Visualisatie van endoplasmatisch reticulum gelokaliseerd mRNA's in zoogdiercellen

Summary

Hier beschrijven we een methode om endoplasmatisch reticulum-geassocieerde mRNA in zoogdiercellen visualiseren weefselcultuurcellen. Deze techniek omvat het selectieve permeabilisatie van het plasmamembraan met digitonine verwijderen cytoplasmatische inhoud gevolgd door fluorescent

Abstract

In eukaryoten meeste messenger RNA (mRNA) die coderen uitgescheiden en membraan eiwitten gelokaliseerd op het oppervlak van het endoplasmatisch reticulum (ER). Echter, de visualisatie van deze mRNA's een hele uitdaging. Dit geldt vooral wanneer slechts een fractie van de mRNA ER-geassocieerde en de distributie van dit organel wordt belemmerd door ongerichte (dwz "vrij") transcripten. Om ER-geassocieerde mRNA controleren, hebben wij een methode waarbij cellen worden behandeld met een korte blootstelling aan een digitonine extractieoplossing die selectief permeabilizes het plasmamembraan is waardoor het cytoplasmatische inhoud, terwijl ze tegelijkertijd de integriteit van de ER . Wanneer deze methode wordt gekoppeld met fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), kan men duidelijk zichtbaar ER gebonden mRNA's door fluorescentiemicroscopie. Met dit protocol de mate van ER-vereniging voor bulk poly (A) transcripts of specifieke mRNAs kan worden geëvalueerden zelfs gekwantificeerd. In het proces kan men gebruik maken van deze assay de aard van mRNA-ER interacties te onderzoeken.

Introduction

In eukaryoten mRNA codeert uitgescheiden en membraaneiwitten kunnen worden gericht op de ER co-translationeel de signaalherkenning deeltje ^1,2 en kan worden gehandhaafd op het ER via de directe interacties tussen ribosomen en translocons tijdens de vertaling ^3,4. Maar of mRNA's kan worden gericht en onderhouden op de ER onafhankelijk van een van beide ribosomen of vertaling is niet duidelijk tot voor kort. Eerdere studies geprobeerd om aan te pakken of er sprake is translatie-onafhankelijke mRNA samenwerking met de ER met behulp van cellulaire fractionering technieken. Omdat agressieve chemische omstandigheden moesten ribosomen distantiëren van ER afgeleid blaasjes, die zouden kunnen verstoren de potentieel gevoelige mRNA-ER vereniging, deze studies waren niet overtuigend, waaruit blijkt voor ^5-8 en tegen ^9,10 ribosomaal-onafhankelijke verankering van mRNA naar de ER .

Om deze problemen te omzeilen hebben wij een protocol te isoleren en beeld ER-gebonden mRNA's. Deze procedure omvat een mild extractiebehandeling, die effectief verwijdert alle cytoplasmatische inhoud van de cel (inclusief niet-ER gebonden mRNAs) tegelijkertijd behoud van de morfologie ER en alle geassocieerde moleculen. Met dit protocol hebben we aangetoond dat een subset van mRNA gericht en onderhouden op ER onafhankelijk van ribosomen of translatie ^11.

Protocol

1. Voorbereiding van Materialen voor Extraction

1. Bereiding van Cellen
   1. Seed weefselkweekcellen on zuurbehandelde coverslips ten minste een dag voor het experiment. Wij gebruiken COS-7 of U2OS, als deze twee cellijnen vertonen sterke productie van uitgescheiden eiwit en hebben een goed gedefinieerde ER. Merk op dat een hoge extractie efficiëntie, cellen niet zouden 80% confluentie op het dekglaasje op de dag van het experiment overschrijden.
   2. Als een bepaalde exogene mRNA wordt onderzocht, worden de cellen getransfecteerd een dag na enten met plasmiden die het gen van interesse met behulp van standaard transfectie protocollen. De cellen worden vervolgens toegestaan ​​om de mRNA ten minste 18 uur vóór extractie drukken.
2. Het behandelen van de Cellen met Translation Remmers
   1. Om het effect van intact ribosomen op het onderhoud van mRNAs associatie met de ER testen, kunnen cellen worden behandeld met translatie inhibitoren die de associatie verstorenribosomen van de mRNA ^11.
   2. Remmers van translatie-initiatie, zoals homoharringtonin (HHT), pactamycin of 2 - (4-methyl-2 ,6-dinitroanilino) - N-methylpropionamide (MDMP) voorkomen nieuwe ribosomen associëren met het transcript tegelijkertijd mogelijk betrokken op ribosomen volledige vertaling ^12-14. Aangezien de vertaaltarief voor de meeste eiwitten in zoogdiercellen is 5 aminozuren per seconde, ongeacht codongebruik of mRNA lengte ¹⁵ dient een behandeling van 30 min duidelijk ribosomen off van berichten met open reading frames zolang 27000 nucleotiden (die coderen voor eiwitten Zolang 9.000 aminozuren).
   3. Remmers, zoals puromycine bevorderen de voortijdige uitwerpen van de ontluikende keten en dus verstoren polysomen ^12. Echter volledig de associatie van puromycine behandeld ribosomen met mRNA verstoren, moet magnesium chelatoren zoals EDTA worden toegevoegd aan de digitonine extractiebuffer ^11.
   <li> In dit experiment worden cellen behandeld met 200 uM puromycine, 5 uM HHT of control medium gedurende 30 min voor extractie.
3. Voorbereiding van digitonine extractiebuffer. Om ER-gelokaliseerde mRNA's te visualiseren zonder de belemmering van de vrije (dwz cytoplasmatische, niet-ER-geassocieerde) transcripten, we selectief doorlaatbaar de cel met digitonine, een steroïde glycoside dat bij voorkeur interageert met 3β-hydroxysterols. Bij lage concentraties, digitonine permeabilizes selectief delen van het plasmamembraan, waardoor 'lekkage' ^16. Daarentegen zijn de ER membraan en nucleaire envelop, die arm in cholesterol, intact ^16,17.
   1. Digitonine (Sigma Aldrich) poeder wordt opgelost in gedestilleerd water bij 5% gewicht / volume en deze voorraadoplossing wordt verdeeld in kleine volumes en opgeslagen in de -20 ° C. In onze ervaring meerdere vries-ontdooi cycli vermindert de efficiency van opgeloste digitonine.
   2. Een voorraadoplossing van10x CHO buffer (1x werkoplossing concentratie: 115 mM KAC, 25 mM HEPES pH 7,4, 2,5 mM MgCl2, ₂ mM EGTA en 150 mM sucrose) wordt bereid met RNase-vrije reagentia en opgeslagen bij -20 ° C. Een werkoplossing (1x CHO buffer) wordt bereid door verdunning van de oplossing met RNase-vrij water en kan worden opgeslagen bij 4 ° C.

2. Digitonine Extractie

1. Voorbereiden Extraction Solutions
   1. Een verwarmingsblok met een vlak oppervlak voorverwarmd tot 40 ° C en op deze temperatuur gedurende de extractie.
   2. Om een ​​vlak werkoppervlak dat RNase vrij te vormen, wordt de verwarming blok bevochtigd met wat water en bedekt met een vers stukje Parafilm M (Bemis Company, Inc). Luchtbellen tussen de parafilm vel en verwarming blok worden gladgestreken met RNase-vrij handschoenen en kimwipes (VWR).
   3. 1x CHO buffer wordt opgewarmd tot 37 ° C door incubatie in een waterbad.
   4. 6-well platen worden gebruikt om wassenen bevestig de cellen. Elke rij 3 putten wordt gebruikt voor een cover-slip. Om de eerste twee putten in de rij, wordt 2 ml van een warmgelopen CHO-buffer toegevoegd. De laatste put, 2 ml van het fixatie-oplossing (PBS + 4% paraformaldehyde (Electron Microscope Sciences)) toegevoegd. Deze cassette kan worden opgeslagen in de 37 ° C incubator totdat de cellen klaar zijn voor extractie.
   5. Digitonine extractie-oplossing wordt bereid door verdunning van de oplossing digitonine 0,025% met warm CHO buffer vlak voor gebruik. Ook hier is voor puromycine-behandelde cellen was de extractiebuffer aanvullend moet 20 mM EDTA bevatten efficiënt verstoren ribosomen ^11. Dalingen van 100 pl van de extractie-oplossing worden op de parafilm bedekte verwarmingsblok onmiddellijk voor extractie.
2. Digitonine Extractie en Cell Fixation
   1. Verwijder de cellen van de 37 ° C incubator.
   2. Tijdens de extractie worden dekglaasjes gemanipuleerd met behulp van de forceps jewler. Metde tang pak de dekglaasje en dompel het in de eerste en vervolgens de tweede putje met CHO buffer te wassen van het groeimedium.
   3. Snel blot overtollige buffer van de achterkant van het dekglaasje met een Kimwipe en meteen overgaan tot het dekglaasje, cel naar beneden, op de extractie-oplossing.
   4. Na 10 sec, pak de dekglaasje met de tang en onmiddellijk overdragen, cel zijde naar boven, naar de put met de 4% paraformaldehyde bevestiging buffer.
   5. Laat het monster in fixeermiddel incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
3. Bereiding van controle cellen uitgepakte. Om de totale hoeveelheid mRNA in het cytoplasma is het een goed idee om een ​​uitgepakte controlemonster te bereiden bepalen.
   1. Cellen gekweekt op dekglaasjes worden bereid zoals hierboven (zie paragraaf 2.2), behalve dat de digitonine extractiestap (2.2.3) wordt overgeslagen.
   2. Na fixatie, de niet-geëxtraheerde cellen moeten worden gepermeabiliseerde in PBS + 0,1% TritonX-100 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

3. FISH Staining

1. Ontwerpen van probes voor fluorescentie in situ hybridisatie
   1. De primaire sequentie van het mRNA van interesse wordt gevouwen met RNA secundaire structuur voorspelling software zoals RNAstructure 5,0 ^18. De mRNA vouwen visuele beoordeling van een gebied van ongeveer 50 nucleotiden die geen grote secundaire structuren te identificeren.
   2. Het omgekeerde complement van dit gebied wordt gesynthetiseerd met Alexa546 fluorofoor aan het 5'-uiteinde van de probe (verkregen van Integrated DNA Technologies).
   3. De probe wordt verdund met RNase-vrij water tot een voorraad concentratie van 100 uM kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.
2. Kleuring met FISH probes
   1. Merk op dat hoewel de digitonine geëxtraheerd cellen geen verdere permeabilisatie deze gefixeerde monsters behandeling met 2 ml van 0,1% Triton X-100 in verdundPBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur vóór FISH kleuring en vermindert het achtergrondsignaal.
   2. De slides worden vervolgens tweemaal gewassen met PBS om resten paraformaldehyde of Triton X-100 te verwijderen.
   3. De cellen worden vervolgens tweemaal gewassen met 25% tot 60% formamide in 1X natriumcitraatbuffer (150 mM NaCl en 15 mM natriumcitraat). Algemeen, specifieke FISH probes die 50-60 nucleotiden lang, 60% formamide gebruikt, maar voor poly (A) mRNA kleuring met oligo (dT) FISH probe, het niveau van formamide verlaagd tot 25%.
   4. De kleuring kamer bereiden, wordt de bodem van een 150 mm petrischaal die met water en een stuk parafilm wordt dreef op het water. Het water wordt verwijderd door de schaal op, waardoor de parafilm te houden aan de bodem van de schaal. Luchtbellen worden handmatig verwijderd met kimwipes.
   5. Voor elke dekglaasje te worden gemerkt en pipetteer een 100 ul druppel van de hybridisatie oplossing die FISH probe van belang op de parafilm in de kamer kleuring. De stock FISH probe wordt verdund met 25% tot 60% formamide in hybridisatiebuffer (1x SSC, 100 mg / ml dextran sulfaat, 1 mg / ml gist tRNA, 5 mM vanadyl riboside complex, 25-60% formamide) tot een werkconcentratie van 0,2 uM. Merk op dat de hoeveelheid formamide worden geoptimaliseerd voor de specifieke probe wordt gebruikt en aanwezig is in dezelfde concentratie als in de SSC wasbuffer (zie stap 3.3.3).
   6. Het dekglaasje geplaatst cel naar beneden op de FISH oplossing in de kamer kleuring en gedurende 5-24 uur bij 37 ° C in een bevochtigde kamer zoals weefselkweekincubator.
3. Wassen en het monteren van de gebrandschilderde monsters
   1. Om een ​​RNase vrij wasruimte voor te bereiden, voorzien in een strook van parafilm op een vlakke ondergrond, zoals een lab bank. Om ervoor te zorgen dat de parafilm is nat, laag het vlakke ondergrond, plaats de parafilm op de top en handmatig eventuele luchtbellen te verwijderen met kimwipes.
   2. De kamer is kleuringverwijderd uit de incubator en geplaatst op een vlakke ondergrond. De dekglaasjes worden vervolgens gedreven door pipetteren ongeveer 500 ui wasbuffer FISH de rand van elke dekglaasje. De oplossing zal worden opgesteld in-tussen het dekglaasje en de parafilm via capillaire werking.
   3. Voor elke dekglaasje, wordt 1 ml wasbuffer (1x SCC met 25-60% formamide, zie stap 3.3.3) gepipetteerd op de wasplaats parafilm (zie stap 3.4.1).
   4. Behulp van een tang worden de dekglaasjes verwijderd uit de kamer en elke kleuring is geplaatst op de druppel wasbuffer en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Het wasproces wordt 3 keer herhaald.
   5. Objectglaasjes worden gewassen met 70% ethanol en gedroogd met kimwipes.
   6. Voor elke dekglaasje, wordt 25 ul van de montage-oplossing (DAPI Fluoromount G, Zuid-Biotech) gepipetteerd op de dia. Merk op dat deze oplossing 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), dat vlekken DNA bevat en maakt visualisatie van de kernen.
   7. Using forceps en kimwipes, kan de achterzijde van het dekglaasje gedroogd en dan FISH wasbuffer wordt uitgewist uit het monster zonder drogen. Elke dekglaasje wordt dan geplaatst cel kant naar beneden, op de daling van de montage-oplossing.
   8. Hout monsters worden vervolgens geëtiketteerd en opslag bij 4 ° C.

4. Imaging en kwantificering

1. Imaging
   1. Een epifluorescentiemicroscoop wordt gebruikt om het imago van de cellen na FISH kleuring. De getransfecteerde cellen kunnen worden onderscheiden van niet-getransfecteerde cellen door heldere fluorescentiesignaal in het juiste kanaal. Idealiter zal elk verkregen gebied bevatten ook een getransfecteerde cel worden gebruikt om de achtergrond fluorescentie voor kwantificering bepalen.
   2. Voor elk veld beelden van de FISH en DAPI kanaal worden verworven. Bovendien, als de cellen gekleurd met co-proteïne markers wordt een beeld van de immunofluorescentie kanaal verworven. Merk op dat digitonine extractie ook kan worden gebruiktER gebonden ribosomen en eiwitten ¹¹ visualiseren.
   3. Dat de fluorescentie-intensiteiten tussen velden worden vergeleken, moeten de belichtingstijd voor elk kanaal constant voor elke set experiment.
   4. Weer dat de fluorescerende intensiteit van cellen op verschillende coverslips kunnen worden vergeleken, moeten de dag-tot-dag veranderingen in intensiteit of epiluminescence verval in de FISH signaal geminimaliseerd door beeldvorming alle dekglaasjes in een keer.
2. Kwantificering. Om de hoeveelheid mRNA dat is gelokaliseerd op de ER kwantificeren gebruiken we Nikon NIS Element software. Echter andere beeldanalyse software zoals ImageJ worden gebruikt.
   1. Met behulp van de Nikon NOS ELEMENT beeld analyse-instrument, zijn de cel periferie en de kern geschetst als aparte regio van belangen (ROI).
   2. Voor elk ROI, de fluorescentie-intensiteit (I _T de totale cel en intensiteit I _N denucleaire intensiteit) en het gebied (A _T en A _N) worden geregistreerd en geëxporteerd naar een Excel-spreadsheet.
   3. Voor elk beeld wordt de achtergrond fluorescentie-intensiteit (I _B) bepaald door het registreren van de intensiteit van een niet-getransfecteerde cellen. Als poly (A) mRNA niveaus worden geanalyseerd, wordt een celvrij gebied geselecteerd.
   4. De totale hoeveelheid ER (in geëxtraheerde cellen) of cytoplasmatische (in uitgepakte cellen) fluorescentie wordt berekend volgens de formule:
      [A _T] [I _T - I _B] - [A _N] [I _N - I _B]
   5. De nucleaire kleurintensiteit kan ook worden berekend en gebruikt als controle tussen verschillende behandelingen. Omdat kernen worden niet beïnvloed door digitonine behandeling ¹⁷ of ribosoom verstoring ^11, moet het bedrag van de nucleaire mRNA constant blijven tussen elk van deze behandelingen. Om de nucleaire fluorescentie wordt de volgende formule gebruikt te berekenen:
      [A _N] [I _N - IB]
   6. Het percentage cytoplasmatische mRNA dat ER gerichte kan worden berekend door de gemiddelde fluorescentie ER van 30-40 geëxtraheerd cellen (zie 4.2.4) gedeeld door de gemiddelde fluorescentie cytoplasmatische 30-40 uitgepakte cellen (zie opnieuw 4.2.4) . Het is essentieel dat de gewonnen en uitgepakte cellen worden bereid, gekleurd en afgebeeld in parallel.

Representative Results

Het percentage mRNA dat ER-geassocieerde, COS-7-cellen die waren getransfecteerd met plasmiden die de placentaire alkalische fosfatase (ALPP) of cytochroom P450-8B1 (CYP8B1) ofwel werden geëxtraheerd met digitonine en vervolgens gefixeerd of direct bevestigd die vast (zie figuur 1, vergelijk "uitgepakte Ctrl" naar "extractie Ctrl"). De niet-nucleaire fluorescentie werd gekwantificeerd in beide monsters en de fractie van ER-geassocieerde mRNA werd berekend (Figuur 2). De gegevens maken duidelijk dat zowel ALPP en CYP8B1, ongeveer 60% van de cytoplasma mRNA wordt geassocieerd met de ER. Aangezien beide mRNA's coderen voor eiwitten die worden verwerkt in het ER-lumen, onze resultaten zijn consistent met het idee dat dergelijke mRNA's worden omgezet op het oppervlak van het ER.

Om de ER-associatie van deze transcripts na ribosoom dissociatie, getransfecteerd COS-7-cellen te controleren waren treated met controle media, puromycine of HHT gedurende 30 min geëxtraheerd, gefixeerd en gekleurd met specifieke FISH probes gericht tegen elk mRNA (voor representatieve beelden zie figuur 1, voor het kwantificeren van ER-en nucleaire-geassocieerde mRNA zie figuur 3). Merk op dat alleen ALPP, en niet CYP8B1 mRNA, wordt bijgehouden op de ER na ribosomen worden gedemonteerd met puromycine of HHT (figuren 2-3). Belangrijk de nucleaire mRNA niet veranderen tussen de verschillend behandelde monsters voor zowel mRNA (Figuur 3). Deze constante nucleaire FISH signaal geeft aan dat de veranderingen in de fluorescentie-intensiteit in de ER fractie niet zijn als gevolg van veranderingen in mRNA expressie of variaties in de FISH kleuring.

Uit deze resultaten concluderen we dat een subset van ER-gerichte mRNAs, zoals ALPP transcript, blijft op het oppervlak van dit organel na demontage ribosoom.

"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "always">
Figuur 1. ALPP, maar niet CYP8B1 mRNA geassocieerd blijft met de ER onafhankelijk van ribosomen en translatie. COS-7 cellen werden getransfecteerd met plasmiden die ofwel de ALPP (bovenste rij) of CYP8B1 (onderste rij) genen en mogen mRNA uit voor 18-24 uur. De cellen werden vervolgens behandeld met DMSO control medium ("CTRL"), puromycine ("Puro") of HHT gedurende 30 minuten. Cellen werden ofwel direct vastgesteld ("uitgepakte") of eerste geëxtraheerd vastgesteld. Merk op dat terwijl de controle-en HHT-behandelde cellen werden geëxtraheerd met digitonine alleen Puro-behandelde cellen werden geëxtraheerd met digitonine en EDTA. Cellen werden gekleurd voor gebruik van specifieke mRNA FISH probes, en afgebeeld. Scale bar = 20 urn.

ltijd ">
Figuur 2. Kwantificering van het niveau van ER-vereniging ALPP en CYP8B1 mRNA. Getransfecteerde COS-7 cellen werden ofwel rechtstreeks op het totale niveau van mRNA in het cytoplasma (zie figuur 1, "uitgepakte Ctrl" cellen) te bepalen of eerst geëxtraheerd en vervolgens gefixeerd de hoeveelheid ER-geassocieerde mRNA (zie figuur 1, "extractie Ctrl" cellen) te bepalen. Voor elk experiment het gemiddelde ER-geassocieerde fluorescentie van 30-40 geëxtraheerd cellen werd gedeeld door de gemiddelde fluorescentie van 30-40 cytoplasmatische uitgepakte cellen, de fractie van ER gebonden mRNA (y-as) te geven. Elke staaf vertegenwoordigt de gemiddelde waarde en standaardafwijking van drie onafhankelijke experimenten.

Figuur 3. Kwantificering van de ER-vereniciation van ALPP en CYP8B1 mRNA ribosoom na dissociatie. Getransfecteerde COS-7 cellen werden behandeld met controle medium of verschillende vertaling remmers, geëxtraheerd, vaste, gekleurd voor mRNA met specifieke probes FISH en afgebeeld (zie figuur 1, "geëxtraheerd" cellen). De fluorescentie-intensiteiten van mRNA in het ER en kern gekwantificeerd. Elke staaf vertegenwoordigt het gemiddelde en standaardfout van drie onafhankelijke experimenten, elk bestaande uit het gemiddelde geïntegreerde intensiteit van 30 cellen op achtergrond en genormaliseerd naar de fluorescentie in het ER van controle-behandelde cellen (y-as). Merk op dat hoewel ribosoom verstoring CYP8B1 mRNA om zich te distantiëren van de ER, het niveau van nucleaire mRNA niet beïnvloed werden.

Discussion

De lokalisatie van mRNAs verschillende subcellulaire locaties, door de interactie van mRNA transcripten met lokalisatie eiwitten, is een veel voorkomend verschijnsel belangrijk voor de juiste sortering van eiwitten naar hun eindbestemming, en voor de fijnafstelling van genexpressie aan de plaatselijke eisen van een subcellulaire regio ^19,20.

Met de assay hier beschreven we opnieuw de vraag of mRNA's die coderen voor secretie eiwitten kan worden gehandhaafd op de ER in de aanwezigheid of afwezigheid van ribosomen of translatie. Inderdaad vonden we dat een subset van deze mRNAs deze activiteit ¹¹ hebben. Bijvoorbeeld met deze extractie protocol, we vastgesteld dat zowel ALPP en CYP8B1 mRNA's gelokaliseerd op het oppervlak van de ER in controle behandelde COS-7 cellen (figuren 1-2). Echter, na behandeling van de cellen met remmers vertaling puromycine of HHT slechts ALPP, maar niet CYP8B1 mRNA,verbonden bleven met de ER in de afwezigheid van functionele ribosomen en translatie (figuren 1, 3). Daarnaast hebben eerder gevonden dat ALPP mRNA blijft ER-geassocieerde in COS-7 cellen behandeld met pactamycin ^11. Aangezien deze verschillende behandelingen optreden via uiteenlopende mechanismen mRNA geassocieerde ribosomen verwijderen, is het onwaarschijnlijk dat de ER-associatie van ALPP is het resultaat van een indirect cellulaire reactie op een bepaald geneesmiddel. Bevestigen dat deze vertaling remmers effectief zijn, is het ook nuttig om te testen of ze de opname ^van 35S-methionine in nieuw gesynthetiseerde eiwitten te remmen. Zo hebben wij gevonden dat MDMP behandeling (100 uM, 15 min) slechts 40-60% van eiwitsynthese in COS-7 cellen (XA Cui en AF Palazzo ongepubliceerde waarnemingen) remmen. Daardoor is deze drug niet efficiënt verstoren ER-lokalisatie van mRNAs die vertaald dienen voor hun targeting en onderhoud (XA Cui en AF Palazzo, ongepubliceerde observaties).

Erop toezien dat ER-targeting van het mRNA niet afhankelijk gecodeerde signaalsequentie of transmembraandomeinen kan men wijzigen de exogene transcript zodat het codeert voor een cytoplasmatisch eiwit. Inderdaad we eerder aangetoond dat een versie van de ALPP mRNA dat zowel signaalsequentie en transmembraan coderende gebieden ontbreekt nog kan lokaliseren de ER ^11.

Het is ook opgemerkt dat de hier voorgestelde methode in combinatie met andere assays gebruikt om mRNA nucleaire export ²¹ analyseren, kunnen worden gebruikt om de kinetiek en eisen van mRNA transport bepalen van het ene compartiment naar het andere (bijv. van de kern naar het oppervlak van de ER). Door immers microinjecting plasmiden die het gen bevatten ALPP in de kernen van COS-7 cellen die werden voorbehandeld met vertaling remmers we eerder aangetoond dat nieuw gemaakte ALPPmRNA's gericht op de ER onafhankelijk van vertaal-of ribosoom-associatie ^11.

Hoewel we niet volledig begrijpen hoe deze mRNA's zijn gericht en verankerd aan de ER, is het waarschijnlijk dat dit organel mRNA-receptoren bevat. Inderdaad we recent geïdentificeerde p180, een groot positief geladen membraan-gebonden eiwit, als noodzakelijk voor het vermogen van ALPP mRNA te handhaven op de ER onafhankelijk van translatie ^11. Het is echter waarschijnlijk dat andere mRNA receptoren aanwezig zijn op het oppervlak van de ER ^11. Met de hulp van de techniek die hier geschetst, hopen we te identificeren en ontleden veel van de moleculaire mechanismen die helpen reguleren mRNA lokalisatie in zoogdiercellen.