. بعد التثبيت، والخلايا المستخرجة من الامم المتحدة ويجب أن يتم في permeabilized PBS + 0.1٪ تريتونX-100 لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

3. FISH تلوين

  1. تصميم تحقيقات لمضان التهجين في الموقع
    1. يتم طي التسلسل الرئيسي للمرنا من المهتمين باستخدام RNA التنبؤ هيكل الثانوي البرامج، مثل RNAstructure 5.0 18. يتم تقييم بصريا طيات مرنا لتعريف المنطقة من حوالي 50 النيوكليوتيدات التي هي خالية من الهياكل الثانوية الرئيسية.
    2. ويتم تصنيع تكملة عكس هذه المنطقة مع fluorophore Alexa546 تعلق على نهاية 5 'من التحقيق (تم شراؤها من تقنيات الحمض النووي المتكاملة).
    3. يتم تخفيف التحقيق مع ريبونوكلياز خالية المياه إلى تركيز الأسهم من 100 ميكرومتر التي يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. تلطيخ مع تحقيقات FISH
    1. ملاحظة على الرغم من أن الخلايا المستخرجة-ديجيتونين لا تتطلب المزيد من permeabilization، وعلاج هذه العينات الثابتة مع 2 مل من 0.1٪ تريتون X-100 مخففة فيبرنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل تلطيخ FISH، ويساعد على تقليل إشارة الخلفية.
    2. ثم تغسل الشرائح مرتين مع PBS لإزالة أي بقايا أو بارافورمالدهيد تريتون X-100.
    3. ثم يتم غسل الخلايا مرتين مع 25٪ إلى 60٪ في الفورماميد 1X العازلة السيترات الصوديوم (150 مم كلوريد الصوديوم و 15 سترات الصوديوم ملم). عموما، لتحقيقات FISH التي هي محددة 50-60 النيوكليوتيدات في الطول، ويستخدم 60٪ الفورماميد، ولكن لتلطيخ بولي مرنا (A) مع التحقيق FISH بنسبة ضئيلة (DT)، ينخفض ​​مستوى الفورماميد وصولا الى 25٪.
    4. لإعداد غرفة تلطيخ، وتغطي الجزء السفلي من طبق بتري ملم 150 مع الماء ويتم طرح قطعة من parafilm على الماء. تتم إزالة الماء من خلال تحويل أكثر من طبق، مما يسمح لparafilm على الانضمام إلى الجزء السفلي من الطبق. تتم إزالة فقاعات الهواء يدويا مع kimwipes.
    5. ليتم ملطخة كل ساترة، ماصة 100 ميكرولتر قطرة من الحل التهجين التي تحتوي على تحقيق الفائدة من FISH على قدم المساواةafilm في غرفة تلطيخ. يتم تخفيف التحقيق مع 25 FISH الأسهم٪ إلى 60٪ في الفورماميد العازلة التهجين (1X SSC، 100 ملغ / مل كبريتات ديكستران، 1 ملغ / مل الحمض الريبي النووي النقال الخميرة، 5MM معقدة riboside vanadyl، 25-60٪ الفورماميد) إلى تركيز عمل 0.2 ميكرومتر. لاحظ أنه يجب تحسين كمية الفورماميد لتحقيق خاصة وتستخدم موجود في نفس تركيز في المخزن المؤقت غسل SSC (انظر 3.3.3 الخطوة).
    6. يتم وضع الخلية ساترة الوجه على الجانب السلبي الحل FISH في غرفة تلطيخ والمحتضنة لمدة 5-24 ساعة عند C ° 37 في غرفة مرطب مثل الأنسجة حاضنة الثقافة.
  3. الغسيل وتركيب عينات الملون
    1. إعداد المنطقة الحرة ريبونوكلياز غسل، وضع شريط من parafilm على سطح منبسط، مثل المختبرات. لضمان أن parafilm مسطح، والرطب على سطح مستوى، ضع parafilm على رأس وإزالة أي فقاعات الهواء يدويا مع kimwipes.
    2. غرفة تلطيخ هوإزالة من الحاضنة ووضعها على سطح مستو مسطح. وطرح بعد ذلك من قبل pipetting coverslips ما يقرب من 500 ميكرولتر من العازلة غسل FISH قرب حافة كل ساترة. وسيتم اختيار الحل في ساترة وبين parafilm وعبر عمل شعري.
    3. لكل ساترة، وpipetted 1 مل من العازلة غسل (1X SCC مع الفورماميد 25-60٪، راجع الخطوة 3.3.3) على parafilm منطقة الغسيل (راجع الخطوة 3.4.1).
    4. باستخدام ملقط، تتم إزالة coverslips من غرفة تلطيخ ويتم وضع كل قطرة من على غسل العازلة وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. يتم تكرار عملية الغسيل 3 مرات.
    5. تغسل الشرائح الزجاجية مع الايثانول 70٪، وتجفيفها مع kimwipes.
    6. لكل ساترة، وسعة 25 ميكرولتر من pipetted الحل تركيب (دابي Fluoromount G، جنوب الحيوية) على الشريحة. نلاحظ أن هذا الحل يتضمن 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي)، التي بقع DNA ويسمح لتصور نوى.
    7. USIملقط نانوغرام وkimwipes، تجفف الجزء الخلفي من ساترة ونشف الزائدة العازلة غسل FISH من دون تجفيف العينة. ثم يتم وضع كل ساترة الجانب الخلية أسفل، على تراجع حل المتزايدة.
    8. ثم وصفت العينات ويمكن أن تكون محمولة على المحل في 4 درجات مئوية.

4. التصوير والكمي

  1. التصوير
    1. يتم استخدام المجهر epifluorescence لصورة الخلايا بعد تلطيخ FISH. ويمكن التفريق بين الخلايا من خلايا untransfected بالنقل بواسطة إشارة مضان مشرق في القناة المناسبة. من الناحية المثالية، فإن كل حقل المكتسبة تحتوي أيضا على خلية untransfected لاستخدامها لتحديد مضان الخلفية لالكمي.
    2. ليتم الحصول على كل الصور مجال الأسماك وقناة دابي. وبالإضافة إلى ذلك، إذا هي الخلايا شارك في ملطخة علامات البروتين، حصل أيضا على صورة من قناة المناعي. ويمكن أيضا ملاحظة أن استخراج ديجيتونين استخدامهالتصور محدد ER ريبوسوم والبروتينات 11.
    3. لضمان أن يمكن مقارنة شدة مضان بين الحقول، يجب أن زمن التعرض لكل قناة ثابتة لكل مجموعة من التجربة.
    4. مرة أخرى لضمان إمكانية مقارنة شدة الفلورسنت بين الخلايا على coverslips مختلفة، ينبغي التقليل من التغييرات يوما بعد يوم في شدة أو تسوس epiluminescence في إشارة FISH بواسطة التصوير كل من coverslips في جلسة واحدة.
  2. الكمي. لقياس كمية الرنا أن يتم ترجمة على ER، ونحن نستخدم برنامج نيكون العنصر NIS. ومع ذلك، يمكن استخدام برامج أخرى مثل تحليل الصور يماغيج.
    1. باستخدام عنصر NIS نيكون أداة تحليل الصور، وترد هامش الخلية والنواة ومنطقة منفصلة من اهتمامات (رويس).
    2. لكل ROI، كثافة الفلورية (I T لشدة الخلية الكلي وأنا ن للكثافة النووية) والمنطقة (A N T وA) وتسجل وتصديرها إلى جدول بيانات Excel.
    3. لكل صورة، يتم تحديد كثافة الخلفية الفلورية (I B) عن طريق تسجيل كثافة خلية غير بالنقل. إذا كان يتم تحليل مستويات مرنا بولي (A)، يتم تحديد منطقة خالية من الخلايا.
    4. المبلغ الإجمالي للER (في الخلايا المستخرجة) أو حشوية (في الخلايا unextracted) يتم احتساب مضان بواسطة الصيغة:
      [A T] [I T - I B] - [A N] [I N - I B]
    5. ويمكن أيضا كثافة تلطيخ النووية تحسب واستخدامها كأداة للرقابة الداخلية بين العلاجات المختلفة. منذ لا تتأثر النواة عن طريق العلاج ديجيتونين 17 أو تعطيل الريبوسوم 11، ينبغي أن كمية مرنا النووية تظل ثابتة بين كل هذه العلاجات. لحساب مضان النووية يتم استخدام الصيغة التالية:
      [A N] [I N - IB]
    6. ويمكن حساب النسبة المئوية للحشوية مرنا وهذا هو ER-المستهدفة من خلال اتخاذ مضان ER متوسط ​​من 30-40 الخلايا المستخرجة (انظر 4.2.4) مقسوما على متوسط ​​حشوية ومضان من الخلايا unextracted 30-40 (انظر مرة أخرى 4.2.4) . فمن الأهمية بمكان أن يتم إعداد الخلايا المستخرجة وunextracted، ملطخة وتصويرها في نفس الوقت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتحديد النسبة المئوية للمرنا وهذا هو ER-المرتبطة بها، COS-7 الخلايا التي تم transfected مع البلازميدات التي تحتوي على الفوسفاتيز القلوية المشيمة (ALPP) أو السيتوكروم P450-8B1 (CYP8B1) تم استخراج إما مع ديجيتونين ثم ثابتة، أو ثابتة مباشرة (انظر الشكل 1، قارن "Unextracted السيطرة" على "انتزعت السيطرة"). وكميا مضان غير النووية في كل من عينات وحساب جزء من ER المرتبطة مرنا (الشكل 2). البيانات المتوفرة لدينا تبين بوضوح أن لكلا ALPP وCYP8B1، ويرتبط حوالي 60٪ من حشوية مرنا مع ER. لأن كلا من هذه البروتينات ترميز mRNAs والتي تتم معالجتها في ER-التجويف، نتائجنا تتفق مع فكرة أن يتم تحويل مثل هذه mRNAs وعلى سطح ER.

لرصد ER-جمعية من هذه النصوص بعد التفكك الريبوسوم، تقاس COS-7 خلايا كانت TR eated مع وسائل الاعلام السيطرة، أو بوروميسين HHT لمدة 30 دقيقة ثم يستخرج والثابتة وتحقيقات ملطخة باستخدام FISH محددة موجهة ضد كل مرنا (للصور ممثل انظر الشكل 1، لتقدير حجم ER-مرنا والنووية المرتبطة بها، انظر الشكل 3). لاحظ أن يتم الاحتفاظ ALPP فقط، وليس مرنا CYP8B1، على بعد تفكيكها ER ريبوسوم مع بوروميسين أو HHT (أرقام 2-3). لم الأهم على مستوى مرنا النووية لن تتغير بين عينات مختلفة للتعامل إما مرنا (الشكل 3). هذا الثابت إشارة FISH النووية يشير إلى أن التغيرات في كثافة مضان في جزء ER ليست بسبب تغييرات في التعبير مرنا أو الاختلافات في تلوين FISH.

من هذه النتائج نستنتج أن يتم الاحتفاظ مجموعة فرعية من mRNAs وER-المستهدفة، مثل نص ALPP، على سطح هذا عضية بعد الريبوسوم التفكيك.

"jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. ALPP، ولكن ليس مرنا CYP8B1 يبقى المرتبطة ER بشكل مستقل عن ريبوسوم والترجمة. COS-7 خلايا تم transfected مع البلازميدات تحتوي إما ALPP (الصف العلوي)، أو CYP8B1 (الصف السفلي) الجينات ويسمح للتعبير عن مرنا لل 18-24 ساعة. وعولج ثم الخلايا مع DMSO المتوسطة السيطرة ("السيطرة")، بوروميسين ("بورو") أو HHT لمدة 30 دقيقة. وإما خلايا ثابتة مباشرة ("unextracted") أو استخراج أول بعد ذلك ثابتة. نلاحظ أن تم استخراج الخلايا في حين تم استخراج الخلايا والتحكم HHT المعاملة مع وحده ديجيتونين، بورو المعاملة مع ديجيتونين وEDTA. كانت ملطخة الخلايا لاستخدام مرنا تحقيقات FISH محددة، وتصويرها. شريط النطاق = 20 ميكرومتر.

ائما "> الشكل 2
الشكل 2. الكمي لمستوى ER-جمعية ALPP ومرنا CYP8B1. وإما بالنقل COS-7 خلايا ثابتة مباشرة لتحديد المستوى الإجمالي للمرنا في السيتوبلازم (انظر الشكل 1، "Unextracted السيطرة" الخلايا) أو استخراج أولا ثم إصلاح لتحديد كمية ER المرتبطة مرنا (انظر الشكل 1، "انتزعت السيطرة" الخلايا). لكل تجربة تم تقسيم متوسط ​​ER المرتبطة مضان من 30-40 الخلايا المستخرجة من مضان من الخلايا السيتوبلازمية متوسط ​​unextracted 30-40، لإعطاء جزء من ER محدد مرنا (المحور الصادي). كل شريط يمثل متوسط ​​القيمة والخطأ المعياري للثلاث تجارب مستقلة.

الشكل 3
الشكل 3. القياس الكمي لER-أسووعولج من ciation ALPP وCYP8B1 مرنا بعد التفكك الريبوسوم. بالنقل COS-7 خلايا المتوسطة مع سيطرة أو مثبطات ترجمة مختلفة، المستخرج، ثابتة، لالملون مرنا باستخدام مسابر محددة وFISH المصورة (انظر الشكل 1، "انتزعت" الخلايا). وتم قياس كمية مضان من شدة مرنا في ER والنواة. كل شريط يمثل خطأ متوسط ​​ومستوى ثلاث تجارب مستقلة، يتألف كل منها من شدة المتكاملة بمعدل 30 خلايا على خلفية تطبيع وإلى مضان في ER من ضبط المعالجة الخلايا (المحور الصادي). لاحظ أنه بالرغم تعطل الريبوسوم تسبب CYP8B1 مرنا لفصل من ER، ومستويات مرنا النووية لم تتأثر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توطين التحت خلوية mRNAs وإلى مواقع مختلفة، من خلال التفاعل مع النصوص البروتينات توطين مرنا، هو ظاهرة واسعة الانتشار مهمة لفرز الصحيح من البروتينات إلى وجهتها النهائية، وبالنسبة للضبط التعبير الجيني لمتطلبات محلية من التحت خلوية المنطقة 19،20.

باستخدام مقايسة الموصوفة هنا، فإننا النظر في مسألة ما إذا كان يمكن الحفاظ على mRNAs والتي تكود بروتينات إفرازية على ER في وجود أو عدم وجود ريبوسوم أو الترجمة. في الواقع، وجدنا أن مجموعة فرعية من هذه mRNAs ويكون هذا النشاط 11. على سبيل المثال، وذلك باستخدام هذا البروتوكول استخراج، توصلنا إلى أن يتم ترجمة كل ALPP وmRNAs وCYP8B1 على سطح ER في السيطرة تعامل COS-7 خلايا (أرقام 1-2). ومع ذلك، بعد علاج الخلايا مع ترجمة مثبطات بوروميسين أو HHT، ALPP فقط، ولكن ليس مرنا CYP8B1،ظلت المرتبطة ER في غياب ريبوسوم الفنية والترجمة (أرقام 1، 3). وبالإضافة إلى ذلك وجدنا في وقت سابق ان يبقى مرنا ALPP ER-COS المرتبطة في الخلايا المعالجة-7 مع pactamycin 11. لأن هذه العلاجات المختلفة تعمل من خلال آليات مختلفة لمسح مرنا من ريبوسوم المرتبطة بها، فإنه من غير المحتمل أن ER-رابطة ALPP هو نتيجة استجابة غير مباشرة لبعض الخلوية أي دواء معين. للتأكد من أن هذه الترجمة مثبطات فعالة، كما أنها مفيدة لاختبار ما إذا كانت تحول دون إدماج 35 S-ميثيونين في البروتينات تصنيعه حديثا. على سبيل المثال، وجدنا أن MDMP المعاملة (100 ميكرومتر، 15 دقيقة) يمكن أن تمنع فقط 40-60٪ من جميع تخليق البروتين في الخلايا COS-7 (XA تسوى وقصر AF والملاحظات غير منشورة). ونتيجة لذلك، هذا الدواء لا تعطل بكفاءة ER-توطين mRNAs والتي تتطلب ل استهدافهم والصيانة (XA تسوى وقصر AF والملاحظات غير منشورة).

لمزيد من ضمان ER-استهداف مرنا ليست متوقفة على إشارة تسلسل مرمز أو المجالات عبر الغشاء، يمكن للمرء أن يغير نص الخارجية بحيث بترميز بروتين حشوية. والواقع أننا أظهرت في وقت سابق ان نسخة من الرنا ALPP التي تفتقر كل من تسلسل الإشارات والترميز عبر الغشاء المناطق لا يزال قادرا على ترجمة إلى ER 11.

ومن الجدير بالذكر أيضا أن يمكن استخدام الأسلوب المقدمة هنا عندما يقترن المقايسات الأخرى المستخدمة لتحليل الصادرات النووية مرنا 21، لتحديد حركية ومتطلبات النقل مرنا من حجرة إلى أخرى مثل (من النواة إلى السطح من ER). في الواقع، من خلال microinjecting البلازميدات التي تحتوي على الجينات ALPP في نوى COS-7 الخلية التي كانت سابقة التجهيز مع مثبطات الترجمة، أثبتنا سابقا أن ALPP أدلى حديثاوتستهدف mRNAs وإلى ER بشكل مستقل عن ترجمة أو الريبوسوم جمعية 11.

على الرغم من أننا لا نفهم تماما كيف يتم استهداف هذه mRNAs وترتكز على وER، فمن المحتمل أن هذا عضية يحتوي على مستقبلات مرنا. وبالفعل حددنا مؤخرا P180، كبير المشحون إيجابيا غشاء بروتين محدد، ويجري اللازمة لقدرة مرنا ALPP أن المحافظة على ER بشكل مستقل عن ترجمة 11. ومع ذلك، فمن المرجح أن مستقبلات أخرى مرنا يجب أن تكون موجودة على سطح ER 11. مع مساعدة من هذه التقنية المذكورة هنا، ونأمل في تحديد وتشريح العديد من الآليات الجزيئية التي تساعد على تنظيم توطين مرنا في خلايا الثدييات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من الوطنية للعلوم والهندسة مجلس البحوث كندا لوكالة فرانس برس وXAC

References

  1. Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).
  2. Walter, P., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).
  3. Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation. Cell. 71, 489-503 (1992).
  4. Grlich, D., Rapoport, T. A. Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane. Cell. 75, 615-630 (1993).
  5. Milcarek, C., Penman, S. Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes. J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).
  6. Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts. J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).
  7. Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver. J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).
  8. Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation. J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).
  9. Kruppa, J., Sabatini, D. D. Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes. J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).
  10. Adesnik, M., Maschio, F. Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes. Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).
  11. Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum. PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).
  12. Pestka, S. Inhibitors of ribosome functions. Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).
  13. Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine. Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).
  14. Weeks, D. P., Baxter, R. Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide. Biochemistry. 11, 3060-3064 (1972).
  15. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Cell. 147, 789-802 (2011).
  16. Lerner, R. S., et al. Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes. RNA. 9, 1123-1137 (2003).
  17. Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).
  18. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
  19. Lcuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  20. Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).
  21. Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection. J Vis Exp. 46, e2387 (2010).

Tags

علم الأحياء الخلوي، العدد 70، الكيمياء الحيوية، علم الوراثة، علم الأحياء الجزيئي، وعلم الجينوم، التعريب مرنا، RNA، ديجيتونين الاستخراج، تجزئة الخلية، الشبكة الإندوبلازمية، إفراز، المجهري، والتصوير، فلوري
تصور mRNAs والشبكة الإندوبلازمية في خلايا الثدييات المترجمة
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Cui, X. A., Palazzo, A. F.… More

Cui, X. A., Palazzo, A. F. Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (70), e50066, doi:10.3791/50066 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter