Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

Published: December 17, 2012 doi: 10.3791/50066
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry, University of Toronto

Summary

כאן אנו מתארים שיטה לדמיין mRNAs endoplasmic reticulum הקשורים בתאי תרבית רקמת יונקים. טכניקה זו כרוכה permeabilization סלקטיבית של קרום הפלזמה עם digitonin להסיר תוכן cytoplasmic אחרי הניאון

Abstract

באאוקריוטים, רוב RNAs השליח (mRNAs) המקודדים מופרשת והחלבונים בממברנה מותאמת לשפה מקומיים על פני השטח של reticulum endoplasmic (ER). עם זאת, להדמיה של mRNAs אלה יכול להיות מאתגרות. זה נכון במיוחד כאשר רק חלק קטן מן mRNA הוא ER-משויך והפצתם לאברון זה הנה חסום על ידי תמלילים שאינם ממוקדים (כלומר "חופשי"). על מנת לפקח mRNAs ER-נלווה, פתח שיטה שבה תאי מטופלים עם חשיפה קצרה לפתרון חילוץ digitonin כי סלקטיבי permeabilizes קרום הפלזמה, ובכך מסיר את תוכן cytoplasmic, תוך שמירה על שלמות ER . כאשר שיטה זו היא בשילוב עם ניאון כלאה באתר (FISH), אפשר לחזות באופן ברור mRNAs ER-כפות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. באמצעות פרוטוקול זה המידה של ER-עמותה לאו תעתיקי תפזורת פולי () או mRNAs הספציפי ניתן להעריךואפילו לכימות. בתהליך, אפשר להשתמש בבדיקה זו כדי לחקור את טבעו של אינטראקציות mRNA-ER.

Introduction

באאוקריוטים, קידוד ה-mRNA מופרש וחלבוני קרום יכולים להיות ממוקדים לחדר מיון השיתוף translationally ידי 1,2 חלקיק הכרת האות ואפשר לקיים ER דרך האינטראקציות הישירות בין הריבוזומים וtranslocons במהלך תרגום 3,4. עם זאת, האם יכול להיות ממוקד mRNAs ומתוחזק על ER העצמאי או הריבוזומים או תרגום לא היה ברור עד לאחרונה. מחקרים קודמים ניסו לענות האם יש קשר תרגום עצמאי mRNA עם ER באמצעות טכניקות חלוקה תאיות. בגלל תנאים כימיים קשים נדרשו לנתק את הריבוזומים משלפוחית ​​ER נגזר, שעשוי לשבש את ה-mRNA-ER העדינה פוטנציאלי העמותה, מחקרים אלה לא היו חד משמעיים, הוכחה ל5-8 ונגד 9,10 עיגון ריבוזומלי עצמאי של mRNA לחדר המיון .

כדי להתגבר על בעיות אלו פתחנו פרוטוcol לבודד ותמונה mRNAs ER-כפות. הליך זה כרוך טיפול חילוץ קל, שמסיר ביעילות את כל תוכן cytoplasmic של התא (כולל mRNAs אינו ER-כפות) תוך שמירה על מורפולוגיה ER וכל המולקולות הקשורים אליו. באמצעות פרוטוקול זה אנו מראים כי קבוצת משנה של mRNAs ממוקדות ולאחר מכן שמרה על חדר המיון באופן עצמאי או תרגום של הריבוזומים 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת חומרים להפקה

  1. הכנת התאים
    1. תאי זרע רקמות תרבות על coverslips חומצה טופלה ללפחות יום אחד לפני הניסוי. אנו משתמשים COS-7 או U2OS, כשתי שורות תאים אלה מפגינים ייצור חזק של חלבון מופרש ויש ER מוגדר היטב. שים לב שעל מנת להשיג יעילות שאיבה גבוהה, תאים לא יעלו על 80% confluency על coverslip ביום של הניסוי.
    2. אם mRNA אקסוגני מסוים נחקר, תאים transfected יום אחד לאחר זריעה עם פלסמידים המכילים את הגן של עניין תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים transfection. התאים אז מותר להביע mRNA ללפחות 18 שעות לפני השאיבה.
  2. טיפול בתאים עם מעכבי תרגום
    1. כדי לבדוק את ההשפעה של ריבוזומים שלמים על התחזוקה של mRNAs קשר עם חדר המיון, תאים יכולים להיות מטופלים עם מעכבי תרגום שמשבשים את הקשרשל הריבוזומים עם mRNA 11.
    2. מעכבים של ייזום תרגום, כגון homoharringtonin (HHT), pactamycin, או 2 - (4-methyl-2 ,6-dinitroanilino) - N-methylpropionamide (mdmp), למנוע הריבוזומים חדשים מלהתרועע עם התמליל ובמקביל מאפשרים הריבוזומים מאורסת להשלים תרגום 12-14. הואיל ושיעור התרגום עבור רוב החלבונים בתאי יונקים הם 5 חומצות אמינו לשנייה, ללא קשר לשימוש או קודון אורך mRNA 15, טיפול של 30 דקות צריך לנקות את הריבוזומים של הודעות עם מסגרות קריאה פתוחות כל עוד 27,000 נוקלאוטידים (קידוד לחלבונים כל עוד 9000 חומצות אמינו).
    3. מעכבים כגון puromycin לקדם את הפליטה המוקדמת של הרשת המתהווה וכך לשבש את 12 polysomes. עם זאת כדי לשבש את הקשר של הריבוזומים puromycin טופלו-עם mRNA לחלוטין, chelators מגנזיום כגון EDTA יש להוסיף למאגר חילוץ digitonin 11.
      4. <li> בניסוי זה, תאים שטופלו בpuromycin 200 מיקרומטר, HHT 5 מיקרומטר, או בינוני שליטה למשך 30 דקות לפני החילוץ.
  3. הכנת מאגר החילוץ Digitonin. כדי להמחיש mRNAs ER-מקומי ללא ההתערבות של תמלילים חופשיים (כלומר, שאינם cytoplasmic ER-קשורים), אנו סלקטיבי permeabilize תא עם digitonin, glycoside סטרואידים כי אינטראקציה מועדפת עם 3β-hydroxysterols. בריכוזים נמוכים, digitonin סלקטיבי permeabilizes חלקים של קרום הפלזמה, גורם "דליפות" 16. לעומת זאת, קרום ER ומעטפת גרעין, שהם עניים בכולסטרול, נותרים ללא פגע 16,17.
    1. אבקת Digitonin (סיגמה אולדריץ) מומסת במים מזוקקים במשקל 5% / נפח ופתרון שהמנייה הזאת aliquoted לנפחים קטנים ומאוחסנת ב-20 ° C. מניסיוננו, מחזורים רבים בהקפאת הפשרה מקטינים את היעילות של digitonin המומס.
    2. פתרון של מנייהחיץ CHO 10x (1x ריכוז עובד פתרון: 115 המ"מ כץ, 25 מ"מ HEPES pH 7.4, 2.5 המ"מ MgCl 2, 2 המ"מ EGTA וסוכרוז mM 150) מוכן עם חומרים כימיים RNase-חופשי ומאוחסן ב -20 ° C. פתרון עובד (1x CHO חיץ) הוא הוכן על ידי דילול פתרון המניות עם מי RNase חינם וניתן לאחסן ב 4 ° C.

2. הפקת Digitonin

  1. הכנת פתרוני חילוץ
    1. בלוק חימום עם משטח שטוח הוא שחומם מראש ל 40 מעלות צלזיוס, ונשמר בטמפרטורה זו במהלך לחילוץ.
    2. כדי ליצור משטח עבודה שטוח שהוא RNase חופשי, בלוק החימום טבול במעט מים ומצופים בחתיכה טרייה של parafilm M (חברת Bemis, Inc). בועות אוויר בין גיליון parafilm ובלוק חימום הנן החליקה החוצה באמצעות כפפות RNase-חופשיות וkimwipes (VWR).
    3. 1x CHO החיץ מחומם ל 37 מעלות צלזיוס ידי דוגר באמבט מים.
    4. צלחות 6-גם משמשות כדי לשטוףולתקן תאים. כל שורה של 3 בארות משמשת לכיסוי 1 להחליק. לשתי הבארות הראשונות בשורה, 2 מ"ל של חיץ CHO התחמם הוא הוסיף. כדי גם האחרון, 2 מ"ל של תמיסת הקיבוע (PBS paraformaldehyde + 4% (מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים)) הוא הוסיף. מגש זה יכול להיות מאוחסן ב37 המעלות צלזיוס החממה עד שהתאים מוכנים להפקה.
    5. פתרון החילוץ Digitonin הוא הוכן על ידי דילול פתרון digitonin המניות כדי 0.025% עם חיץ CHO חם רק לפני שימוש. שוב, שים לב שתאים לpuromycin טופל, חיץ החילוץ חייב בנוסף מכיל 20 המ"מימ EDTA יעילות לשבש הריבוזומים 11. טיפין של 100 μl של פתרון החילוץ מונחות על בלוק החימום parafilm המכוסה מייד לפני החילוץ.
  2. הפקת Digitonin וקיבוע סלולרי
    1. מסיר את התאים מ37 המעלות צלזיוס החממה.
    2. בתהליך החילוץ, coverslips הוא מניפולציה בעזרת המלקחיים של jewler. עםהמלקחיים להרים את coverslip וטובלים אותו הראשון ולאחר מכן השני גם מכיל מאגר CHO לשטוף את מדיום הגידול.
    3. מהר למחוק את החיץ עודף מהצד האחורי של coverslip עם kimwipe ולמקם את coverslip, צד התא פונה כלפי מטה, על פתרון החילוץ באופן מיידי.
    4. לאחר 10 שניות, להרים את coverslip עם המלקחיים ולהעביר אותו באופן מיידי, בצד תא פונה כלפי מעלה, לרווחת המכיל 4% חיץ הקיבוע paraformaldehyde.
    5. תן לדגור במדגם מייצב ללפחות 15 דקות בטמפרטורת חדר.
  3. הכנת תאי בקרה Unextracted. כדי לקבוע את הסכום הכולל של ה-mRNA בציטופלסמה זה רעיון טוב כדי להכין את מדגם שליטת unextracted.
    1. תאים שגודלו בcoverslips מוכנים כאמורים לעיל (ראה סעיף 2.2), אלא ששלב חילוץ digitonin (2.2.3) הוא דלג.
    2. לאחר קיבוע, תאים בלתי חולצו צריכים להיות permeabilized ב PBS + טריטון 0.1%X-100 במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר.

3. כתמי דגים

  1. עיצוב בדיקות עבור פלואורסצנטי כלאה באתר
    1. הרצף הראשוני של mRNA של עניין מקופל באמצעות תוכנת רנ"א משנית מבנה חיזוי, כגון RNAstructure 5.0 18. קפלי mRNA מוערכים חזותי לזיהוי אזור של כ 50 נוקלאוטידים שהוא ללא מבנים משניים גדולים.
    2. ההשלמה ההפוכה של אזור זה היא מסונתז עם Alexa546 fluorophore המחובר בקצה 5 'של החללית (שנרכש מטכנולוגיות DNA משולבות).
    3. החללית מדוללת במי RNase חינם לריכוז מניות של 100 מיקרומטר שניתן לאחסן ב -20 ° C.
  2. הכתמה עם בדיקות FISH
    1. שימו לב שלמרות שהתאים digitonin-חולצו אינם דורשים permeabilization נוסף, טיפול בדגימות אלה קבועים עם 2 מ"ל של 0.1% טריטון X-100 בדילולPBS במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר לפני צביעת דגים, עוזר להפחית את אות הרקע.
    2. את השקופיות אז נשטפות פעמים עם PBS להסיר כל paraformaldehyde שייר או טריטון X-100.
    3. התאים אז נשטפים פעמים עם פוראמיד 25% עד 60% במאגר ציטראט נתרן 1X (150 mM NaCl וציטרט הנתרן mM 15). באופן כללי, לבדיקות דגים ספציפיות שהם 50-60 נוקלאוטידים אורך, פוראמיד 60% בלבד, אך ל() הכתמת mRNA פולי עם חללית Oligo (dT) דגים, ברמה של פוראמיד מופחת עד 25%.
    4. כדי להכין את החדר המכתים, תחתית צלחת פטרי 150 מ"מ מכוסית במים ופיסת parafilm הוא צפה על פני המים. המים מוסרים על ידי הסיבוב מעל הצלחת, ובכך מאפשרים parafilm לדבוק בתחתית הצלחת. בועות אוויר יוסרו באופן ידני עם kimwipes.
    5. לכל coverslip להיות מוכתם, פיפטה μl 100 ירידה של פתרון ההכלאה המכיל דגי חללית של ריבית על השוויafilm בתא המכתים. בדיקת FISH המנייה מדוללת עם פוראמיד 25% עד 60% במאגר ההכלאה (1x SSC, 100 מ"ג / המ"ל dextran סולפט, 1 מ"ג / מיליליטר השמרים tRNA, מורכב riboside vanadyl 5mm, פוראמיד 25-60%) לריכוז עבודה של 0.2 מיקרומטר. שים לב שכמות פוראמיד צריכה להיות מותאמת לבדיקה מסוימת בשימוש, והוא נוכח באותו הריכוז כמו בחיץ לשטוף SSC (ראה שלב 3.3.3).
    6. Coverslip מונח בפני צד תא למטה, אל פתרון הדגים בתא המכתים וטופח ל5-24 שעות על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified כגון רקמת תרבות חממה.
  3. כביסה והרכבת הדגימות המוכתמות
    1. כדי להכין את אזור רחצה חופשיה RNase, נשכבה רצועת parafilm על משטח שטוח ברמה, כגון שולחן מעבדה. כדי להבטיח שparafilm הוא שטוח ורטוב המשטח ישר, הנח parafilm על גבי ולהסיר באופן ידני את כל בועות אוויר עם kimwipes.
    2. הקאמרי הוא המכתיםהוסר מהחממה ומונח על משטח שטוח ברמה. את coverslips מכן רחף על ידי pipetting כ 500 μl של חיץ לשטוף דגים ליד הקצה של כל coverslip. הפתרון יוצג ב- בין coverslip וparafilm באמצעות פעולת נימים.
    3. לכל coverslip, 1 מ"ל של חיץ לשטוף (1x SCC עם פוראמיד 25-60%, ראה שלב 3.3.3) הוא pipetted על parafilm אזור הכביסה (ראה שלב 3.4.1).
    4. באמצעות מלקחיים, את coverslips יוסרו מהתא המכתים וכל אחד ממוקם על הירידה של חיץ לשטוף והדגרה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. תהליך הכביסה חוזר 3 פעמים.
    5. שקופיות זכוכית נשטפות עם אתנול 70%, ומיובשים בkimwipes.
    6. לכל coverslip, 25 μl של פתרון תלייה (DAPI Fluoromount G, הדרום יוטק) היא pipetted לשקופית. שים לב שפתרון זה מכיל 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), ה-DNA שכתמים ומאפשר הדמיה של גרעינים.
    7. USIמלקחיים וkimwipes ng, החלק האחוריים של coverslip הם מיובשים וחיץ לשטוף דגים עודף נמחק בלי ייבוש המדגם. אז כל coverslip ממוקם צד תא פונה כלפי מטה, על הירידה של פתרון גובר.
    8. דגימות רכובות מסומנות ויכולות להיות חנות ב 4 ° C.

4. הדמיה וכימות

  1. הדמיה
    1. מיקרוסקופ epifluorescence משמש לתמונת התאים הבאים מכתים דגים. תא transfected יכול להיות מובחן מתאי untransfected ידי אות פלואורסצנציה בהירה בערוץ המתאים. באופן אידיאלי, כל שדה שנרכש, מכיל גם תא untransfected לשמש כדי לקבוע את קרינת הרקע לכימות.
    2. לכל תמונות שדה של הדג וערוץ DAPI הם נרכשים. בנוסף, אם התאים הם שיתוף צבעוניים עם סמנים חלבוניים, תמונה של ערוץ immunofluorescence גם רכשה. שימו לב שחילוץ digitonin יכול לשמש גםכדי להמחיש הריבוזומים ER-כפותים וחלבונים 11.
    3. כדי להבטיח שאת עוצמות הקרינה בין השדות ניתן להשוות, את זמן החשיפה לכל ערוץ צריך להישאר קבוע עבור כל קבוצה של ניסוי.
    4. שוב כדי לוודא שאת עוצמות הניאון בין התאים בcoverslips השונה ניתן להשוות, השינויים מהיום ליום בעוצמת epiluminescence או ריקבון באות הדג צריכים להיות ממוזערים על ידי הדמיה את כל coverslips בפגישה אחת.
  2. כימות. כדי לכמת את הכמות של mRNA שהוא מקומית בחדר המיון, אנחנו משתמשים בתוכנת אלמנט ש"ח ניקון. עם זאת תוכנת ניתוח תמונה אחרת כגון ImageJ ניתן להשתמש.
    1. שימוש בכלי ניקון ש"ח אלמנט תמונת הניתוח, פריפרית התא ואת הגרעין מתואר כאזור נפרד של תחומי עניין (Rois).
    2. לכל החזר על השקעה, עוצמת הניאון (אני T לעצמת התא המוחלטת, ואני N כדיעצמה גרעינית) והאזור (T ו N) נרשמות ומיוצאות לגיליון Excel.
    3. עבור כל תמונה, עוצמת ניאון הרקע (אני B) נקבעה על ידי הקלטת האינטנסיביות של תאים לא transfected. אם (A) רמות ה-mRNA פולי הם נתחו, אזור תא חינם נבחר.
    4. הסכום הכולל של חדר מיון (בתאים שחולצו) או cytoplasmic (בתאי unextracted) פלואורסצנטי מחושב על ידי הנוסחא:
      [ט] [אני לא - אני B] - [N] [N - אני B]
    5. העוצמת המכתימה הגרעינית גם ניתן לחשב ומשמשת כבקרה פנימית בין טיפולים שונים. מאז גרעינים אינם מושפעים מטיפול digitonin 17 או שיבוש הריבוזום 11, הסכום של mRNA הגרעיני צריך להישאר קבוע בין כל אחד מטיפולים אלה. כדי לחשב פלואורסצנטי הגרעיני הנוסחא הבאה משמשת:
      [N] [N - אניB]
    6. האחוזים של mRNA cytoplasmic שהוא ER-ממוקד יכולים להיות מחושבים על ידי לקיחה את הקרינה הממוצעת ER של תאים חולצו 30-40 (ראה 4.2.4) מחולקת בפלואורסצנטי cytoplasmic הממוצע מתאי unextracted 30-40 (שוב ראה 4.2.4) . זה קריטי, כי התאים שחולצו וunextracted מוכנים, מוכתמים וצלמו במקביל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לקבוע את האחוז של mRNA שהוא ER-משויך, COS-7 תאים שtransfected עם פלסמידים שהכילו phosphatase אלקליין השליה (ALPP) או ציטוכרום P450-8B1 (CYP8B1) היה או חילוץ עם digitonin ולאחר מכן קבוע, או ישירות קבוע (ראה תרשים 1, להשוות "Unextracted Ctrl" כדי "לשלוף Ctrl"). פלואורסצנטי לא גרעיני כומתה בשתי דגימות והשבריר של mRNA ER-משויך מחושב (איור 2). הנתונים שלנו מראים בבירור כי לשניהם ALPP וCYP8B1, כ 60% מmRNA cytoplasmic קשורים לחדר המיון. מאחר ושניהם של mRNAs אלה מקודדים חלבונים המעובדים בER-הלום, התוצאות שלנו עולות בקנה אחד עם הרעיון שmRNAs כאלה מתורגמים על פני השטח של חדר המיון.

כדי לפקח על ER-העמותה של תמלילים אלה לאחר הריבוזום דיסוציאציה, transfected COS-7 תאים היו tr eated עם בקרת מדיה, puromycin או HHT למשך 30 דקות ולאחר מכן חלצו, קובעו ונצבעו באמצעות בדיקות FISH ספציפיות מכוונות נגד כל mRNA (לתמונות מייצגות ראה תרשים 1, לכימות וER-mRNA גרעיני הקשורים ראה איור 3). שים לב שALPP בלבד, ולא CYP8B1-mRNA, נשמר בחדר המיון לאחר שהריבוזומים מפורקים עם puromycin או HHT (איורים 2-3). חשוב לציין את הרמה של mRNA הגרעיני לא השתנתה בין הדגימות שטופלו בדרכים שונות לשני mRNA (איור 3). אות דגים גרעינית מתמדת זו מצביעה על כך שהשינויים בעוצמת קרינה בשבריר ER אינם בשל לשינויים בביטוי mRNA או שינויים בצביעת דגים.

מתוצאות אלה אנו מסיקים כי קבוצת משנה של mRNAs ER-ממוקד, כגון תמליל ALPP, נשמרה על פני השטח של אברון זה לאחר פירוק הריבוזום.

"Jove_content" fo: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> איור 1
איור 1. ALPP, אבל לא CYP8B1 mRNA נותר קשור באופן עצמאי לחדר המיון של הריבוזומים ותרגום. COS-7 תאים transfected עם פלסמידים המכילים גם ALPP (שורה העליונה), או CYP8B1 (שורה תחתונה) גנים ואפשר לה להביע mRNA עבור 18-24 שעות. התאים אז טופלו במדיום DMSO שליטה ("Ctrl"), puromycin ("Puro") או HHT למשך 30 דקות. תאים היו או קבועים ישירות ("unextracted") או 1 חולצו אז קבוע. שים לב שתאים אילו שליטה וHHT טופל התאים שהוצאו עם digitonin לבד, Puro טופל-הוצאו עם digitonin וEDTA. תאים הוכתמו לmRNA באמצעות בדיקות FISH ספציפיות, וצלמו. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר.

lways "> איור 2
איור 2. כימות הרמה של ER-עמותה לALPP וCYP8B1 mRNA. COS-7 תאי transfected היו או קבועות ישירות כדי לקבוע את הרמה הכוללת של mRNA בציטופלסמה (ראה איור 1, "Unextracted Ctrl" תאים) או 1 חילוץ ולאחר מכן תקנו כדי לקבוע את הכמות של mRNA ER-המשויך (ראה איור 1, "לשלוף Ctrl" תאים). עבור כל ניסוי את הקרינה הממוצעת ER-הנלווית של תאים חולצו 30-40 חולקה על ידי את הקרינה הממוצעת cytoplasmic של תאי unextracted 30-40, לתת את החלק היחסי של mRNA ER-מאוגד (ציר y). כל עמודה מייצגת הערך הממוצע ושגיאה סטנדרטית של שלושה ניסויים עצמאיים.

איור 3
איור 3. כימות של ER-association של ALPP וCYP8B1 mRNA לאחר ניתוק הריבוזום. COS-7 תאי transfected טופל במדיום שליטה או מעכבי תרגום שונים, חילוץ, קבוע, מוכתם לmRNA באמצעות בדיקות ספציפיות דגים והדמיה (ראה איור 1, תאים "לשלוף"). עוצמות הקרינה של ה-mRNA בחדר המיון והיו הגרעין לכימות. כל עמודה מייצגת הממוצעת והשגיאה הסטנדרטית של שלושה ניסויים עצמאיים, כל אחד בהיקף של העצמה המשולבת הממוצע של 30 תאים על רקע ומנורמל לקרינה בחדר המיון של תאי בקרה שטופלה (ציר y). שים לב כי למרות הפרעת הריבוזום גרמה CYP8B1 mRNA לנתק מחדר המיון, ברמות של mRNA הגרעיני לא הושפעו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הלוקליזציה של mRNAs לאתרי subcellular שונים, באמצעות האינטראקציה של תמלילים עם חלבוני לוקליזציה mRNA, היא תופעה נפוצה חשובה למיון הנכון של חלבונים ליעד הסופי שלהם, ולכוונון העדין של ביטוי גנים לדרישות המקומיות של subcellular אזור 19,20.

באמצעות הבדיקה שתואר כאן, אנו שבנו לבחון את השאלה האם mRNAs שמקודד חלבוני הפרשה יכול להישמר בחדר המיון בנוכחותו או היעדריו של הריבוזומים או תרגום. ואכן, מצא כי קבוצת משנה של mRNAs אלה יש פעילות זה 11. לדוגמה, שימוש בפרוטוקול זה חילוץ, קבע כי שניהם ALPP וCYP8B1 mRNAs מותאם לשפה מקומית על פני השטח של חדר המיון בשליטת COS-7 תאים שטופלו (איורי 1-2). עם זאת, לאחר טיפול בתאים עם מעכבי התרגום puromycin או HHT, רק ALPP, אבל לא CYP8B1-mRNA,נשאר קשור לחדר המיון בהעדר הריבוזומים ותרגום (איורים 1, 3) פונקציונליים. בנוסף מצאנו בעבר כי mRNA ALPP נשאר ER-קשור בתאי COS-7 טופלו 11 pactamycin. מאז טיפולים שונים אלה פועלים דרך מנגנונים מסתעפים כדי לנקות mRNA של הריבוזומים קשורים, אין זה סביר כי ER-העמותה של ALPP היא התוצאה של תגובה תאית כלשהי עקיפה לכל תרופה מסוימת. כדי לאשר שמעכבי תרגום אלו יעילות, הוא גם מועיל כדי לבדוק האם הן מעכבות את ההתאגדות של 35 S-מתיונין לחלבונים מסונתזים חדש. לדוגמה, מצאנו כי mdmp טיפול (100 מיקרומטר, 15 דקות) יכול לעכב 40-60% מכל סינתזת החלבון בתאי COS-7 (קואי XA וAF Palazzo, תצפיות שלא פורסמו) בלבד. כתוצאה מכך, תרופה זו אינה יעילה לשבש ER-הלוקליזציה של mRNAs שדורש תרגום למיקוד והתחזוקה שלהם (קואי XA וAF Palazzo, תצפיות שלא פורסמו).

על מנת להמשיך ולהבטיח כי חדר מיון המיקוד של mRNA אינו תלוי ברצף אות מקודד או תחומים הטרנסממברני, אפשר לשנות את תמליל אקסוגני כך שהוא מקודד חלבון cytoplasmic. אכן, הוכיחו בעבר שגרסה של ה-mRNA ALPP שהחסרים הוא רצף אות והטרנסממברני קידוד אזורים היא עדיין מסוגלת למקם ל11 ER.

כמו כן ראוי לציין שהשיטה שהוצגה כאן בשילוב עם מבחנים אחרים המשמשים לניתוח יצוא גרעיני mRNA 21, ניתן להשתמש בו כדי להגדיר את הקינטיקה ודרישות של תחבורת mRNA מתא אחד ל( למשל אחר מהגרעין אל פני השטח של ER). ואכן, על ידי microinjecting פלסמידים המכילים את גן ALPP לגרעינים של COS-7 תא שpretreated עם מעכבי תרגום, שהראינו בעבר כי ALPP עשה לאחרונהmRNAs ממוקד לחדר המיון באופן עצמאי מתרגום או 11 הריבוזום-עמותה.

למרות שאנחנו לא מבינים איך mRNAs האלה ממוקדים ומעוגן לחדר המיון, סביר להניח כי אברון זה מכיל קולטני ה-mRNA. ואכן אנו לאחרונה זיהינו p180, חלבון גדול טעון חיובי קרום נכנס, כפי שנדרש ליכולת של mRNA ALPP להיות מתוחזק באופן עצמאי לחדר המיון של תרגום 11. עם זאת, סביר להניח כי קולטני mRNA אחר חייב להיות נוכח בשטח של 11 ER. בעזרת הטכניקה שתואר כאן, אנחנו מקווים לזהות ולנתח רבים של המנגנונים המולקולריים המסייעים לווסת את לוקליזציה mRNA בתאי יונקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהלאומיים למדע והנדסת מועצת המחקר של קנדה לXAC וAFP

References

  1. Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).
  2. Walter, P., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).
  3. Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation. Cell. 71, 489-503 (1992).
  4. Grlich, D., Rapoport, T. A. Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane. Cell. 75, 615-630 (1993).
  5. Milcarek, C., Penman, S. Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes. J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).
  6. Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts. J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).
  7. Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver. J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).
  8. Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation. J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).
  9. Kruppa, J., Sabatini, D. D. Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes. J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).
  10. Adesnik, M., Maschio, F. Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes. Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).
  11. Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum. PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).
  12. Pestka, S. Inhibitors of ribosome functions. Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).
  13. Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine. Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).
  14. Weeks, D. P., Baxter, R. Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide. Biochemistry. 11, 3060-3064 (1972).
  15. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Cell. 147, 789-802 (2011).
  16. Lerner, R. S., et al. Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes. RNA. 9, 1123-1137 (2003).
  17. Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).
  18. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
  19. Lcuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  20. Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).
  21. Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection. J Vis Exp. 46, e2387 (2010).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 70 ביוכימיה גנטיקה ביולוגיה מולקולרית גנומיקה לוקליזציה mRNA RNA חילוץ digitonin חלוקה של תא reticulum endoplasmic הפרשה מיקרוסקופיה הדמיה פלורסנט דגים ביולוגיה של תא
ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Cui, X. A., Palazzo, A. F.… More

Cui, X. A., Palazzo, A. F. Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (70), e50066, doi:10.3791/50066 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter