Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering av endoplasmatiska nätverket Lokaliserade mRNA i däggdjursceller

Published: December 17, 2012 doi: 10.3791/50066
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry, University of Toronto

Summary

Här beskriver vi en metod för att visualisera endoplasmatiska retiklet-associerade mRNA i däggdjursceller vävnadsodlingsceller. Denna teknik inbegriper selektiv permeabilisering av plasmamembranet med digitonin att avlägsna cytoplasmiska innehåll följt av fluorescerande

Abstract

I eukaryoter, de flesta av budbärar-RNA (mRNA) som kodar utsöndrade och membranproteiner är lokaliserade på ytan av det endoplasmatiska retiklet (ER). Däremot kan visualisering av dessa mRNA vara en utmaning. Detta är särskilt sant när endast en bråkdel av mRNA är ER-associerad och deras fördelning till denna organell hindras av icke-riktade (dvs. "fri") transkript. För att övervaka ER-associerade mRNA, har vi utvecklat en metod i vilken cellerna behandlas med en kort exponering för en digitonin extraktionslösning som selektivt permeabilizes plasmamembranet, och därigenom avlägsnar cytoplasmiska innehåll, samtidigt som man behåller integriteten hos ER . När denna metod kopplas med fluorescent in situ hybridisering (FISH), kan man visualisera klart ER-bundna mRNA genom fluorescerande mikroskopi. Använda detta protokoll graden av ER-förening för antingen bulk poly (A)-transkript eller särskilda mRNA kan bedömasoch även kvantifieras. I processen, kan man använda denna analys för att undersöka karaktären av mRNA-ER-interaktioner.

Introduction

I eukaryoter, mRNA som kodar utsöndrade och membranproteiner kan riktas till ER sam-translationellt av signalen erkännande partikel 1,2 och kan bibehållas på ER via direkta interaktioner mellan ribosomer och translocons under översättningen 3,4. Men om mRNA kan riktas och underhållas på ER oberoende av antingen ribosomer eller översättning var oklart tills helt nyligen. Tidigare studier försökt åtgärda om det finns translation oberoende mRNA samarbete med ER hjälp av cellulära fraktioneringstekniker. Eftersom starka kemiska förhållanden var tvungna att ta avstånd ribosomer från ER härledda vesikler, som kan störa potentiellt känsliga mRNA-ER förening var dessa studier ofullständiga och ger bevis för 5-8 och mot 9,10 ribosomal-oberoende förankring av mRNA till ER .

För att kringgå dessa problem har vi utvecklat en protocol att isolera och bild ER-bundna mRNA. Detta förfarande innebär en mild extraktion behandling, som effektivt avlägsnar allt cytoplasmatiska innehållet i cellen (inklusive icke ER-bundna mRNA) samtidigt bevarar ER morfologi och alla dess associerade molekyler. Med hjälp av detta protokoll har vi visat att en delmängd av mRNA är riktade och upprätthålls på ER oberoende av ribosomer eller översättning 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av material för utvinning

  1. Framställning av celler
    1. Seed vävnadskulturceller på syrabehandlade täckglas för minst en dag före försöket. Vi använder COS-7 eller U2OS, eftersom dessa två cellinjer uppvisar robusta produktion av utsöndrat protein och har en väl definierad ER. Observera att för att uppnå hög extraktionseffektivitet bör cellerna inte överstiga 80% konfluens på täckglaset på dagen för experimentet.
    2. Om en särskild exogen mRNA utreds, transfekteras celler en dag efter ympning med plasmider innehållande genen av intresse med användning av standardiserade protokoll transfektion. Cellerna tilläts sedan att uttrycka mRNA för minst 18 timmar före extraktion.
  2. Behandling av cellerna med översättning hämmare
    1. För att testa effekten av intakta ribosomer på underhåll av mRNA samband med ER, kan celler behandlas med översättning hämmare som stör sambandetav ribosomer med mRNA 11.
    2. Hämmare av translationsinitiering, såsom homoharringtonin (HHT), pactamycin eller 2 - (4-metyl-2 ,6-dinitroanilino) - N-metylpropionamid (MDMP) förhindra att nya ribosomer från associera med utskriften samtidigt tillåter engagerade ribosomer till fullständig översättning 12-14. Eftersom översättningen hastigheten för de flesta proteiner i däggdjursceller är 5 aminosyror per sekund, oberoende av kodonanvändning eller mRNA längd 15, bör en behandling av 30 min klara ribosomer bort av meddelanden med öppna läsramar så länge som 27.000 nukleotider (som kodar för proteiner så länge som 9.000 aminosyror).
    3. Hämmare såsom puromycin främja tidig utstötning av den begynnande kedjan och därmed störa polysomer 12. Men helt störa associationen av puromycin-behandlade ribosomer med mRNA, måste magnesium kelatorer såsom EDTA sättas till digitonin extraktionsbuffert 11.
      4. <li> I detta experiment, behandlas celler med 200 | iM puromycin, 5 pM HHT, eller kontrollmedium under 30 minuter före extraktion.
  3. Beredning av Digitonin extraktionsbuffert. Att visualisera ER-lokaliserade mRNA utan hinder av fria (dvs. cytoplasmiska, icke-ER-associerade) transkript permeabilisering vi selektivt cellen med digitonin, en steroid glykosid som interagerar företrädesvis med 3β-hydroxysterols. Vid låga koncentrationer, permeabilizes digitonin selektivt delar av plasmamembranet, vilket orsakar "läckage" 16. Däremot är ER membranet och kärnhöljet, som är fattiga i kolesterol, lämnas intakt 16,17.
    1. Digitonin (Sigma Aldrich) pulver löses i destillerat vatten vid 5% vikt / volym och denna stamlösning i alikvoter i små volymer och förvarades i -20 ° C. I vår erfarenhet minskar flera frys-tö cykler effektivitet upplöst digitonin.
    2. En förrådslösning av10x CHO buffert (1x arbetslösning koncentration: 115 mM KAc, 25 mM HEPES pH 7,4, 2,5 mM MgCl2, 2 mM EGTA och 150 mM sackaros) framställs med RNas-fria reagens och lagrades vid -20 ° C. En arbetslösning (1x CHO buffert) framställs genom att späda stamlösningen med RNas-fritt vatten och kan lagras vid 4 ° C.

2. Digitonin Extraktion

  1. Förbereda extraktionslösningarna
    1. Ett värmeblock med en plan yta är förvärmd till 40 ° C och hölls vid denna temperatur under till extraktion.
    2. För att bilda en plan arbetsyta som är RNas-fritt, är värmeblocket fuktas med lite vatten och överlagras med en ny bit parafilm M (Bemis Company, Inc). Luftbubblor mellan parafilm arket och värmeblock jämnas ut med RNase-fria handskar och Kimwipes (VWR).
    3. 1x CHO buffert värms till 37 ° C genom inkubering i ett vattenbad.
    4. 6-brunnars plattor används för att tvättaoch fixera cellerna. Varje rad av 3 brunnar används för en cover-slip. Till de första två brunnar i raden, är 2 ml uppvärmd CHO buffert. Till den sista brunnen, (PBS + 4% paraformaldehyd (Electron Microscope Sciences)) 2 ml av fixeringen tillsätts. Detta fack kan lagras i 37 ° C inkubator tills cellerna är redo för extraktion.
    5. Digitonin extraktionslösning framställes genom utspädning av stamlösning digitonin till 0,025% med varmt CHO buffert just före användning. Återigen observera att för puromycin-behandlade celler, måste extraktionsbufferten dessutom innehålla 20 mM EDTA för att effektivt störa ribosomer 11. Droppar av 100 ul av extraktionslösningen placeras på parafilm täckt värmeblock omedelbart före extraktion.
  2. Digitonin Extraktion och Cell Fixering
    1. Avlägsna cellerna från 37 ° C inkubator.
    2. Under extraktionsprocessen är täckglas manipuleras med hjälp av jewler s pincett. Medtången plocka upp täckglas och doppa den i den första och därefter den andra brunnen innehållande CHO-buffert för att tvätta av tillväxtmediet.
    3. Snabbt blot bort överflödigt buffert från baksidan av täckglaset med en Kimwipe och omedelbart placera täckglas, cell nedåt på extraktionslösningen.
    4. Efter 10 sek, plocka upp täckglaset med pincett och omedelbart överföra den, cell uppåt, till brunnen innehåller 4% paraformaldehyd fastställande buffert.
    5. Låt provet inkubera i fixativ under minst 15 minuter vid rumstemperatur.
  3. Beredning av oextraherade Control Cells. För att bestämma den totala mängden mRNA i cytoplasman är en bra idé för att framställa en oextraherade kontrollprov.
    1. Celler odlas på täckglas framställs som ovan (se avsnitt 2.2), förutom att digitonin extraktionssteget (2.2.3) hoppas över.
    2. Efter fixering, FN-extraherade celler måste permeabiliserades i PBS + 0,1% TritonX-100 under 15 min vid rumstemperatur.

3. FISK färgning

  1. Designing prober för fluorescens in situ hybridisering
    1. Den primära sekvensen av mRNA av berörda viks använda RNA sekundär mjukvara struktur förutsägelse, såsom RNAstructure 5,0 18. MRNA veck visuellt för att identifiera en region av omkring 50 nukleotider som är fri från stora sekundära strukturer.
    2. Det omvända komplementet av denna region syntetiseras med en Alexa546 fluorofor fäst till 5-änden av sonden (inköpt från Integrated DNA Technologies).
    3. Sonden spädes med RNas-fritt vatten till en stamkoncentration av 100 pM som kan lagras vid -20 ° C.
  2. Färgning med fisk sonder
    1. Notera att även om de digitonin-extraherade celler inte kräver ytterligare permeabilisering, behandla dessa fasta prover med 2 ml 0,1% Triton X-100 i utspäddPBS i 15 minuter vid rumstemperatur före FISK färgning, bidrar till att minska bakgrundssignalen.
    2. Objektglasen tvättas sedan två gånger med PBS för att avlägsna eventuellt kvarvarande paraformaldehyd eller Triton X-100.
    3. Cellerna tvättas sedan två gånger med 25% till 60% formamid i 1X natriumcitratbuffert (150 mM NaCl och 15 mM natriumcitrat). Generellt för specifika FISH prober som är 50-60 nukleotider i längd, är 60% formamid användas, men för poly (A)-mRNA-färgning med oligo (dT) FISK sond, är nivån av formamid reduceras ned till 25%.
    4. För att förbereda färgning kammaren är botten av en 150 mm petriskål täckt med vatten och en bit av parafilm flyter på vattnet. Vattnet avlägsnas genom att vrida skålen över, vilket gör det möjligt parafilmen att vidhäfta till botten av skålen. Luftbubblor bort manuellt med Kimwipes.
    5. För varje täckglas ska färgas, pipettera en 100 ul droppe av hybridiseringslösningen innehåller fisk sond av intresse på parAFILM i färgningen kammaren. Mälden FISH sonden spädes med 25% till 60% formamid i hybridiserings-buffert (1 x SSC, 100 mg / ml dextransulfat, 1 mg / ml jäst-tRNA, 5 mM vanadyl komplex ribosid, 25-60% formamid) till ett fungerande koncentration av 0,2 pM. Notera att mängden formamid bör optimeras för den specifika sonden som används och är närvarande vid samma koncentration som i SSC-tvättbuffert (se steg 3.3.3).
    6. Täckglaset placeras framsidan celler nedåt på FISH-lösningen i färgning kammaren och inkuberades under 5-24 timmar vid 37 ° C i en befuktad kammare, såsom vävnadsodlingsinkubator.
  3. Tvättning och montering av färgade prover
    1. Att förbereda en RNas fri tvätt område, fastställa en remsa av parafilm på en jämn plan yta, till exempel en labb bänk. För att säkerställa att parafilm är platt, blöt jämn yta, placera parafilm ovanpå och manuellt ta bort eventuella luftbubblor med Kimwipes.
    2. Färgningen kammaren ärbort från inkubatorn och placeras på ett plant underlag. Täckglasen sedan flöt genom pipettering ca 500 pl FISH tvättbuffert nära kanten av varje täckglas. Lösningen kommer att dras in mellan täckglas och parafilm via kapillärkraften.
    3. För varje täckglas, är 1 ml tvättbuffert (1x SCC med 25-60% formamid, se steg 3.3.3) pipetterades på tvätt området parafilm (se steg 3.4.1).
    4. Använd pincett, är täckglasen avlägsnades från färgning kammaren och var och en är placerad på droppe tvättbuffert och inkuberades vid rumstemperatur under 5 min. Tvättprocessen upprepas 3 gånger.
    5. Glasskivor tvättas med 70% etanol, och torkades med Kimwipes.
    6. För varje täckglas är 25 il monteringslösning (DAPI Fluoromount G, Södra Biotech) pipetterades på bilden. Observera att denna lösning innehåller 4 ',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), vilka fläckar DNA och medger visualisering av kärnor.
    7. USIng pincett och Kimwipes, är baksidan av täckglaset torkades och överskott FISH tvättbuffert blottas bort utan torkning av provet. Varje täckglas placeras sedan celler nedåt, på droppe monteringslösning.
    8. Monterade prover märks sedan och kan lagra vid 4 ° C.

4. Imaging och kvantifiering

  1. Imaging
    1. Ett epifluorescensmikroskop används för att avbilda celler följande fiskarter färgning. Den transfekterade cellen kan skiljas från otransfekterade celler av starkt fluorescenssignal i den lämpliga kanalen. Helst kommer varje förvärvad fält innehålla även en icke-transfekterade cell som skall användas för att bestämma bakgrundsfluorescens för kvantifiering.
    2. För varje fält bilder av fisken och DAPI kanal förvärvas. Dessutom, om cellerna samtidigt färgas med protein markörer, är en bild av immunofluorescens kanalen också förvärvas. Observera att digitonin extraktion också kan användasatt visualisera ER-bundna ribosomer och proteiner 11.
    3. För att säkerställa att fluorescensintensiteterna mellan fält kan jämföras, bör exponeringstiden för varje kanal förbli konstant för varje uppsättning av experiment.
    4. Återigen för att säkerställa att fluorescensintensiteter mellan celler på olika täckglas kan jämföras bör dag till dag förändringar i epiluminescence intensitet eller förfall i FISH signalen minimeras genom avbildning alla täckglasen i ett enda sammanträde.
  2. Kvantifiering. För att kvantifiera mängden mRNA som är lokaliserad på ER, använder vi Nikon NIS Element programvara. Men andra bildanalys programvara som ImageJ kan användas.
    1. Använda Nikons NIS ELEMENT bildanalys verktyg är cellens periferi och kärnan beskrivs som en separat region intressen (ROI).
    2. För varje ROI, den fluorescerande intensitet (I T för den totala celler intensitet och jag n förnukleära intensitet) och området (A T och A N) registreras och exporteras till ett Excel-kalkylblad.
    3. För varje bild, är bakgrunden fluorescensintensitet (I B) bestämmas genom registrering av intensiteten hos en icke-transfekterad cell. Om poly (A) mRNA-nivåer analyseras, är ett cellfritt område som väljs.
    4. Den totala mängden av ER (i extraherade celler) eller cytoplasmisk (i oextraherade celler) fluorescens beräknas enligt formeln:
      [A T] [I T - I B] - [A N] [I N - I B]
    5. Den nukleära färgningsintensitet kan också beräknas och användas som intern kontroll mellan olika behandlingar. Eftersom kärnor inte påverkas av digitonin behandling 17 eller ribosom störningar 11 bör mängden av kärn-mRNA förblir konstant mellan alla dessa behandlingar. För att beräkna nukleär fluorescens följande formel används:
      [A N] [I N - jagB]
    6. Den procent av cytoplasma mRNA som är ER-riktad kan beräknas genom att ta genomsnittet ER fluorescens av 30-40 extraherade celler (se 4.2.4) dividerat med genomsnittligt cytoplasmafluorescens 30 till 40 oextraherade celler (återigen se 4.2.4) . Det är viktigt att de extraherade och oextraherade celler framställs, färgas och avbildas parallellt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att bestämma andelen mRNA som är ER-associerat, COS-7-celler som transfekterats med plasmider som innehöll placenta alkaliskt fosfatas (ALPP) eller cytokrom P450-8B1 (CYP8B1) antingen extraherades med digitonin och fixerades därefter, eller direkt fästa (se figur 1, jämför "oextraherade Ctrl" till "Extracted Ctrl"). Den icke-nukleär fluorescens kvantifierades i båda proven och fraktionen av ER-associerad mRNA beräknas (Figur 2). Våra data visar tydligt att både ALPP och CYP8B1, är ungefär 60% av den cytoplasmatiska mRNA i samband med ER. Eftersom båda dessa mRNA kodar för proteiner som behandlas i ER-lumen, våra resultat överensstämmer med tanken att dessa mRNA översätts på ytan av ER.

För att övervaka ER-association av dessa transkript efter ribosomen dissociation transfekterade COS-7-celler var treated med kontroll medier, puromycin eller HHT i 30 min och extraherades sedan, fixeras och färgas med särskilda fisk sonder riktade mot varje mRNA (för representativa bilder se figur 1, för kvantifiering av ER-och kärn-associerade mRNA se figur 3). Observera att endast ALPP, och inte CYP8B1 mRNA upprätthålles på ER efter ribosomer demonteras med puromycin eller HHT (figurerna 2-3). Viktigt nivån av kärnkraft-mRNA inte växla mellan de olika sätt behandlade proven för antingen mRNA (Figur 3). Denna konstanta nukleära FISK indikerar att förändringarna i fluorescensintensitet i ER fraktionen inte beror på förändringar i mRNA-uttryck eller variationer i Fish färgning.

Från dessa resultat drar vi slutsatsen att en delmängd av ER-riktade mRNA, såsom ALPP transkriptet, bibehålls på ytan av denna organell efter ribosom demontering.

"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "alltid"> Figur 1
Figur 1. ALPP, men inte CYP8B1-mRNA är associerad med ER oberoende av ribosomer och översättning. Transfekterades med plasmider innehållande antingen ALPP (översta raden), eller CYP8B1 (nedersta raden) gener och får uttrycka mRNA för COS-7 celler 18-24 timmar. Cellerna behandlades sedan med DMSO-kontroll-medium ("Ctrl"), puromycin ("Puro") eller HHT under 30 min. Celler antingen direkt fast ("oextraherade") eller först utvinns sedan fast. Notera att medan kontroll-och HHT-behandlade celler extraherades med digitonin enbart, Puro-behandlade celler extraherades med digitonin och EDTA. Celler färgades för mRNA med användning av specifika prober FISH, och avbildas. Skala bar = 20 | im.

lways "> Figur 2
Figur 2. Kvantifiering av nivån av ER-förening för ALPP och CYP8B1-mRNA. Transfekterade COS-7 celler antingen direkt fastställas för att bestämma den totala halten av mRNA i cytoplasman (se figur 1, "oextraherade Ctrl"-celler) eller först ut och därefter fixeras för att bestämma mängden av ER-associerad mRNA (se figur 1, "Extracted Ctrl" celler). För varje experiment genomsnittliga ER-associerad fluorescens på 30-40 extraherade celler dividerat med genomsnittligt cytoplasmisk fluorescens på 30-40 oextraherade celler, för att ge fraktion av ER-bundet mRNA (y-axeln). Varje stapel representerar medelvärdet och standardfelet för tre oberoende experiment.

Figur 3
Figur 3. Kvantifiering av ER-assomanslutning av ALPP och CYP8B1-mRNA efter ribosomen dissociation. Transfekterade COS-7 celler behandlades med kontrollmedium eller olika hämmare översättning extraheras, fast, färgas för mRNA med särskilda fisk sonder och avbildas (se figur 1, "extraherade" celler). Fluorescensintensiteterna av mRNA i ER och kärnan kvantifierades. Varje stapel representerar medelvärdet och standardfelet för tre oberoende experiment, vart och ett består av den genomsnittliga integrerade intensiteten av 30 celler över bakgrunden och normaliserade till fluorescensen i ER av kontroll-behandlade celler (y-axeln). Observera att även om ribosomen störningar som orsakas CYP8B1 mRNA dissociera från ER, var nivåerna av kärn-mRNA opåverkad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lokaliseringen av mRNA till olika subcellulära ställen, genom samverkan mellan transkript med proteiner mRNA lokalisering, är ett utbrett fenomen viktigt för korrekt sortering av proteiner till slutdestinationen och för finjustering av genuttryck till de lokala kraven på en subcellulär regionen 19,20.

Med användning av analysen beskriven här, revisited vi frågan huruvida mRNA som kodar för sekretoriska proteiner kan bibehållas på ER i närvaro eller frånvaro av ribosomer eller translation. Faktiskt, fann vi att en delmängd av dessa mRNA har denna aktivitet 11. Till exempel, användning av denna extraktion protokoll, bestämde vi att både ALPP och CYP8B1 mRNA är lokaliserade på ytan av ER i kontroll behandlade COS-7-celler (figurerna 1-2). Emellertid, efter behandling av cellerna med översättning hämmare puromycin eller HHT, endast ALPP, men inte CYP8B1 mRNA,förblev associerad med ER i frånvaro av funktionella ribosomer och översättning (figurerna 1, 3). Dessutom fann vi tidigare att ALPP-mRNA är ER-samband i COS-7 celler som behandlats med pactamycin 11. Eftersom dessa olika behandlingar verkar genom olika mekanismer för att rensa mRNA associerade ribosomer, är det osannolikt att ER-sammanslutning av ALPP är resultatet av några indirekta cellulära svar på någon särskild drog. För att bekräfta att dessa översättning hämmare är effektiva, är det också användbart att testa om de inhiberar införlivandet av 35 S-metionin till nysyntetiserade proteiner. Till exempel, har vi funnit att MDMP-behandling (100 | iM, 15 min) endast kan inhibera 40-60% av alla proteinsyntes i COS-7-celler (XA Cui och AF Palazzo, opublicerade observationer). Som ett resultat, innebär detta läkemedel inte effektivt störa ER-lokalisering av mRNA som kräver översättning av deras inriktning och underhåll (XA Cui och AF Palazzo, opublicerade observationer).

För att ytterligare säkerställa att ER-inriktning av mRNA är inte beroende av kodad signalsekvens eller domäner transmembrandomäner, kan man ändra den exogena transkriptet så att den kodar för en cytoplasmaprotein. Faktiskt visade vi tidigare att en version av ALPP mRNA som saknar både signalsekvens och transmembran kodande regioner är fortfarande kunna lokalisera till ER 11.

Det är också värt att notera att den metod som presenteras här i kombination med andra analyser för att analysera mRNA nukleär export 21, kan användas för att definiera kinetiken och krav av mRNA transport från en avdelning till en annan (t.ex. från kärnan till ytan av ER). Faktiskt, genom microinjecting plasmider som innehåller ALPP genen i kärnan av COS-7-cell som förbehandlades med översättning inhibitorer, visade vi tidigare att nyligen gjorda ALPPmRNA riktas till ER oberoende av översättning eller ribosom-förening 11.

Även om vi inte till fullo förstår hur dessa mRNA är riktade och förankras till ER, är det troligt att denna organell innehåller mRNA-receptorer. Faktiskt vi nyligen identifierat P180, en stor positivt laddad membranbundna protein, som erfordras för förmåga ALPP mRNA upprätthålls på ER oberoende av översättning 11. Emellertid är det troligt att andra mRNA receptorer måste finnas närvarande på ytan av ER 11. Med hjälp av tekniken som beskrivs här, hoppas vi kunna identifiera och dissekera många av de molekylära mekanismer som hjälper till att reglera mRNA-lokalisering i däggdjursceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats med bidrag från National Science and Engineering Research Council of Canada till XAC och AFP

References

  1. Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).
  2. Walter, P., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).
  3. Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation. Cell. 71, 489-503 (1992).
  4. Grlich, D., Rapoport, T. A. Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane. Cell. 75, 615-630 (1993).
  5. Milcarek, C., Penman, S. Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes. J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).
  6. Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts. J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).
  7. Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver. J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).
  8. Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation. J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).
  9. Kruppa, J., Sabatini, D. D. Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes. J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).
  10. Adesnik, M., Maschio, F. Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes. Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).
  11. Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum. PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).
  12. Pestka, S. Inhibitors of ribosome functions. Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).
  13. Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine. Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).
  14. Weeks, D. P., Baxter, R. Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide. Biochemistry. 11, 3060-3064 (1972).
  15. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Cell. 147, 789-802 (2011).
  16. Lerner, R. S., et al. Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes. RNA. 9, 1123-1137 (2003).
  17. Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).
  18. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
  19. Lcuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  20. Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).
  21. Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection. J Vis Exp. 46, e2387 (2010).

Tags

Cellulär Biology biokemi genetik molekylärbiologi Genomics mRNA lokalisering RNA digitonin extraktion cell-fraktionering endoplasmatiskt retikulum sekretion mikroskopi bildbehandling fluorescerande FISH cellbiologi
Visualisering av endoplasmatiska nätverket Lokaliserade mRNA i däggdjursceller
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Cui, X. A., Palazzo, A. F.… More

Cui, X. A., Palazzo, A. F. Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (70), e50066, doi:10.3791/50066 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter