在哺乳动物细胞中的内质网定位的mRNA的可视化

Summary

在这里，我们描述了一种方法，可视化在哺乳动物组织培养细胞的内质网相关的mRNA。这项技术涉及的质膜的选择性通透性毛地黄皂苷以除去细胞质随后通过荧光的内容

Abstract

在真核生物中，大多数的信使RNA（mRNA），编码分泌蛋白和膜蛋白定位于内质网（ER）的表面。然而，这些mRNA的可视化可以是具有挑战性。这是特别真实的mRNA时，只有一小部分是内质网相关和非锁定目标（ 即 “免费”）成绩单阻碍该细胞器，它们的分布。为了监测ER-相关的mRNA，我们已经开发了一种方法，在该方法中，细胞被视为一个毛地黄皂苷萃取溶液，选择性permeabilizes质膜与短曝光，从而除去细胞质内容，同时保持该ER的完整性。再加上荧光原位杂交（FISH）此方法时，人们可以清楚地在荧光显微镜下观察雌激素受体 ​​结合的基因。使用该协议ER关联的程度，无论是散装的poly（A）成绩单或特定的基因可以评估甚至是量化的。在这个过程中，人们可以使用该测定调查的mRNA-雌激素受体的相互作用的性质。

Introduction

在真核生物中，mRNA编码分泌蛋白和膜蛋白可以有针对性地合作翻译ER信号识别颗粒^1,2和可维持的ER通过直接翻译核糖体和translocons在^3,4之间的相互作用。然而，无论是基因ER独立的核糖体或翻译时，可以有针对性和维护不清楚，直到最近。以往的研究试图解决翻译是否有独立的表达与ER使用细胞分离技术。因为要求苛刻的化学条件，以解除核糖体ER衍生的囊泡，它可能会破坏潜在的微妙的表达ER协会，这些研究没有定论，提供的证据^5-8，对^9,10锚定的mRNA的核糖体独立的ER 。

为了避免这些问题，我们已经开发出一种原山坳隔离和图像雌激素受体结合的基因。此过程涉及到一个温和的提取处理，从而有效地消除所有（包括非雌激素受体结合的基因）的细胞的细胞质内容，同时保留内质网的形态和其相关的分子。使用这个协议中，我们已经证明，一个子集的mRNAs的目标，然后保持在ER的核糖体或翻译¹¹独立。

Protocol

1。萃取材料的制备

1. 制备细胞
   1. 种子组织培养细胞对实验前至少一天的酸处理过的盖玻片。我们用COS-7或U2OS​​，这两个细胞系分泌的蛋白质，具有强大的生产，有一个良好定义的ER。请注意，以实现高的提取效率，细胞应不超过80％汇合的盖玻片上的实验当天。
   2. 如果一个特定的外源基因是被调查，细胞播种与使用标准转染协议感兴趣的含有该基因的质粒转染后一天。的细胞，然后使萃取前至少18小时的mRNA表达。
2. 转换酶抑制剂治疗的细胞
   1. 为了测试效果的ER基因与维护完整的核糖体，细胞是可以治疗的翻译抑制剂，破坏协会的核糖体与mRNA的^11。
   2. 抑制剂的翻译起始，如高三尖杉酯碱（HHT），pactamycin，或2 - （4 -甲基-2 ,6-dinitroanilino） - N-甲基丙酰胺（MDMP），防止与转录相关联的新的核糖体，同时允许从事核糖体完成翻译^12-14。由于大多数蛋白质在哺乳动物细胞中的翻译率是每秒5个氨基酸，不管密码子使用或mRNA长度为^15，在30分钟的处理应该清除核糖体关闭的消息的开放阅读框架，只要27000个核苷酸（编码的蛋白质只要为9000个氨基酸）。
   3. 嘌呤酶抑制剂，如促进过早排出的新生肽链，从而破坏核糖体^12。然而，为了完全破坏嘌呤霉素处理的核糖体与mRNA的关联，必须被添加到镁的螯合剂如EDTA，毛地黄皂苷提取缓冲液^11。
   <li>在本实验中，将细胞与200μM，嘌呤霉素，5μMHHT，或控制介质的前30分钟提取处理。
3. 毛地黄皂苷提取缓冲液的制备。可视化ER-本地化的mRNA无阻碍的自由（ 即细胞质，非ER相关的）成绩单，我们选择性地通透的细胞与毛地黄皂苷，甾体苷优先与3β-hydroxysterols的交互。在低浓度时，毛地黄皂苷选择性permeabilizes质膜的部分，导致'泄漏^'16。与此相反，在ER膜和核包络，这是差的胆固醇，被原封不动^16,17。
   1. 毛地黄皂苷（Sigma Aldrich公司）的粉末溶解于蒸馏水中，在5％重量/体积，此原液成小卷等分并存储在-20℃下根据我们的经验，多个冻结 - 解冻周期，降低溶解的毛地黄皂苷的效率。
   2. A股解决方案10倍的CHO缓冲液（1×工作溶液的浓度：115毫摩尔醋酸钾，pH为7.4的25mM HEPES，2.5毫摩尔MgCl _2，2mM的EGTA和150mM蔗糖）制备用无RNA酶的试剂，并储存于-20℃下的A工作液（1X CHO缓冲）是由无RNase水稀释的原液，可以存储在4°C

2。毛地黄皂苷的提取

1. 准备提取解决方案
   1. 平坦的表面上的加热块与被预加热至40℃并保持在此温度下提取期间。
   2. 以形成平坦的工作表面是无RNase，加热块蘸有一些水和重叠有一块新鲜的：石蜡，M（比米斯公司，Inc制造）。石蜡片和加热块之间的空气泡被平滑使用无RNase的手套和kimwipes（VWR）。
   3. 1倍的CHO缓冲液温热至37℃，通过在水浴中孵育。
   4. 6孔培养板用于洗修复的细胞。 3孔的每行被用于一个盖滑。到第一行中的两口井，2毫升温热的CHO缓冲液中的溶液。到最后一个孔中，添加2毫升的固定溶液（PBS + 4％多聚甲醛（电子显微镜版））。此托盘可以被存储在37℃培养箱中培养，直到细胞提取准备。
   5. 毛地黄皂苷的股票溶液稀释至0.025％，与温暖的CHO缓冲之前使用毛地黄皂苷提取溶液的制备方法。再次注意，嘌呤霉素处理的细胞中，在提取缓冲液必须另外含有的20mM EDTA，有效地破坏核糖体^11。紧接之前提取的提取溶液滴加入100μl置于加热块上的封口膜覆盖。
2. 毛地黄皂苷的提取和细胞固定
   1. 从37℃的培养箱中取出的细胞。
   2. 在提取过程中，盖玻片jewler的钳子的帮助操纵。同的钳子拿起盖玻片和蘸到的第一和第二阱含有CHO生长培养基中的缓冲液冲洗。
   3. 快速涂抹掉多余的缓冲关闭的背面侧与kimwipe盖玻片并立即放置盖玻片，细胞面朝下，对萃取溶液。
   4. 10秒后，拿起镊子盖玻片，立即转移，细胞的一面朝上，到含有4％的多聚甲醛固定缓冲。
   5. 让固定液中孵育样品在室温下至少15分钟。
3. 未提取的对照组细胞的制备。要确定总在细胞质中的mRNA的量，这是一个好主意，准备一个未提取的对照样品。
   1. 盖玻片上生长的细胞按上述方法制备的（见第2.2节），除此以外，毛地黄皂苷提取步骤（2.2.3）被跳过。
   2. 固定后，在PBS中萃取所述un-细胞需要透+ 0.1％的TritonX-100处理15分钟，在室温下。

3。 FISH染色

1. 设计探针的荧光原位杂交
   1. 使用预测RNA二级结构的软件，如RNAstructure 5.0 ¹⁸被折叠的一级序列的mRNA的兴趣。 mRNA的折叠部分的视觉评估，以确定为约50个核苷酸的区域是免费的，主要的二级结构。
   2. 这个区域的反向互补的合成与Alexa546的荧光基团连接到5'末端探针（购从综合DNA技术）。
   3. 探针用无RNA酶的水稀释至浓度为100μM，可以储存于-20℃下的股票
2. FISH探针染色
   1. 请注意，虽然毛地黄皂苷的提取的细胞不需要进一步的通透性，治疗这些固定的样品与2毫升0.1％的Triton X-100稀释的PBS FISH染色前在室温下的15分钟，有利于减少背景信号。
   2. 幻灯片，然后用PBS洗涤两次，以除去任何残余的多聚甲醛或Triton X-100。
   3. 1X柠檬酸钠缓冲液（150 mM NaCl和15mM柠檬酸钠）中的25％至60％的甲酰胺，然后将细胞洗涤两次。一般而言，对于特定的是50-60个核苷酸长度的FISH探针，使用60％甲酰胺，但的poly（A）mRNA的染色用寡聚（dT）FISH探针，甲酰胺的水平降低至25％。
   4. 为了制备染色室，一个150毫米的陪替氏培养皿的底部是与水覆盖和石蜡一块漂浮在水面上。菜翻过来的水被除去，从而允许石蜡膜附着的菜的底部。空气泡沫是手动删除kimwipes的。
   5. 对于每个盖玻片染色，移液管的票面上一个感兴趣的FISH探针的杂交溶液中的100微升下降的教育出版商染色室中。的股票FISH探针在杂交缓冲液（100毫克/毫升的硫酸葡聚糖，1×SSC，1毫克/毫升酵母tRNA，5mM的氧钒核糖核苷复合物，25-60％甲酰胺）与25％至60％甲酰胺的工作浓度的稀释0.2微米。请注意，甲酰胺的量应为所使用的特定的探针进行了优化，并是本SSC洗涤缓冲液中，在相同的浓度（见步骤3.3.3）。
   6. 盖玻片置于细胞侧面向下到FISH溶液染色室中，并保温5-24小时在37℃下在潮湿的腔室，例如组织培养孵化。
3. 染色样品的清洗和安装
   1. 以制备无RNase的洗净区域，放下的带状封口膜在一个水平的平坦的表面上，例如作为一个实验室工作台上。为了确保该封口膜是平的，湿的水平表面，在上面放置的封口膜，并手动删除kimwipes任何气泡。
   2. 染色室从培养箱中取出，并放置在平坦的水平面上。盖玻片，然后通过移液约500微升每个盖玻片的边缘附近的FISH洗涤缓冲液漂浮。该解决方案将绘制之间的玻片和封口膜通过毛细作用。
   3. 对于每个盖玻片，1毫升洗涤缓冲液（1×SCC用25-60％甲酰胺，请参阅步骤3.3.3）移液到洗涤区石蜡膜（见步骤3.4.1）。
   4. 使用镊子，盖玻片中除去从染色室，每个被放置到的洗涤缓冲液的下降，并在室温下孵育5分钟。洗涤过程重复3次。
   5. 载玻片上，用70％乙醇洗涤，，并干燥kimwipes。
   6. 对于每个盖玻片上，25μl的安装解决方案（DAPI Fluoromount G，Southern Biotech公司）吸取到幻灯片上。请注意，此溶液中含有4'，6 - 二脒-2 - 苯基吲哚（DAPI），有污渍的DNA的，并允许用于可视化的晶核。
   7. USI纳克的钳子和kimwipes，盖玻片的背面的被干燥并吸干过量的FISH洗涤缓冲液不干燥的情况下样品。每个细胞，然后放置盖玻片的一面朝下，到下降的安装解决方案。
   8. 安装的样本，然后标记，可以储存于4℃。

4。成像和定量

1. 成像
   1. 落射荧光显微镜用FISH染色后的细胞的图像。未转染细胞转染的细胞可以分化明亮的荧光信号，在适当的通道。理想的情况下，得到的各字段也将包含被用来确定用于定量的背景荧光的未转染细胞。
   2. 对于每个字段的鱼和DAPI通道的图像被收购。此外，如果将细胞染色与蛋白质标记，免疫荧光通道图像还收购。请注意，毛地黄皂苷的提取也可以用来可视化ER结合核糖体和蛋白质^11。
   3. 要确保的字段之间的荧光强度，可以进行比较，每个实验组，对每个通道的曝光时间应保持不变。
   4. 再次，以确保不同的盖玻片上的细胞的荧光强度之间可以进行比较，应尽量减少每天的日常变化的FISH信号衰减或epiluminescence强度的成像盖玻片在一个单一的会议。
2. 量化。要量化，本地化的ER的mRNA的量，我们使用Nikon NIS元的软件。然而，其他如图像分析软件ImageJ的都可以使用。
   1. 使用的Nikon NIS元的图像分析工具，小区外围的核心概括为单独的区域利益（投资回报率）。
   2. 对于每个感兴趣区域，荧光强度_（I T为总细胞强度_，I N为核强度）和区域_（A T _A N）记录和导出到Excel电子表格中。
   3. 对于每一个图像，背景荧光强度_（I B）是通过记录的非转染的细胞中的强度来确定。如果正在分析的poly（A）mRNA水平，无细胞的区域被选择。
   4. ER（在提取的细胞）的总量或细胞质（在未萃取的细胞）的荧光是通过以下公式计算：
      _[A T] _[I T - I _B] - [A _{N] [I} N - I _B]
   5. 核染色强度也可被计算，并用作各种治疗之间的内部控制。由于核的毛地黄皂苷治疗¹⁷或核糖体破坏¹¹不受影响，核mRNA的量应保持不变，每个这些处理之间。要计算核荧光使用下面的公式：
      [A _N] [I _N - IB]
   6. ％ER-针对性的细胞质中的mRNA可以计算出的平均ER荧光的30-40摘录细胞（见4.2.4）除以平均30-40未提取的细胞（再次见4.2.4细胞质荧光） 。这是至关重要的，所提取的和未萃取的细胞制备，染色和并行成像。

Representative Results

要确定的百分比是ER-相关的mRNA，COS-7细胞的转染质粒中的胎盘碱性磷酸酶（ALPP）或细胞色素P450-8B1（CYP8B1）要么用毛地黄皂苷，然后固定的，或直接固定（参见图1，比较“未萃取Ctrl”键“萃取Ctrl”键）。在两个样品中和ER-相关的mRNA表达的分数被计算出来（ 图2）进行定量的非核荧光。我们的数据清楚地表明，对于两个ALPP和CYP8B1，约60％的细胞质mRNA与ER相关联。由于两个这些mRNA在ER腔中被处理的蛋白质，编码，我们的结果是一致的想法，等的mRNA被翻译的雌激素受体的表面上。

要监视的这些记录ER-核糖体的解离后，转染COS-7细胞数与控制媒体，嘌呤霉素或HHT eated 30分钟，然后提取，使用针对每个mRNA（代表图像，参见图1，ER-和核相关的mRNA的定量分析，参见图3）的特定的FISH探针固定和染色。请注意，只有ALPP，而不是CYP8B1 mRNA的，被保持在ER核糖体后，与嘌呤霉素或HHT（ 图2-3）进行拆卸。重要的是，核mRNA表达水平的各种处理过的样品为任的mRNA（ 图3）之间没有改变。此常量核FISH信号表明在ER馏分荧光强度的变化是由于mRNA表达的改变或变化在FISH染色。

从这些结果，我们得出这样的结论：ER定位的mRNA，如的ALPP誊，被保持的一个子集的表面上后，该细胞器核糖体拆卸。

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图1。ALPP，但不是CYP8B1 mRNA的仍然独立地与ER的核糖体和翻译相关联。含有ALPP（顶行），或CYP8B1（底行）基因的质粒转染COS-7细胞，并使其表达的mRNA 18-24小时。然后将细胞与DMSO对照培养基（“Ctrl”键），嘌呤霉素（“普罗”）30分钟或HHT处理。细胞，无论是直接固定（“未萃取”）或先萃取再固定。请注意，而控制和HHT处理细胞，用毛地黄皂苷单独，普罗处理的细胞，提取用毛地黄皂苷和EDTA。细胞染色，使用特定的FISH探针的mRNA，并使之成像。比例尺= 20微米。

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图2。定量的ER-ALPP协会和CYP8B1 mRNA的水平。转染COS-7细胞，无论是直接固定在确定的总水平的mRNA在细胞质中（请参阅图1，“”未萃取Ctrl“键细胞）或先萃取，然后固定量来确定相关的ER-mRNA的表达（ 见图1，“Ctrl”键细胞提取）。对于每个实验，平均30-40提取细胞的ER-相关的荧光除以平均的细胞质30-40未萃取细胞的荧光，得到ER绑定的mRNA（y-轴 ）的馏分。每个条形表示三个独立实验的平均值和标准误差。

图3。量化ER-ASSOciation ALPP和CYP8B1 mRNA的核糖体解离后转染COS-7细胞治疗与控制介质或各种转换酶抑制剂，提取，固定，染色使用特定的FISH探针和成像（ 见图1，“提取”细胞）的mRNA。在ER和核基因的荧光强度进行量化。每个条形代表三个独立的实验中，各组成的背景和归一化到在ER中的控制处理的细胞的荧光（y-轴）上的30个细胞的平均积分强度的平均值和标准误差。需要注意的是，虽然解离急诊室的CYP8B1 mRNA的核糖体造成的混乱，核基因的水平并没有受到影响。

Discussion

不同的亚细胞位点的基因定位，通过转录本mRNA的定位蛋白的相互作用，是一种普遍现象的正确排序的蛋白质，以他们的最终目的地，微调基因表达的亚细胞地方规定区^19,20。

使用此处所描述的测定，我们重新编码分泌蛋白的mRNA的是否可以保持在ER中的或翻译的核糖体的存在或不存在的问题的。事实上，我们发现，这些基因的一个子集，有这样的活动^11。例如，使用该提取协议中，我们确定，这两个ALPP和CYP8B1 mRNA的定位控制处理的COS-7细胞（ 图1-2）中的雌激素受体 ​​的表面上。然而，处理后的细胞与翻译抑制剂嘌呤霉素或HHT，只ALPP，但不是CYP8B1的mRNA，仍然与ER中的情况下的功能的核糖体和翻译（ 图1，图3）相关联。此外，我们以前发现的，ALPP基因在COS-7细胞pactamycin ¹¹ ER-。由于这些不同的治疗行为，通过不同的机制来清除相关的核糖体mRNA的表达，这是不可能的ER协会ALPP任何特定的药物一些间接细胞反应的结果。要确认这些转换酶抑制剂是有效的，它也是有帮助的，以测试他们是否抑制成立^{35 S-}蛋氨酸新合成的蛋白质。例如，我们已经发现，MDMP处理（100μM，15分钟）在COS-7细胞中的所有蛋白质的合成（XA的崔和AF宫，未发表的观察）只能抑制40-60％。其结果是，这种药物并不能有效地扰乱本地化为他们的针对性和维护需要翻译的mRNA对ER-（的XA崔AF宫，未发表意见）。

为了进一步确保ER-定位的mRNA是不依赖于编码的信号序列或跨膜结构域，一个可以改变外源性转录物，它编码一个细胞质蛋白。事实上，我们先前表明，缺乏两个信号序列编码区和跨膜ALPP mRNA的版本仍然是能够本地化到ER ^11。

这也是值得注意的，这里介绍的方法结合用来分析mRNA的核出口^21的其他实验时，可以用来定义的mRNA运输的动力学和要求从一个室到另一个（ 例如从细胞核向的表面的ER）。事实上，通过显微注射质粒包含ALPP与翻译抑制剂进行预处理的COS-7细胞的细胞核基因导入，我们以前表明，新制成的ALPP基因是针对ER独立的翻译核糖体协会^11。

虽然我们并不完全了解这些基因是如何有针对性的和固定的ER，很可能是该细胞器基因受体。事实上，我们最近确定P180中，一个大的带正电荷的膜结合蛋白，作为所需的ALPP的mRNA的能力保持在ER独立的翻译^11。然而，它很可能是其他的mRNA受体的雌激素受体^​​11的表面上必须是本。借助该技术概述在这里，我们希望能找出和解剖的分子机制，有助于调节在哺乳动物细胞中的mRNA定位。