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Biology

La visualización de los ARNm retículo endoplásmico localizados en células de mamíferos

Published: December 17, 2012 doi: 10.3791/50066
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry, University of Toronto

Summary

Aquí se describe un método para visualizar retículo endoplasmático asociados mRNAs en células de cultivo de tejidos de mamíferos. Esta técnica implica la permeabilización selectiva de la membrana plasmática con digitonina para eliminar el contenido citoplásmico seguido por fluorescente

Abstract

En eucariotas, la mayoría de los ARN mensajeros (ARNm) que codifican proteínas de membrana y secretada están localizados en la superficie del retículo endoplásmico (ER). Sin embargo, la visualización de estos mRNAs puede ser un reto. Esto es especialmente cierto cuando sólo una fracción del ARNm es ER-asociado y su distribución a este orgánulo es obstruida por no objetivo (es decir, "libre") transcripciones. A fin de supervisar ER-asociados mRNAs, hemos desarrollado un método en el que las células se tratan con una corta exposición a una solución de extracción que digitonina selectivamente permeabiliza la membrana plasmática, y por lo tanto elimina los contenidos citoplásmicos, manteniendo al mismo tiempo la integridad de la ER . Cuando este método se acopla con hibridación in situ fluorescente (FISH), uno puede visualizar claramente ER-mRNAs unidos por microscopía fluorescente. Usando este protocolo el grado de ER-asociación, ya sea para granel de poli (A) o transcripciones de ARNm específicos puede evaluarsee incluso cuantificados. En el proceso, se puede utilizar este ensayo para investigar la naturaleza de las interacciones ER-mRNA.

Introduction

En eucariotas, el ARNm que codifica secretadas y proteínas de membrana pueden ser dirigidos a la ER co-traduccional por la partícula de reconocimiento de señal de 1,2 y se puede mantener en el ER a través de las interacciones directas entre los ribosomas y translocons durante la traducción 3,4. Sin embargo, si mRNAs pueden ser dirigidos y mantenidos en la sala de emergencia independiente de cualquiera de los ribosomas o la traducción no está claro hasta muy recientemente. Estudios previos tratado de abordar la existencia de traducción independiente de la asociación con el mRNA ER utilizando técnicas de fraccionamiento celular. Debido a las duras condiciones químicas se requiere para disociar los ribosomas de ER vesículas derivadas, que pueden bloquear la potencialmente delicada ARNm-ER asociación, estos estudios no fueron concluyentes, proporcionando evidencia de 5-8 y 9,10 contra ribosomal independiente de anclaje de ARNm al ER .

Para superar estos problemas, se ha desarrollado un protopara aislar y col imagen ER-enlazados mRNAs. Este procedimiento consiste en un tratamiento de extracción suave, que elimina eficazmente todo el contenido citoplasmático de la célula (incluyendo los no consolidados ER-mRNAs) y al mismo tiempo preservar la morfología de ER y de todas sus moléculas asociadas. Usando este protocolo, hemos demostrado que un subconjunto de mRNAs están dirigidos y después se mantuvo en el ER independientemente de los ribosomas o la traducción 11.

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Protocol

1. Preparación de los materiales para la extracción

  1. Preparación de las células
    1. Semillas células de cultivo de tejidos en cubreobjetos tratados con ácido para al menos un día antes del experimento. Usamos COS-7 o U2OS, como estas dos líneas celulares exhiben producción de proteína secretada robusto y tener una bien definida ER. Tenga en cuenta que para lograr una eficiencia de extracción de alta, las células no debe exceder de 80% de confluencia en el cubreobjetos en el día del experimento.
    2. Si un ARNm exógeno particular, está siendo investigado, las células se transfectan un día después de la siembra con plásmidos que contienen el gen de interés utilizando protocolos estándar de transfección. Las células entonces se les permite expresar el mRNA durante al menos 18 horas antes de la extracción.
  2. El tratamiento de las células con inhibidores de la traducción
    1. Para probar el efecto de los ribosomas intactos en el mantenimiento de los ARNm de asociación con el ER, las células pueden ser tratadas con inhibidores de la traducción que alteran la asociaciónde los ribosomas con el ARNm de 11.
    2. Los inhibidores de la iniciación de la traducción, tales como homoharringtonin (HHT), pactamycin, o 2 - (4-metil-2 ,6-dinitroanilino) - N-metil-(MDMP), prevenir nuevos ribosomas de asociarse con la transcripción mientras que simultáneamente permite dedicadas a ribosomas traducción completar 12-14. Puesto que la velocidad de traducción para la mayoría de las proteínas en células de mamíferos es 5 aminoácidos por segundo, independientemente del uso del codón de ARNm o longitud 15, un tratamiento de 30 min se debe borrar ribosomas off de mensajes con marcos de lectura abiertos mientras 27.000 nucleótidos (que codifica para proteínas siempre que 9.000 aminoácidos).
    3. Inhibidores como puromicina promover la eyección prematura de la cadena naciente y así interrumpir polisomas 12. Sin embargo, para interrumpir completamente la asociación de los ribosomas a puromicina tratados con el ARNm, los quelantes tales como EDTA de magnesio se añaden al tampón de extracción digitonina 11.
      4. <li> En este experimento, las células se tratan con puromicina 200 mM, 5 mM HHT, o medio de control durante 30 min antes de la extracción.
  3. Preparación de tampón de extracción digitonina. Para visualizar ER-localizada mRNAs sin la obstrucción de la libre (es decir, no citoplásmicos ER-asociados) transcripciones, que selectivamente permeabilizar las células con digitonina, un glucósido esteroide que interacciona preferentemente con 3β-hydroxysterols. A bajas concentraciones, digitonina permeabiliza selectivamente porciones de la membrana plasmática, causando 'permeabilidad' 16. Por el contrario, la membrana del RE y envoltura nuclear, que son pobres en colesterol, se dejan intactos 16,17.
    1. Digitonina (Sigma Aldrich) en polvo se disuelve en agua destilada a 5% peso / volumen y esta solución madre se dividió en alícuotas en volúmenes pequeños y se almacena a -20 ° C. En nuestra experiencia, múltiples ciclos de congelación-descongelación disminuye la eficiencia de digitonina disuelve.
    2. Una solución stock de10x tampón de CHO (1x concentración de la solución de trabajo: 115 mM KAc, 25 mM HEPES pH 7,4, 2,5 mM de MgCl 2, 2 mM EGTA y 150 mM de sacarosa) se prepara con RNasa libre de reactivos y se almacenó a -20 ° C. Una solución de trabajo (1x tampón de CHO) se prepara diluyendo la solución madre con RNasa libre de agua y se puede almacenar a 4 ° C.

2. Extracción digitonina

  1. Preparación de soluciones de aspirado
    1. Un bloque de calentamiento con una superficie plana es pre-calentado a 40 ° C y se mantuvo a esta temperatura durante la extracción.
    2. Para formar una superficie de trabajo plana, que es libre de RNasa, el bloque de calentamiento se humedece con un poco de agua y se cubrió con un trozo nuevo de Parafilm M (Bemis Company, Inc). Las burbujas de aire entre la lámina y el bloque de parafina calefacción se suavizan con RNasa libre de guantes y Kimwipes (VWR).
    3. 1x tampón de CHO se calienta a 37 ° C por incubación en un baño de agua.
    4. 6-y las placas se utilizan para lavary fijar las células. Cada fila de 3 pozos se utiliza para un cubreobjetos. Para los dos primeros pocillos de la fila, 2 ml de tampón de CHO calentada se añade. Para el último pocillo, 2 ml de la solución de fijación (paraformaldehído PBS + 4% (Ciencias de microscopio electrónico)) se añade. Esta bandeja puede ser almacenado en la incubadora a 37 º C hasta que las células están listas para la extracción.
    5. Solución de digitonina extracción se prepara por dilución de la solución stock de digitonina al 0,025% con tampón de CHO caliente justo antes de su uso. Una vez más en cuenta que para las células tratadas con puromicina, el tampón de extracción, además, debe contener 20 mM EDTA para interrumpir eficazmente ribosomas 11. Gotas de 100 l de la solución de extracción se colocan en el bloque de calentamiento Parafilm cubierta inmediatamente antes de la extracción.
  2. Digitonina Extracción y fijación de células
    1. Eliminar las células de la incubadora a 37 º C.
    2. Durante el proceso de extracción, los cubreobjetos son manipulados con la ayuda de fórceps de jewler. Conlas pinzas recoger el cubreobjetos y sumergirla en el buffer de CHO primero y luego el segundo pozo que contiene para lavar el medio de cultivo.
    3. Rápidamente Seque el exceso de tampón de la parte posterior del cubreobjetos con un Kimwipe e inmediatamente colocar el cubreobjetos, lado de la celda hacia abajo, en la solución de extracción.
    4. Después de 10 segundos, levante el cubreobjetos con las pinzas e inmediatamente transferir, lado de la celda hacia arriba, hacia el pozo que contiene el tampón de fijación 4% paraformaldehído.
    5. Deje incubar la muestra en fijador durante al menos 15 min a temperatura ambiente.
  3. Preparación de las células de control no extraído. Para determinar la cantidad total de ARNm en el citoplasma que es una buena idea para preparar una muestra de control no extraído.
    1. Las células cultivadas sobre cubreobjetos se preparan como anteriormente (véase la sección 2,2), excepto que la etapa de extracción de digitonina (2.2.3) se omite.
    2. Después de la fijación, las células no-extraídos deben ser permeabilizaron en PBS + 0,1% de TritonX-100 durante 15 min a temperatura ambiente.

3. FISH tinción

  1. El diseño de sondas para la hibridación in situ fluorescente
    1. La secuencia primaria del mRNA de interés se pliega usando ARN software de predicción de estructura secundaria, tales como RNAstructure 5,0 18. Los pliegues de ARNm se evaluó visualmente para identificar una región de aproximadamente 50 nucleótidos que está libre de grandes estructuras secundarias.
    2. El complemento inverso de esta región se sintetiza con un fluoróforo Alexa546 unido al extremo 5 'de la sonda (adquirido de DNA Technologies Integrados).
    3. La sonda se diluyó con agua libre de ARNasa a una concentración stock de 100 mM que se pueden almacenar a -20 ° C.
  2. La tinción con sondas FISH
    1. Tenga en cuenta que aunque las células digitonina-extrajeron no requieren permeabilización adicional, el tratamiento de estas muestras fijadas con 2 ml de 0,1% de Triton X-100 diluido enPBS durante 15 min a temperatura ambiente antes de la tinción FISH, ayuda a reducir la señal de fondo.
    2. Los portaobjetos se lavaron dos veces con PBS para eliminar cualquier paraformaldehído residual o Triton X-100.
    3. Las células se lavan dos veces con formamida 25% a 60% en 1X tampón de citrato sódico (150 mM NaCl y 15 mM citrato de sodio). En general, para las sondas específicas de peces que son 50-60 nucleótidos de longitud, 60% de formamida se utiliza, pero para la tinción de ARNm poli (A) con sonda de oligo FISH (dT), el nivel de formamida se reduce hasta 25%.
    4. Para preparar la cámara de tinción, la parte inferior de una placa de Petri de 150 mm se cubre con agua y un trozo de Parafilm es flotó en el agua. El agua se elimina haciendo girar el plato sobre, permitiendo así que el parafilm para adherirse a la parte inferior del plato. Las burbujas de aire se retiran manualmente con Kimwipes.
    5. Para cada cubreobjetos para ser teñidos, pipetee una gota 100 ml de la solución de hibridación que contenía la sonda FISH de interés sobre la parafilm en la cámara de tinción. La sonda FISH madre se diluye con formamida 25% a 60% en tampón de hibridación (SSC 1x, 100 mg / ml de sulfato de dextrano, 1 mg / ml de ARNt de levadura, complejo de vanadilo ribosida 5 mM, 25-60% de formamida) a una concentración de trabajo de 0,2 m. Tenga en cuenta que la cantidad de formamida debe ser optimizado para la sonda particular que se usa y está presente en la misma concentración como en el tampón de lavado de SSC (ver paso 3.3.3).
    6. El cubreobjetos se coloca boca abajo sobre la celda lateral de la solución de FISH en la cámara de tinción y se incubaron durante 5-24 horas a 37 ° C en una cámara humidificada, tales como el cultivo de tejidos incubadora.
  3. El lavado y el montaje de las muestras teñidas
    1. Para preparar un área de lavado RNasa libre, establecer una franja de parafina sobre una superficie plana y nivelada, como una mesa de laboratorio. Para asegurarse de que la parafina es plana, húmeda la superficie nivelada, coloque la parafina en la parte superior y quitar manualmente las burbujas de aire con Kimwipes.
    2. La cámara de tinción essacaron de la incubadora y se colocan en una superficie plana. Los cubreobjetos se luego flotó pipeteando aproximadamente 500 l de tampón de lavado FISH cerca del borde de cada cubreobjetos. La solución se elaborará en el medio del cubreobjetos y la parafina a través de la acción capilar.
    3. Para cada cubreobjetos, 1 ml de tampón de lavado (1x SCC con 25-60% de formamida, consulte el paso 3.3.3) se pipetearon sobre el parafilm zona de lavado (véase la etapa 3.4.1).
    4. Utilizando pinzas, los cubreobjetos se retiraron de la cámara y cada tinción se coloca sobre la gota de tampón de lavado y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min. El proceso de lavado se repite 3 veces.
    5. Portaobjetos de vidrio se lavan con 70% de etanol, y se secó con Kimwipes.
    6. Para cada cubreobjetos, 25 l de solución de montaje (DAPI Fluoromount G, Southern Biotech) se pipetea sobre el portaobjetos. Tenga en cuenta que esta solución contiene 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), que las manchas de ADN y permite la visualización de los núcleos.
    7. Usifórceps ng y Kimwipes, la parte posterior del cubreobjetos y se seca el exceso de tampón de lavado FISH es borrado apagado sin secar la muestra. Cada cubreobjetos se coloca lado de la célula hacia abajo, sobre la gota de solución de montaje.
    8. Muestras montadas se etiquetan y se puede almacenar a 4 ° C.

4. Imagen y Cuantificación

  1. Proyección de imagen
    1. Un microscopio de epifluorescencia se utiliza para la imagen de las células después de la tinción con FISH. La célula transfectada se puede diferenciar de las células no transfectadas por señal brillante de fluorescencia en el canal apropiado. Idealmente, cada campo adquirido también contendrá un celular sin transfectar a ser utilizado para determinar la fluorescencia de fondo para la cuantificación.
    2. Para cada imagen de campo de los peces y el canal de DAPI se adquieren. Además, si las células se co-teñidas con los marcadores de proteínas, una imagen del canal de inmunofluorescencia también se adquiere. Tenga en cuenta que la extracción de digitonina también se puede utilizarpara visualizar ER enlazados a ribosomas y proteínas 11.
    3. Para asegurarse de que las intensidades de fluorescencia entre los campos se puede comparar, el tiempo de exposición para cada canal debe permanecer constante para cada conjunto de experimento.
    4. Una vez más para asegurarse de que la intensidad de fluorescencia entre las células en cubreobjetos diferentes pueden ser comparados, los cambios del día a día en la intensidad epiluminiscencia o deterioro en la señal de FISH debe reducirse al mínimo mediante imágenes de todos los cubreobjetos en una sola sesión.
  2. Cuantificación. Para cuantificar la cantidad de ARNm que se localiza en el ER, se utiliza el software Nikon Elemento NIS. Sin embargo otro software de análisis de imagen tal como ImageJ se puede utilizar.
    1. Con la herramienta Nikon NIS elemento de análisis de imagen, la periferia de la célula y el núcleo se describen como región separada de Interés (ROI).
    2. Para cada retorno de la inversión, la intensidad de fluorescencia (I T para la intensidad total de células y N para elintensidad nuclear) y el área (A y T N A) se registran y se exporta a una hoja de cálculo de Excel.
    3. Para cada imagen, la intensidad de fondo fluorescente (I B) se determina mediante el registro de la intensidad de una célula no transfectadas. Si poli (A) los niveles de ARNm están siendo analizados, una zona libre de células se selecciona.
    4. La cantidad total de ER (en células extraídas) o citoplásmica (en células no extraídos) de fluorescencia se calcula por la fórmula:
      [A T] [I T - I B] - [A N] [N I - I B]
    5. La intensidad de la tinción nuclear también puede ser calculado y utilizado como control interno entre los diversos tratamientos. Puesto que los núcleos no se ven afectados por el tratamiento de digitonina 17 o interrupción ribosoma 11, la cantidad de mRNA nuclear debe permanecer constante entre cada uno de estos tratamientos. Para calcular la fluorescencia nuclear se utiliza la siguiente fórmula:
      [A N] [I N - IB]
    6. El porcentaje de ARNm citoplásmico que es ER-establecida se calcula tomando la media de fluorescencia ER de 30-40 células extraídas (véase 4.2.4) dividido por la media de fluorescencia citoplásmica 30 a 40 células no extraídos de nuevo (véase 4.2.4) . Es crítico que las células extraídas y sin extraer se preparan, se tiñeron y fotografiado en paralelo.

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Representative Results

Para determinar el porcentaje de ARNm que es ER-asociado, células COS-7 que se transfectaron con plásmidos que contenían la fosfatasa alcalina placentaria (MF) o el citocromo P450 8B1 (CYP8B1) se extrajeron bien con digitonina y luego se fija, o fijada directamente (véase la Figura 1, comparar "no extraído Ctrl" a "Extraídas Ctrl"). La fluorescencia no nuclear se cuantificó en ambas muestras y la fracción de ER asociada a ARNm se calculó (Figura 2). Nuestros datos muestran claramente que tanto para MF y CYP8B1, aproximadamente el 60% del ARNm citoplásmico se asocia con el ER. Puesto que ambos de estos mRNAs codifican proteínas que son procesadas en el ER-lumen, nuestros resultados son consistentes con la idea de que los ARNm se traducen en la superficie de la ER.

Para supervisar el ER-asociación de estas transcripciones después de la disociación del ribosoma, se transfectan células COS-7 fueron treated con el control de los medios de comunicación, puromicina o HHT durante 30 min y después se extrajo, se fijaron y tiñeron FISH utilizando sondas específicas dirigidas contra cada ARNm (para imágenes representativas véase la Figura 1, para la cuantificación de ER-y nuclear asociado-mRNA ver Figura 3). Tenga en cuenta que sólo ABPP, y no CYP8B1 mRNA, se mantiene en el ER después de ribosomas se desmontan con puromicina o HHT (Figuras 2-3). Es importante destacar que el nivel de mRNA nuclear no varió entre las muestras diversamente tratados, ya sea para ARNm (Figura 3). Esta señal constante FISH nuclear indica que los cambios en la intensidad de fluorescencia en la fracción de ER no se deben a alteraciones en la expresión de ARNm o variaciones en la tinción de FISH.

A partir de estos resultados se concluye que un subconjunto de ER-mRNAs específicos, tales como la transcripción ABPP, se mantiene en la superficie de este orgánulo después de ribosomas desmontaje.

"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figura 1
Figura 1. ABPP, pero no CYP8B1 mRNA permanece asociado con el ER independientemente de los ribosomas y la traducción. Células COS-7 fueron transfectadas con plásmidos que contienen ya sea el ABPP (fila superior), o CYP8B1 (fila inferior) genes y se dejó que expresan ARNm para 18-24 hr. Las células se trataron entonces con DMSO medio de control ("Ctrl"), la puromicina ("Puro") o HHT por 30 min. Las células fueron ya sea directamente fijado ("sin extraer") o primero se extrae luego se fija. Tenga en cuenta que las células mientras que las células de control y tratados con HHT se extrajeron con digitonina solo, Puro-tratadas se extrajo con digitonina y EDTA. Las células se tiñeron para el ARNm utilizando sondas específicas pescado, y creará una imagen. Barra de escala = 20 micras.

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Figura 2. La cuantificación del nivel de ER-Asociación de ABPP y mRNA CYP8B1. Transfectadas COS-7 células fueron ya sea directamente fijados para determinar el nivel total de ARNm en el citoplasma (véase la Figura 1, "Ctrl" sin extraer las células) o se extrae primero y después se fijaron para determinar la cantidad de mRNA ER-asociado (véase la Figura 1, "Ctrl Extraídas" células). Para cada experimento de la media ER fluorescencia asociada a las células extraídas de 30-40 fue dividida por la media de fluorescencia citoplásmica de 30-40 células no extraídos, para dar la fracción de ER-bound ARNm (eje y). Cada barra representa el valor medio y el error estándar de tres experimentos independientes.

Figura 3
Figura 3. La cuantificación de la ER-asociación de MF y CYP8B1 mRNA después de la disociación del ribosoma. transfectadas COS-7 células fueron tratadas con medio de control o varios inhibidores de traducción, se extrajo, fijo, manchado para el ARNm utilizando sondas específicas FISH y la imagen (véase la Figura 1, "extrae" células). Las intensidades de fluorescencia de mRNA en el ER y el núcleo se cuantificaron. Cada barra representa el promedio y el error estándar de tres experimentos independientes, cada uno formado de la intensidad media integrada de 30 células sobre el fondo y se normalizaron a la fluorescencia en el ER de las células tratados con control (eje y). Tenga en cuenta que aunque la interrupción causada ribosoma CYP8B1 mRNA de disociarse de la ER, los niveles de mRNA nuclear no se vieron afectados.

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Discussion

La localización de los ARNm a varios sitios subcelulares, a través de la interacción con las proteínas de las transcripciones de ARNm de localización, es un fenómeno generalizado importante para la selección adecuada de las proteínas a su destino final, y para el ajuste fino de la expresión de genes a los requisitos locales de una subcelular 19,20 región.

Usando el ensayo descrito aquí, se volvió a examinar la cuestión de si los ARNm que codifican proteínas de secreción puede mantenerse en la ER en la presencia o ausencia de ribosomas o la traducción. De hecho, encontramos que un subconjunto de estos mRNAs tienen esta actividad 11. Por ejemplo, utilizando este protocolo de extracción, se determinó que tanto ABPP y mRNAs CYP8B1 se localiza en la superficie de la ER en el control tratados células COS-7 (Figuras 1-2). Sin embargo, después de tratar las células con inhibidores de la traducción puromicina o HHT, ABPP sólo, pero no CYP8B1 mRNA,se mantuvo asociado con la ER en la ausencia de ribosomas funcionales y la traducción (Figuras 1, 3). Además encontramos previamente que el ARNm de ABPP permanece ER-asociado en células COS-7 tratadas con pactamycin 11. Puesto que estos diversos tratamientos actúan por mecanismos divergentes para borrar ARNm de ribosomas asociados, es poco probable que el ER-asociación de MF es el resultado de alguna respuesta indirecta celular para cualquier fármaco particular. Para confirmar que estos inhibidores de la traducción son eficaces, también es útil para probar si inhiben la incorporación de 35 S-metionina en las proteínas recién sintetizadas. Por ejemplo, hemos encontrado que MDMP-tratamiento (100 mM, 15 min) sólo puede inhibir 40-60% de toda la síntesis de proteína en células COS-7 (Cui XA y Palazzo AF, observaciones no publicadas). Como resultado, este fármaco no es eficaz interrumpir el ER-localización de los ARNm que requieren traducción para su focalización y mantenimiento (XA Cui y Palazzo AF, observaciones no publicadas).

Para garantizar aún más que ER-focalización del ARNm no es dependiente de la secuencia señal codificada o dominios transmembrana, se puede alterar la transcripción exógeno de manera que codifica una proteína citoplasmática. En efecto, hemos demostrado previamente que una versión del ARNm ABPP que carece tanto de secuencia de señal y transmembrana regiones codificantes todavía es capaz de localizar a la ER 11.

Es también digno de mención que el método que aquí se presenta cuando se combina con otros ensayos utilizados para analizar la exportación nuclear de ARNm 21, se puede utilizar para definir la cinética y los requisitos de transporte de ARNm de un compartimento a otro (por ejemplo desde el núcleo hasta la superficie de la ER). En efecto, por microinyección de plásmidos que contienen el gen MF en los núcleos de las células COS-7 de células que se trataron previamente con inhibidores de la traducción, previamente demostrado que recién hecho ABPPmRNAs se dirigen a la sala de emergencia de forma independiente de la traducción o de ribosomas asociación 11.

Aunque no acabamos de entender cómo estos mRNAs se dirigen y se ancla a la sala de emergencias, es probable que este orgánulo que contiene receptores de mRNA. De hecho hemos identificado recientemente p180, una gran carga positiva unido a la membrana de proteínas, como se requiere para la capacidad de mRNA ABPP que se mantenga en el ER independientemente de traducción 11. Sin embargo, es probable que otros receptores de mRNA debe estar presente en la superficie de la ER 11. Con la ayuda de la técnica descrita aquí, esperamos poder identificar y analizar muchos de los mecanismos moleculares que ayudan a regular la localización del mRNA en células de mamífero.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por becas de la National Science and Engineering Research Council de Canadá a XAC y AFP

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Biología Celular número 70 Bioquímica Genética Biología Molecular Genómica localización de ARNm el ARN la extracción de digitonina fraccionamiento celular el retículo endoplásmico la secreción la microscopía imágenes fluorescente FISH biología celular
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