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Biology

स्तनधारी कोशिकाओं में endoplasmic जालिका स्थानीयकृत mRNAs का विज़ुअलाइज़ेशन

Published: December 17, 2012 doi: 10.3791/50066
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry, University of Toronto

Summary

यहाँ हम एक स्तनधारी टिशू कल्चर कोशिकाओं में endoplasmic जालिका जुड़े mRNAs कल्पना विधि का वर्णन है. यह तकनीक digitonin के साथ प्लाज्मा झिल्ली की चयनात्मक permeabilization शामिल cytoplasmic फ्लोरोसेंट द्वारा पीछा सामग्री हटाने

Abstract

Eukaryotes में, दूत (mRNAs) RNAs कि secreted और झिल्ली प्रोटीन endoplasmic जालिका (ईआर) की सतह स्थानीयकृत हैं सांकेतिक शब्दों में बदलना के अधिकांश. हालांकि, इन mRNAs के दृश्य चुनौतीपूर्ण हो सकता है. यह विशेष रूप से सच है जब mRNA की केवल एक अंश ईआर से जुड़े है और उनके इस organelle से वितरण गैर लक्षित टेप (यानी "मुक्त") द्वारा बाधित है. आदेश में ईआर जुड़े mRNAs पर नजर रखने के लिए, हम एक विधि है जो कोशिकाओं में एक digitonin निष्कर्षण समाधान है कि चुनिंदा प्लाज्मा झिल्ली permeabilizes एक कम जोखिम के साथ व्यवहार कर रहे हैं विकसित किया है, और इस प्रकार cytoplasmic सामग्री को हटा है, जबकि एक साथ ईआर की अखंडता को बनाए रखने . जब इस विधि स्वस्थानी संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट के साथ मिलकर किया है, एक स्पष्ट रूप से फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा ईआर बाध्य mRNAs कल्पना कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग या तो थोक पाली (A) टेप या विशिष्ट mRNAs ईआर एसोसिएशन की डिग्री मूल्यांकन किया जा सकता हैऔर भी मात्रा. इस प्रक्रिया में एक इस परख का उपयोग के mRNA ईआर बातचीत की प्रकृति की जांच कर सकते हैं.

Introduction

Eukaryotes में, mRNA एन्कोडिंग secreted और झिल्ली प्रोटीन संकेत मान्यता कण 1,2 सह translationally ईआर लक्षित किया जा सकता है और 3,4 अनुवाद के दौरान ribosomes और translocons के बीच प्रत्यक्ष बातचीत के माध्यम से ईआर पर बनाए रखा जा सकता है. बहरहाल, चाहे mRNAs और लक्षित किया जा सकता है या तो ribosomes या अनुवाद की ईआर स्वतंत्र पर बनाए रखा बहुत हाल ही में जब तक स्पष्ट नहीं था. पिछले अध्ययनों से पता करने का प्रयास करने के लिए पता है कि वहाँ अनुवाद स्वतंत्र ईआर सेलुलर fractionation तकनीक का उपयोग करने के साथ mRNA संघ है. क्योंकि रासायनिक कठोर शर्तों ईआर प्राप्त vesicles, है जो संभावित नाजुक mRNA ईआर संघ को बाधित हो सकता है से राइबोसोम को अलग करने के लिए आवश्यक थे, इन अध्ययनों अनिर्णायक थे, 5-8 के लिए साक्ष्य उपलब्ध कराने और 9,10 के खिलाफ ribosomal स्वतंत्र mRNA की ईआर प्रस्तोता .

इन समस्याओं को दरकिनार करने के लिए हम एक आद्य विकसित किया हैकर्नल को अलग करने के लिए और ईआर mRNAs बाध्य छवि. इस प्रक्रिया में एक हल्के निष्कर्षण इलाज है, जो प्रभावी रूप से सेल (गैर ईआर ही mRNAs सहित) के सभी cytoplasmic सामग्री को हटा जबकि एक साथ ईआर morphology और उसके जुड़े अणुओं के सभी के संरक्षण शामिल है. हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर दिखा दिया है कि mRNAs की एक सबसेट लक्षित कर रहे हैं और फिर स्वतंत्र रूप से ribosomes या अनुवाद 11 ईआर पर बनाए रखा.

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Protocol

1. निकासी के लिए सामग्री तैयार

  1. कक्षों की तैयारी
    1. कम से कम एक दिन के लिए बीज के ऊतकों एसिड इलाज coverslips पर संस्कृति कोशिकाओं को प्रयोग करने के लिए पहले. हम COS-7 या U2OS का उपयोग करते हैं, के रूप में इन दो सेल लाइनों secreted प्रोटीन के उत्पादन मजबूत प्रदर्शन और एक अच्छी तरह से परिभाषित ईआर. नोट है कि करने के लिए उच्च निष्कर्षण दक्षता हासिल करने के लिए, कोशिकाओं को प्रयोग के दिन पर coverslip पर 80 confluency% से अधिक नहीं होनी चाहिए.
    2. यदि एक विशेष exogenous mRNA एक दिन की जांच की जा रही है, कोशिकाओं मानक अभिकर्मक प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए ब्याज की जीन युक्त plasmids साथ बोने के बाद ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं. कोशिकाओं तो कम से कम 18 घंटे के लिए mRNA निष्कर्षण के लिए पहले से व्यक्त करने के लिए अनुमति दी जाती है.
  2. अनुवाद Inhibitors के साथ कोशिकाओं के इलाज
    1. ईआर साथ mRNAs एसोसिएशन के रखरखाव पर बरकरार राइबोसोम के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, कोशिकाओं अनुवाद inhibitors है कि संघ को बाधित के साथ इलाज किया जा सकता है11 mRNA साथ ribosomes की.
    2. (4 - मिथाइल-2 ,6-dinitroanilino) - (HHT) homoharringtonin, pactamycin, या 2 के रूप में अनुवाद दीक्षा के Inhibitors, एन methylpropionamide (MDMP), प्रतिलिपि के साथ जोड़ से नई ribosomes रोकने के लिए जब एक साथ करने के लिए लगी हुई राइबोसोम की अनुमति 12-14 अनुवाद पूरा करें. चूंकि स्तनधारी कोशिकाओं में सबसे अधिक प्रोटीन के लिए अनुवाद की दर प्रति सेकंड 5 अमीनो एसिड, चाहे कोडोन उपयोग या की mRNA 15 लंबाई, 30 मिनट की एक इलाज ribosomes स्पष्ट संदेशों की चाहिए खुला पढ़ने फ्रेम के साथ 27,000 nucleotides (प्रोटीन के लिए कोडिंग के रूप में लंबे समय के रूप में के रूप में 9,000 अमीनो एसिड के रूप में लंबे समय).
    3. ऐसे puromycin रूप Inhibitors नवजात श्रृंखला के समय से पहले इंजेक्शन को बढ़ावा देने के लिए और इस प्रकार 12 polysomes को बाधित. हालांकि पूरी तरह से mRNA साथ puromycin इलाज ribosomes की संघ को बाधित करने के लिए, EDTA के रूप में मैग्नीशियम chelators निष्कर्षण digitonin 11 बफर जोड़ा जाना चाहिए.
      4. <li> इस प्रयोग में, कोशिकाओं, 200 सुक्ष्ममापी puromycin 5 सुक्ष्ममापी HHT, नियंत्रण या निकासी के लिए पहले 30 मिनट के लिए मध्यम के साथ व्यवहार कर रहे हैं.
  3. Digitonin निष्कर्षण बफर की तैयारी. मुफ्त (यानी cytoplasmic, गैर ईआर से जुड़े) टेप की रुकावट के बिना ईआर स्थानीय mRNAs कल्पना के लिए, हम चुनिंदा digitonin, एक स्टेरॉयड ग्लाइकोसाइड कि 3β - hydroxysterols साथ preferentially सूचना का आदान प्रदान के साथ सेल permeabilize. कम मात्रा में, digitonin चुनिंदा प्लाज्मा झिल्ली के भाग permeabilizes, 'leakiness' 16 के कारण. इसके विपरीत, ईआर झिल्ली और परमाणु लिफाफा, जो कोलेस्ट्रॉल में गरीब हैं बरकरार 16,17 छोड़ दिया जाता है.
    1. (सिग्मा Aldrich) Digitonin पाउडर के 5% वजन / मात्रा में आसुत जल में भंग कर रहा है और इस स्टॉक समाधान छोटे खंडों में aliquoted है और -20 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत हमारे अनुभव में, कई फ्रीज पिघलना चक्र भंग digitonin दक्षता घट जाती है.
    2. एक शेयर का समाधान10x चो बफर (1x काम समाधान एकाग्रता: 115 मिमी Kac, 25 मिमी HEPES पीएच 7.4, 2.5 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी EGTA और 150 मिमी सूकरोज) से RNase मुक्त अभिकर्मकों के साथ तैयार है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत एक काम समाधान (1x चो बफर) RNase मुफ्त पानी के साथ स्टॉक समाधान कमजोर द्वारा तैयार किया जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है

2. Digitonin निष्कर्षण

  1. निष्कर्षण समाधान की तैयारी
    1. एक फ्लैट सतह के साथ एक हीटिंग ब्लॉक 40 डिग्री सेल्सियस और निकासी के दौरान इस तापमान पर बनाए रखा है. पूर्व गर्म है
    2. करने के लिए काम कर रहे एक फ्लैट सतह कि RNase मुक्त फार्म, हीटिंग ब्लॉक कुछ और parafilm एम (Bemis कंपनी, इंक) के एक ताजा टुकड़ा के साथ पानी मढ़ा साथ सिक्त है. एयर parafilm चादर और हीटिंग ब्लॉक के बीच बुलबुले बाहर smoothed RNase मुक्त दस्ताने और kimwipes (VWR) का उपयोग कर रहे हैं.
    3. 1x चो बफर एक पानी के स्नान में incubating से 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म है.
    4. 6 अच्छी तरह प्लेटें धोने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंऔर कोशिकाओं तय कर लो. 3 कुओं की प्रत्येक पंक्ति कवर एक पर्ची के लिए प्रयोग किया जाता है. पंक्ति में पहले दो कुओं, गर्म चो बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ा जाता है. पिछले अच्छी तरह से करने के लिए, निर्धारण समाधान के 2 मिलीलीटर (पीबीएस 4 +% paraformaldehyde (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप साइंसेज)) जोड़ा गया है. इस ट्रे 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संग्रहित किया जा सकता है जब तक कोशिकाओं निकासी के लिए तैयार कर रहे हैं.
    5. 0.025% गर्म चो बफर के साथ शेयर digitonin समाधान बस का उपयोग करने से पहले कमजोर द्वारा Digitonin निष्कर्षण समाधान तैयार किया जाता है. कि puromycin का इलाज कोशिकाओं के लिए, निष्कर्षण बफर अतिरिक्त 20 मिमी EDTA कुशलता से रोकने के लिए 11 ribosomes को बाधित करना चाहिए फिर से ध्यान दें. निष्कर्षण समाधान के 100 μl की बूंदों हीटिंग parafilm से ढके ब्लॉक पर तुरंत निकासी से पहले रखा जाता है.
  2. Digitonin निष्कर्षण और सेल फिक्सेशन
    1. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से कोशिकाओं निकालें.
    2. निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान, coverslips jewler संदंश की मदद के साथ छेड़छाड़ कर रहे हैं. साथसंदंश coverslip लेने और यह पहली और फिर अच्छी तरह से युक्त 2 चो मध्यम विकास की धो बफर में डुबकी.
    3. जल्दी से एक kimwipe साथ coverslip के पीछे की ओर से अतिरिक्त बफर दाग और तुरंत coverslip, सेल नीचे निष्कर्षण समाधान पर, का सामना करना पड़ पक्ष जगह.
    4. 10 सेकंड के बाद संदंश के साथ coverslip लेने और तुरंत इसे स्थानांतरित करने के लिए, सेल ओर ऊपर का सामना करना पड़ रहा है, अच्छी तरह से युक्त 4% paraformaldehyde फिक्सिंग बफर.
    5. कमरे के तापमान पर कम से कम 15 मिनट के लिए लगानेवाला में नमूना सेते चलो.
  3. Unextracted नियंत्रण कक्ष की तैयारी. Cytoplasm में mRNA यह एक अच्छा विचार है एक unextracted नियंत्रण नमूना तैयार की कुल राशि का निर्धारण करते हैं.
    1. Coverslips पर विकसित कोशिकाओं के ऊपर (2.2 अनुभाग देखें) के रूप में तैयार कर रहे हैं, सिवाय इसके कि digitonin निष्कर्षण कदम (2.2.3) को छोड़ दिया है.
    2. निर्धारण के बाद, संयुक्त राष्ट्र के निकाले कोशिकाओं पीबीएस में permeabilized की जरूरत है + 0.1% ट्राइटनX-100 कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए.

3. मछली धुंधला

  1. स्वस्थानी संकरण में प्रतिदीप्ति के लिए जांच डिजाइनिंग
    1. रुचि के mRNA की प्राथमिक अनुक्रम आरएनए 5.0 18 RNAstructure के रूप में माध्यमिक संरचना भविष्यवाणी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मुड़ा है. mRNA सिलवटों नेत्रहीन कि प्रमुख माध्यमिक संरचनाओं के लिए स्वतंत्र है के बारे में 50 nucleotides के एक क्षेत्र की पहचान करने के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं.
    2. इस क्षेत्र के रिवर्स पूरक एक Alexa546 जांच के 5 अंत (एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज से खरीदी) जुड़ा fluorophore साथ संश्लेषित है.
    3. जांच RNase मुफ्त पानी के साथ 100 सुक्ष्ममापी की एक शेयर एकाग्रता जो -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है पतला है
  2. मछली जांच के साथ धुंधला हो जाना
    1. ध्यान दें कि हालांकि digitonin निकाले कोशिकाओं permeabilization आगे आवश्यकता नहीं है, 0.1% की 2 मिलीलीटर के साथ इन निश्चित नमूने के इलाज ट्राइटन X-100 में पतलाPBS मछली धुंधला पहले कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए, पृष्ठभूमि संकेत को कम करने में मदद करता है.
    2. स्लाइड्स तो पीबीएस के साथ दो बार धोया किसी भी अवशिष्ट paraformaldehyde या ट्राइटन X-100 को हटाने.
    3. कोशिकाओं तो 1X सोडियम साइट्रेट बफर (150 मिमी NaCl और 15 मिमी सोडियम साइट्रेट) में 25% से 60% Formamide के साथ दो बार धोया. आम तौर पर, विशिष्ट मछली जांच जो लंबाई में 50-60 nucleotides के लिए, 60% Formamide का इस्तेमाल किया है, लेकिन पाली (ए) oligo (डीटी) मछली जांच के साथ mRNA धुंधला के लिए, Formamide के स्तर के नीचे 25% से कम है.
    4. धुंधला हो जाना करने के लिए कक्ष तैयार करने के लिए, एक 150 मिमी पेट्री डिश के नीचे पानी के साथ कवर किया जाता है और parafilm का एक टुकड़ा पानी पर जारी है. पानी पकवान मोड़ पर से हटा दिया जाता है, इस प्रकार parafilm पकवान की तह तक पालन करने की अनुमति देता है. एयर बुलबुले स्वयं kimwipes साथ हटा रहे हैं.
    5. प्रत्येक coverslip कलंकित किया, सममूल्य पर एक संकरण ब्याज की मछली जांच युक्त समाधान के 100 μl ड्रॉप विंदुकधुंधला कक्ष में afilm. स्टॉक मछली जांच संकरण बफर में 25% से 60% Formamide (1x एसएससी, 100 मिलीग्राम / एमएल dextran सल्फेट, 1 मिलीग्राम / एमएल खमीर tRNA, 5mm vanadyl riboside जटिल, 25-60% Formamide) के साथ एक काम की एकाग्रता को पतला है 0.2 सुक्ष्ममापी. ध्यान दें कि Formamide की राशि विशेष रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है जांच के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए और एसएससी धोने बफर में के रूप में एक ही एकाग्रता (कदम 3.3.3 देखें) पर मौजूद है.
    6. coverslip सेल चेहरा पक्ष रखा गया है नीचे धुंधला कक्ष में मछली समाधान पर और 5-24 घंटे के लिए incubated टिशू कल्चर इनक्यूबेटर के रूप में एक humidified कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस है.
  3. धोने और बढ़ते दाग नमूने
    1. एक RNase मुक्त धोने क्षेत्र तैयार नीचे एक स्तर सपाट सतह पर parafilm की एक प्रयोगशाला बेंच के रूप में, पट्टी रखना. यह सुनिश्चित करने के लिए कि parafilm फ्लैट, स्तर की सतह गीला है, शीर्ष पर parafilm को जगह और स्वयं kimwipes साथ किसी भी हवाई बुलबुले को दूर.
    2. धुंधला हो चैम्बरमशीन से हटा दिया और एक फ्लैट स्तर की सतह पर रखा गया है. coverslips तो लगभग प्रत्येक coverslip के किनारे के पास मछली धोने बफर के 500 μl pipetting द्वारा जारी कर रहे हैं. समाधान और केशिका कार्रवाई के माध्यम parafilm coverslip के बीच तैयार हो जाएगा.
    3. प्रत्येक coverslip लिए, धोने बफर के 1 मिलीलीटर (1x SCC 25-60% Formamide के साथ देखने के लिए, कदम 3.3.3) धोने क्षेत्र parafilm (3.4.1 कदम देखें) पर pipetted है.
    4. संदंश का प्रयोग, coverslips धुंधला चैम्बर से हटा रहे हैं और प्रत्येक धोने बफर के ड्रॉप पर रखा गया है और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubated. धोने की प्रक्रिया में 3 बार दोहराया जाता है.
    5. ग्लास स्लाइड 70% इथेनॉल के साथ धो रहे हैं, और kimwipes साथ सूखे.
    6. प्रत्येक coverslip लिए, बढ़ते समाधान (DAPI Fluoromount जी, दक्षिणी बायोटेक) के 25 μl के स्लाइड पर pipetted है. ध्यान दें कि यह समाधान 4 '(DAPI) ,6-diamidino 2 - phenylindole, जो दाग डीएनए में शामिल है और नाभिक के दृश्य के लिए अनुमति देता है.
    7. USIएनजी संदंश और kimwipes coverslip के पीछे सूख जाता है और अतिरिक्त मछली धोने बफर से नमूना सुखाने के बिना blotted है. प्रत्येक coverslip तो सेल नीचे का सामना करना पड़ रहा है ओर बढ़ते समाधान के ड्रॉप पर रखा गया है.
    8. घुड़सवार नमूने तो चिह्नित कर रहे हैं और 4 में स्टोर किया जा सकता डिग्री सेल्सियस

4. इमेजिंग और मात्रा का ठहराव

  1. इमेजिंग
    1. Epifluorescence खुर्दबीन मछली धुंधला हो जाना के बाद कोशिकाओं की छवि के लिए प्रयोग किया जाता है. ट्रांसफ़ेक्ट सेल उपयुक्त चैनल में उज्ज्वल प्रतिदीप्ति संकेत द्वारा untransfected कोशिकाओं से भेदभाव किया जा सकता है. आदर्श रूप में, प्रत्येक क्षेत्र में भी हासिल कर ली एक untransfected मात्रा का ठहराव के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सेल शामिल होंगे.
    2. मछली और DAPI चैनल के प्रत्येक क्षेत्र छवियों का अधिग्रहण कर रहे हैं. इसके अलावा, अगर कोशिकाओं प्रोटीन मार्कर के साथ सह - दाग, immunofluorescence चैनल की एक छवि भी अधिग्रहण कर लिया है. नोट कि digitonin निष्कर्षण भी इस्तेमाल किया जा सकता हैईआर बाध्य ribosomes और 11 प्रोटीन कल्पना.
    3. यह सुनिश्चित करने के लिए कि क्षेत्रों के बीच प्रतिदीप्ति तीव्रता तुलना की जा सकती है, प्रत्येक चैनल के लिए जोखिम के समय प्रयोग के प्रत्येक सेट के लिए स्थिर रहना चाहिए.
    4. फिर से सुनिश्चित करने के लिए कि विभिन्न coverslips पर कोशिकाओं के बीच फ्लोरोसेंट तीव्रता तुलना की जा सकती है, या मछली संकेत में epiluminescence तीव्रता क्षय में एक दिन का परिवर्तन एक बैठे में coverslips के सभी इमेजिंग के द्वारा कम से कम किया जाना चाहिए.
  2. मात्रा का ठहराव. MRNA की राशि है कि ईआर पर स्थानीय यों, हम Nikon एनआईएस तत्व सॉफ्टवेयर का उपयोग करें. हालांकि ImageJ जैसे अन्य छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया जा सकता है.
    1. Nikon एनआईएस तत्व छवि विश्लेषण उपकरण का उपयोग, सेल परिधि और नाभिक रुचियाँ (ROIs) के अलग - अलग क्षेत्र के रूप में रेखांकित कर रहे हैं.
    2. प्रत्येक रॉय, फ्लोरोसेंट तीव्रता (कुल सेल तीव्रता के लिए मैं टी और मैं के लिए nपरमाणु) तीव्रता और क्षेत्र (ए टी और निकोबार) दर्ज की गई है और एक एक्सेल स्प्रेडशीट के लिए निर्यात कर रहे हैं.
    3. प्रत्येक छवि के लिए, पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट तीव्रता (मैं बी) एक गैर ट्रांसफ़ेक्ट सेल की तीव्रता की रिकॉर्डिंग के द्वारा निर्धारित किया जाता है. यदि पाली (ए) mRNA स्तर का विश्लेषण किया जा रहा है, एक सेल से मुक्त क्षेत्र का चयन किया जाता है.
    4. ईआर की कुल राशि (निकाले कोशिकाओं में) या cytoplasmic (कोशिकाओं में unextracted) प्रतिदीप्ति सूत्र द्वारा गणना की है:
      [टी] [मैं टी - मैं बी] [एन] [मैं एन - मैं बी]
    5. परमाणु धुंधला हो तीव्रता भी गणना की जा सकती है विभिन्न उपचार के बीच आंतरिक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है. चूंकि नाभिकों digitonin 17 उपचार या ribosome 11 विघटन से प्रभावित नहीं हैं, परमाणु mRNA की राशि इन उपचारों में से प्रत्येक के बीच स्थिर रहना चाहिए. परमाणु प्रतिदीप्ति निम्न सूत्र का इस्तेमाल किया है की गणना करने के लिए:
      [एन] [मैं एन - मैंबी]
    6. cytoplasmic mRNA का प्रतिशत कि ईआर लक्षित है 30-40 निकाले कोशिकाओं की औसत ईआर प्रतिदीप्ति (4.2.4 देखें) 30-40 unextracted कोशिकाओं (फिर 4.2.4 देखें) से औसत cytoplasmic प्रतिदीप्ति द्वारा विभाजित लेने से गणना की जा सकती है . यह महत्वपूर्ण है कि निकाले और unextracted कोशिकाओं के लिए तैयार कर रहे हैं, दाग और समानांतर में imaged है.

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Representative Results

MRNA का प्रतिशत कि ईआर जुड़े है क्योंकि 7-कोशिकाओं कि plasmids है कि अपरा alkaline फॉस्फेट (ALPP) या साइटोक्रोम P450 8B1 (CYP8B1) या तो digitonin साथ निकाले गए थे और फिर तय है, या सीधे तय निहित साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे निर्धारित (1 चित्र देखें, तुलना "Ctrl Unextracted" "Ctrl निकाले"). गैर परमाणु प्रतिदीप्ति दोनों नमूनों और ईआर जुड़े mRNA के अंश (2 चित्रा) की गणना की थी में मात्रा निर्धारित किया गया था. हमारे डेटा स्पष्ट रूप से पता चलता है कि दोनों ALPP और CYP8B1 लिए cytoplasmic mRNA के बारे में 60% ईआर के साथ जुड़ा हुआ है. के बाद से इन दोनों mRNAs के प्रोटीन है कि ईआर लुमेन में संसाधित कर रहे हैं सांकेतिक शब्दों में बदलना, हमारे परिणामों विचार है कि इस तरह के mRNAs ईआर की सतह पर अनुवाद कर रहे हैं के साथ संगत कर रहे हैं.

Ribosome हदबंदी के बाद इन टेप के ईआर संघ, COS-7 कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट की निगरानी tr थे30 मिनट के लिए तो निकाला है, और विशिष्ट मछली प्रत्येक mRNA (प्रतिनिधि छवियों के लिए देखें चित्र 1, ईआर और परमाणु जुड़े mRNA की मात्रा का ठहराव के लिए देखें चित्रा 3) के खिलाफ निर्देशित जांच का उपयोग तय दाग नियंत्रण मीडिया, puromycin या HHT साथ eated. ध्यान दें कि केवल ALPP, और नहीं CYP8B1 mRNA, ईआर पर बनाए रखा है के बाद ribosomes puromycin या HHT (2-3 आंकड़े) के साथ disassembled हैं. महत्वपूर्ण बात यह है कि परमाणु mRNA का स्तर या तो mRNA के लिए विभिन्न इलाज नमूने (चित्रा 3) के बीच बदलाव नहीं किया. यह लगातार परमाणु मछली संकेत इंगित करता है कि ईआर अंश में प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन mRNA अभिव्यक्ति या मछली धुंधला हो जाना में बदलाव में परिवर्तन की वजह से नहीं कर रहे हैं.

हम इन परिणामों से निष्कर्ष है कि ऐसे ALPP प्रतिलिपि के रूप में ईआर लक्षित mRNAs, के एक सबसेट disassembly राइबोसोम के बाद इस organelle की सतह पर बनाए रखा है.

"Jove_content" के लिए: रखने together.within पृष्ठ = ""> चित्रा 1
चित्रा 1 ALPP, लेकिन नहीं CYP8B1 mRNA ribosomes और अनुवाद की स्वतंत्र रूप से ईआर के साथ जुड़ा रहता है COS-7 कोशिकाओं या तो (शीर्ष पंक्ति) ALPP, या CYP8B1 (नीचे पंक्ति) जीन युक्त plasmids साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे और के लिए mRNA व्यक्त करने की अनुमति दी 18-24 घंटा. कोशिकाओं तो DMSO नियंत्रण मध्यम ("Ctrl"), puromycin Puro ("") या 30 मिनट के लिए HHT के साथ इलाज किया गया. कोशिकाओं को या तो सीधे ("unextracted") तय या 1 निकाले तो तय है. ध्यान दें कि जबकि नियंत्रण और HHT का इलाज कोशिकाओं digitonin अकेले के साथ निकाले गए थे, Puro इलाज किया कोशिकाओं digitonin और EDTA के साथ निकाले गए थे. सेल mRNA विशिष्ट मछली जांच का उपयोग करने के लिए दाग रहे थे, और imaged. पैमाने बार = 20 सुक्ष्ममापी.

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चित्रा 2. ईआर ALPP और CYP8B1 mRNA के लिए संघ के स्तर की मात्रा ट्रांसफ़ेक्ट COS-7 कोशिकाओं को या तो सीधे mRNA के cytoplasm में कुल स्तर (कोशिकाओं देखें चित्र 1 "Ctrl Unextracted") निर्धारित तय या 1 निकाले और फिर तय ईआर जुड़े mRNA (कोशिकाओं देखें चित्र 1 "Ctrl निकाले") की राशि का निर्धारण. प्रत्येक प्रयोग के लिए औसत 30-40 निकाली गई कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति ईआर जुड़े 30-40 unextracted कोशिकाओं की औसत cytoplasmic प्रतिदीप्ति, ER-बाध्य mRNA (y-अक्ष) के अंश देने से विभाजित किया गया था. प्रत्येक बार तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत मूल्य और मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. ईआर asso की मात्राALPP और ribosome हदबंदी के बाद CYP8B1 mRNA ciation ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं COS-7. नियंत्रण मध्यम या विभिन्न अनुवाद inhibitors, निकाला है, तय है, mRNA विशिष्ट मछली जांच और imaged (1 चित्रा, "निकाले" कोशिकाओं देखें) का उपयोग करने के लिए दाग के साथ इलाज किया गया. ईआर और नाभिक में mRNA की प्रतिदीप्ति तीव्रता quantified थे. प्रत्येक बार तीन स्वतंत्र प्रयोगों, पृष्ठभूमि और नियंत्रण इलाज कोशिकाओं के ईआर (y-अक्ष) में प्रतिदीप्ति सामान्यीकृत पर 30 कोशिकाओं के औसत एकीकृत तीव्रता से मिलकर प्रत्येक की औसत और मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करता है. ध्यान दें कि हालांकि ribosome विघटन CYP8B1 ईआर से अलग कर देना mRNA के कारण, परमाणु mRNA का स्तर अप्रभावित थे.

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Discussion

mRNAs की विभिन्न subcellular साइटों के लिए स्थानीयकरण, mRNA स्थानीयकरण प्रोटीन के साथ टेप की बातचीत के माध्यम से, अपने अंतिम गंतव्य के लिए प्रोटीन की उचित छँटाई के लिए, और जीन अभिव्यक्ति की ठीक ट्यूनिंग के लिए एक व्यापक subcellular की स्थानीय आवश्यकताओं के लिए एक महत्वपूर्ण घटना है 19,20 क्षेत्र.

परख का प्रयोग यहाँ वर्णित हम कि क्या mRNAs कि स्रावी सांकेतिक शब्दों में प्रोटीन ribosomes या अनुवाद की उपस्थिति या अनुपस्थिति में ईआर पर बनाए रखा जा सकता है का सवाल दोबारा गौर किया. दरअसल, हमने पाया है कि इन mRNAs की एक सबसेट इस 11 गतिविधि है. उदाहरण के लिए, इस निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि दोनों ALPP और CYP8B1 mRNAs नियंत्रण में ईआर की सतह इलाज COS-7 कोशिकाओं (1-2 आंकड़े) पर स्थानीयकृत हैं. हालांकि, अनुवाद inhibitors puromycin या HHT, केवल ALPP, लेकिन नहीं CYP8B1 mRNA के साथ कोशिकाओं के इलाज के बाद,कार्यात्मक ribosomes और अनुवाद (1 आंकड़े 3) के अभाव में ईआर के साथ जुड़े रहे. इसके अलावा हम पहले से पाया कि ALPP mRNA COS-7 11 pactamycin साथ इलाज किया कोशिकाओं में ईआर से जुड़ा रहता है. चूंकि इन विभिन्न उपचार मुक़्तलिफ़ तंत्र के माध्यम से कार्य करने के लिए संबद्ध राइबोसोम की mRNA स्पष्ट है, यह संभावना नहीं है कि ALPP के ईआर एसोसिएशन कुछ अप्रत्यक्ष किसी खास दवा के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया का परिणाम है. पुष्टि करते हैं कि इन अनुवाद inhibitors प्रभावी रहे हैं, यह भी उपयोगी है परीक्षण करने के लिए है कि वे 35 नव संश्लेषित प्रोटीन में एस methionine समावेश रोकना. उदाहरण के लिए, हमने पाया है कि केवल उपचार MDMP (100 सुक्ष्ममापी, 15 मिनट) COS-7 कोशिकाओं में प्रोटीन संश्लेषण (XA कुई और वायुसेना Palazzo, अप्रकाशित टिप्पणियों) के 40-60% को बाधित कर सकते हैं. नतीजतन, इस दवा कुशलतापूर्वक mRNAs कि अपने लक्ष्यीकरण और रखरखाव के लिए अनुवाद की आवश्यकता के ईआर स्थानीयकरण को बाधित नहीं करता है (XA कुई और वायुसेना Palazzo, अप्रकाशित टिप्पणियों).

और यह सुनिश्चित करें कि mRNA की ईआर लक्ष्यीकरण इनकोडिंग संकेत अनुक्रम या transmembrane डोमेन पर निर्भर नहीं है, एक exogenous प्रतिलिपि बदल इतना है कि यह एक cytoplasmic प्रोटीन encodes कर सकते हैं. दरअसल, हम पहले से दिखा दिया है कि कि दोनों संकेत अनुक्रम और कोडिंग transmembrane क्षेत्रों का अभाव ALPP mRNA के एक संस्करण अभी भी 11 ईआर के लिए स्थानीय बनाना करने में सक्षम है.

यह भी ध्यान देने योग्य बात है कि यहाँ प्रस्तुत विधि जब अन्य 21 परमाणु mRNA निर्यात का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता assays के साथ संयुक्त, नाभिक से mRNA परिवहन के एक डिब्बे से कैनेटीक्स और आवश्यकताओं को एक और (जैसे की सतह को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ) ईआर. दरअसल, plasmids है जो कि अनुवाद inhibitors के साथ pretreated थे COS-7 सेल के नाभिक में ALPP जीन होते microinjecting द्वारा, हम पहले कि नव बनाया ALPP प्रदर्शनmRNAs अनुवाद या 11 ribosome संघ की स्वतंत्र रूप से ईआर के लिए लक्षित कर रहे हैं.

हालांकि हम पूरी तरह से कैसे इन mRNAs लक्षित कर रहे हैं और ईआर के लिए लंगर की समझ में नहीं आता है, तो यह संभावना है कि इस organelle mRNA रिसेप्टर्स हैं. वास्तव में हम हाल ही में P180 की पहचान की है, एक बड़े सकारात्मक आरोप लगाया ALPP mRNA की क्षमता के लिए आवश्यक 11 अनुवाद की स्वतंत्र रूप से ईआर पर बनाए रखा जा जा रहा है के रूप में प्रोटीन झिल्ली ही सीमित है,. हालांकि, यह संभावना है कि अन्य mRNA रिसेप्टर्स 11 ईआर की सतह पर मौजूद होना चाहिए. तकनीक की मदद यहाँ उल्लिखित, हम की पहचान और आणविक तंत्र है कि स्तनधारी कोशिकाओं में mRNA स्थानीयकरण को विनियमित करने में मदद के कई टुकड़े करना उम्मीद है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम XAC और एएफपी के लिए राष्ट्रीय विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया

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स्तनधारी कोशिकाओं में endoplasmic जालिका स्थानीयकृत mRNAs का विज़ुअलाइज़ेशन
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Cui, X. A., Palazzo, A. F.… More

Cui, X. A., Palazzo, A. F. Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (70), e50066, doi:10.3791/50066 (2012).

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