Visualisering av endoplasmatisk retikulum Lokalisert mRNAs i pattedyrceller

Summary

Her beskriver vi en fremgangsmåte for å visualisere endoplasmatiske retikulum-assosierte mRNAer i mammalske vevskultur celler. Denne teknikken involverer den selektive permeabilization av plasmamembranen med digitonin å fjerne cytoplasmatiske innhold etterfulgt av fluorescerende

Abstract

I eukaryoter, fleste messenger RNAer (mRNAer) som koder utskilt og membran proteiner er lokalisert på overflaten av det endoplasmatiske retikulum (ER). Imidlertid kan visualisering av disse mRNA være utfordrende. Dette er spesielt sant når bare en brøkdel av mRNA er ER-assosiert og deres fordeling i denne organeller forhindres av ikke-målrettede (dvs. "fri") transkripsjoner. For å kunne overvåke ER-assosierte mRNAer, har vi utviklet en metode hvor cellene blir behandlet med en kort eksponering til en digitonin ekstraksjonsløsningen som selektivt permeabilizes plasmamembranen, og dermed fjerner cytoplasmatiske innholdet, samtidig som de beholder integriteten av ER . Når denne metoden er kombinert med fluorescerende in situ hybridisering (FISH), kan en tydelig se ER-bundet mRNAer ved fluorescerende mikroskopi. Bruk av denne protokollen graden av ER-forening for enten bulk poly (A) eller spesifikke transkripter mRNAs kan vurderesog selv kvantifisert. I prosessen, kan man bruke denne analysen å undersøke naturen av mRNA-ER interaksjoner.

Introduction

I eukaryoter, mRNA koding utskilt og membran proteiner kan være målrettet til ER co-translationally av signalet anerkjennelse partikkel ^1,2 og kan opprettholdes på ER via direkte interaksjoner mellom ribosomer og translocons under oversettelsen ^3,4. Men om mRNA kan målrettes og vedlikeholdes på ER uavhengig av enten ribosomer eller oversettelse var uklart inntil ganske nylig. Tidligere studier forsøkt å ta om det er translasjons-uavhengig mRNA tilknytning ER via mobile fraksjonering teknikker. Fordi sterke kjemiske forhold ble pålagt å angre ribosomer fra ER avledet blemmer, som kan forstyrre potensielt delikat mRNA-ER forening, var disse studiene mangelfulle, og gir bevis for ^5-8 og mot ^9,10 ribosomal-uavhengig forankring av mRNA til ER .

Å omgå disse problemene vi har utviklet en protocol å isolere og bilde ER-bundet mRNAs. Denne prosedyren involverer en mild ekstraksjon behandling, som effektivt fjerner alt cytoplasmisk innholdet av cellen (herunder ikke ER-bundet mRNAer) samtidig bevare ER morfologi og alle assosierte molekyler. Ved hjelp av denne protokollen har vi vist at en undergruppe av mRNA er målrettet og vedlikeholdt på ER uavhengig av ribosomer eller oversettelse ^11.

Protocol

1. Forberedelse av materiale til Extraction

1. Utarbeidelse av celler
   1. Seed vevskultur celler på syrebehandlede dekkglass for minst en dag før forsøket. Vi bruker COS-7 eller U2OS, som disse to cellelinjer oppviser robuste produksjon av utskilt protein, og har et godt definert ER. Merk at for å oppnå høy utvinning effektivitet, bør cellene ikke overstige 80% sammenflyting på dekkglasset på dagen av eksperimentet.
   2. Hvis et bestemt eksogene mRNA blir undersøkt, blir cellene transfektert en dag etter såing med plasmider inneholdende genet av interesse ved bruk av standard transfeksjon protokoller. Cellene blir deretter lov til å uttrykke mRNA for minst 18 hr før ekstraksjon.
2. Behandling av cellene med Translation hemmere
   1. For å teste effekten av intakte ribosomer på vedlikehold av mRNA tilknytning ER, kan cellene behandles med oversettelse hemmere som forstyrrer foreningenav ribosomer med mRNA ^11.
   2. Inhibitorer av translasjons-initierings som homoharringtonin (HHT), pactamycin, eller 2 - (4-metyl-2 ,6-dinitroanilino) - N-methylpropionamide (MDMP), hindre nye ribosomer fra omgåes transkriptet samtidig gi engasjert ribosomer til fullføre oversettelsen ^12-14. Siden oversettelsen sats for de fleste proteiner i pattedyrceller er 5 aminosyrer pr andre, uavhengig av kodon bruken eller mRNA lengde ^15, bør en behandling av 30 min klare ribosomer av av meldinger med åpne leserammer så lenge 27.000 nukleotider (som koder for proteiner så lenge som 9.000 aminosyrer).
   3. Hemmere som puromycin fremme tidlig utstøting av den begynnende kjeden og således forstyrre polysomes ^12. Men helt forstyrre sammenslutning av puromycin-behandlede ribosomer med mRNA må magnesium chelatorer som EDTA legges til digitonin utvinning buffer ^11.
   <li> I dette eksperimentet, er celler behandlet med 200 pM puromycin, 5 pM HHT, eller kontroll medium i 30 min før ekstraksjon.
3. Utarbeidelse av Digitonin Utvinning Buffer. Å visualisere ER-lokaliserte mRNAs uten obstruksjon av gratis (dvs. cytoplasmatiske, ikke-ER-tilknyttede) transkripsjoner, vi selektivt permeabilize cellen med digitonin, et steroid glycoside som samhandler fortrinnsvis med 3β-hydroxysterols. Ved lave konsentrasjoner, permeabilizes digitonin selektivt partier av plasmamembranen, forårsaker "leakiness ^'16. I kontrast er det ER membranen og kjernefysisk konvolutt, som er dårlig kolesterol, intakt ^16,17.
   1. Digitonin (Sigma Aldrich) pulveret er oppløst i destillert vann ved 5% vekt / volum, og denne lager løsningen alikvoteres i små volumer og lagret i -20 ° C. I vår erfaring, minker flere fryse-tine sykluser effektiviteten av oppløst digitonin.
   2. En stamløsning av10x CHO buffer (1x arbeidsløsning konsentrasjon: 115 mM KAC, 25 mM HEPES pH 7,4, 2,5 mM MgCl _{2, 2} mM EGTA og 150 mM sukrose) blir fremstilt med RNase-frie reagenser og lagret ved -20 ° C. En arbeidsoppløsning (1x CHO buffer) fremstilles ved å fortynne stamløsningen med RNase-fritt vann, og kan lagres ved 4 ° C.

2. Digitonin Extraction

1. Forbereder Extraction Solutions
   1. En varmeblokk med en flat overflate er forvarmet til 40 ° C og opprettholdt ved denne temperatur under til utvinning.
   2. For å danne en flat arbeidsflate som er RNase fri, er varmeblokken fuktet med litt vann og dekkes med et frisk stykke Parafilm M (Bemis Company, Inc). Luftbobler mellom parafilm ark og oppvarming blokk er glattet ut ved hjelp RNase-frie hansker og kimwipes (VWR).
   3. 1x CHO buffer er oppvarmet til 37 ° C ved å inkubere i et vannbad.
   4. 6-brønners plater blir brukt til å vaskeog fikser cellene. Hver rad av 3 brønner brukes til en deksel-slip. Til de to første brønnene i raden, er 2 ml oppvarmet CHO buffer lagt til. Til den siste brønnen, 2 ml av fikseringsløsning (PBS + 4% paraformaldehyd (elektronmikroskop Sciences)) tilsettes. Denne skuffen kan lagres i 37 ° C inkubator til cellene er klar for utvinning.
   5. Digitonin ekstraksjonsløsningen fremstilles ved fortynning av lager digitonin løsningen til 0,025% med varm CHO buffer rett før bruk. Igjen oppmerksom på at for puromycin-behandlede celler, må ekstraksjonen bufferen i tillegg inneholde 20 mM EDTA for å effektivt forstyrre ribosomer ^11. Dråper av 100 ul av ekstraksjonsrøret løsningen plasseres på parafilm-dekket varmeblokk umiddelbart før ekstraksjon.
2. Digitonin Utvinning og Cell Fiksering
   1. Fjerne celler fra 37 ° C inkubator.
   2. Under utpakkingen blir dekkglass manipulert ved hjelp av jewler tang. Medpinsett plukker opp dekkglass og dyppe den i første og deretter den andre brønnen som inneholder CHO buffer for å vaske av veksten medium.
   3. Raskt klatt av overflødig buffer ved baksiden av dekkglass med en kimwipe og umiddelbart plassere dekkglass, celle siden ned, på utvinning løsning.
   4. Etter 10 sek, plukke opp dekkglass med pinsett og umiddelbart overføre den, celle vendt opp, til vel inneholder 4% paraformaldehyd feste buffer.
   5. La prøven inkuberes i fiksativ i minst 15 minutter ved romtemperatur.
3. Utarbeidelse av Unextracted kontroll Cells. Å bestemme den totale mengden av mRNA i cytoplasma er det en god idé å forberede en unextracted kontrollprøve.
   1. Celler dyrket på dekkglass er fremstilt som ovenfor (se avsnitt 2.2), bortsett fra at digitonin ekstraksjonstrinnet (2.2.3) hoppes over.
   2. Etter fiksering, un-ekstraherte celler må permeabilized i PBS + 0,1% TritonX-100 i 15 minutter ved romtemperatur.

3. FISH Farging

1. Designing prober for fluorescens in situ hybridisering
   1. Den primære sekvensen av mRNA av interesserte er foldet ved hjelp av RNA sekundær struktur prediksjon programvare, for eksempel RNAstructure 5,0 ^18. MRNA seg folder vurdert visuelt for å identifisere en region på omtrent 50 nukleotider som er fritt for store sekundære strukturer.
   2. Det motsatte komplementet denne regionen er syntetisert med en Alexa546 fluorofor festet til 5'-enden av proben (kjøpt fra Integrated DNA Technologies).
   3. Sonden blir fortynnet med RNase-fritt vann til et lager konsentrasjon av 100 uM som kan lagres ved -20 ° C.
2. Farging med fisk sonder
   1. Merk at selv om digitonin-ekstraherte celler ikke kreve ytterligere permeabilization, behandle disse faste prøver med 2 ml 0,1% Triton X-100 fortynnet iPBS i 15 min ved romtemperatur før FISH flekker, bidrar til å redusere bakgrunnen signalet.
   2. Lysbildene blir deretter vasket to ganger med PBS for å fjerne eventuelle gjenværende paraformaldehyd eller Triton X-100.
   3. Cellene blir deretter vasket to ganger med 25% til 60% formamid i 1X Natrium citratbuffer (150 mM NaCl og 15 mM natriumcitrat). Generelt, for bestemt fisk sonder som er 50-60 nukleotider i lengde, er 60% formamid som brukes, men for poly (A) mRNA-farging med oligo (dT) probe FISH, er nivået på formamid redusert ned til 25%.
   4. For å klargjøre farging kammeret, er bunnen av en 150 mm petriskål dekket med vann og en del av Parafilm fløtes på vannet. Vannet blir fjernet ved å vri tallerken over, og dermed gir Parafilm å følge bunnen av skålen. Luftbobler fjernes manuelt med kimwipes.
   5. For hver dekkglasset å være farget, pipetteres en 100 pl dråpe av hybridisering inneholdende FISH probe av interesse på pariAFILM i farging kammeret. Bestanden FISH proben fortynnes med 25% til 60% formamid i hybridiseringsbuffer (1x SSC, 100 mg / ml dekstransulfat, 1 mg / ml gjær tRNA, 5mM Vanadyl ribosid kompleks, 25-60% formamid) til en arbeidskonsentrasjon på 0,2 mikrometer. Oppmerksom på at mengden av formamid bør optimaliseres for den spesielle sonde brukes, og er til stede ved den samme konsentrasjon som i SSC vaskebuffer (se trinn 3.3.3).
   6. Dekkglasset plasseres celle siden ned på FISH løsningen i farging kammeret og inkubert i 5-24 timer ved 37 ° C i en fuktet kammer som vevskultur inkubatoren.
3. Vasking og montere farget prøvene
   1. For å forberede en RNase fri vaskeområde, fastsette en stripe av Parafilm på en jevn flat overflate, slik som en lab benk. For å sikre at parafilm er flat, våt plant underlag, plassere parafilm på toppen og manuelt fjerne eventuelle luftbobler med kimwipes.
   2. Fargingen kammeret erfjernet fra inkubatoren og plassert på en flat og horisontal flate. De dekkglass blir deretter fløt ved å pipettere ca 500 pl FISH vaskebuffer nær kanten av hver dekkglasset. Løsningen vil bli trukket i mellom dekkglasset og parafilm via kapillærkraft.
   3. For hver dekkglass, er 1 ml vaskebuffer (1x SCC med 25-60% formamid, se trinn 3.3.3) pipetteres på vaskerom parafilm (se trinn 3.4.1).
   4. Bruke pinsett, blir dekkglass fjernet fra farging kammeret og hver er plassert på dråpe vaskebuffer og inkubert ved romtemperatur i 5 min. Vaskeprosessen gjentas 3 ganger.
   5. Glassplater er vasket med 70% etanol, og tørket med kimwipes.
   6. For hver dekkglass, er 25 ul montering løsning (DAPI Fluoromount G, Sør Biotech) pipetteres på lysbildet. Merk at denne løsningen inneholder 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), hvilke flekker DNA og tillater for visualisering av kjerner.
   7. USIng tenger og kimwipes, er baksiden av dekkglasset tørket og overskytende FISH vaskebuffer er blotted av uten tørking av prøven. Hver dekkglass blir deretter plassert celle vendt nedover, på slipp av montering løsning.
   8. Mounted prøvene blir merket og kan være Oppbevar ved 4 ° C.

4. Bildebehandling og kvantifisering

1. Imaging
   1. En epifluorescence mikroskop brukes til å avbilde cellene etter FISH farging. Den transfekterte celle kan skilles fra untransfected celler ved lyse fluorescens signal i riktig kanal. Ideelt sett vil hvert ervervet felt også inneholde en untransfected celle som skal brukes for å bestemme bakgrunnsfluorescens for kvantifisering.
   2. For hvert felt bilder av fisk og DAPI kanal blir kjøpt. I tillegg, hvis cellene er co-farget med protein markører, er et bilde av den immunfluorescens kanalen også anskaffet. Merk at digitonin utvinning kan også brukeså visualisere ER-bundet ribosomer og proteiner ^11.
   3. For å sikre at de fluorescensintensiteter mellom felt kan sammenlignes, bør eksponeringstiden for hver kanal forblir konstant for hvert sett av forsøk.
   4. Igjen for å sikre at de fluorescerende intensiteter mellom celler på forskjellige dekkglass kan sammenlignes, bør den dag-til-dag endringer i epiluminescence intensitet eller forråtnelse i fiskeekkoet minimaliseres ved avbildning alle dekkglass i en enkelt sittende.
2. Kvantifisering. For å kvantifisere mengden av mRNA som er lokalisert på ER, bruker vi Nikon NIS Element programvare. Men andre bildeanalyse programvare som ImageJ kan brukes.
   1. Bruke Nikon NIS ELEMENT bildeanalyse verktøyet, er cellen periferien og kjernen skissert som egen region av interesser (ROIs).
   2. For hver ROI, den fluorescerende intensitet (I _T for hele cellen intensitet og I _N forkjernefysisk intensitet) og området (A _T og A _N) blir registrert og eksporteres til et Excel-regneark.
   3. For hvert bilde, er bakgrunnen fluorescerende intensitet (I _B) bestemmes ved å registrere intensiteten av en ikke-transfekterte celle. Hvis poly (A) mRNA-nivåer blir analysert, er en celle-fritt område valgt.
   4. Den totale mengden av ER (i utpakkede celler) eller cytoplasmiske (i unextracted celler) fluorescens beregnes ved formelen:
      [A _T] [I _T - I _B] - [A _N] [I _N - _{I B]}
   5. Den kjernefysiske fargeintensitet kan også beregnes og brukes som indre kontroll mellom ulike behandlinger. Siden atomkjerner, ikke påvirkes av digitonin behandling ¹⁷ eller ribosom avbrudd ^11, bør mengden av kjernefysisk mRNA forbli konstant mellom hver av disse behandlinger. For å beregne kjernefysisk fluorescens følgende formel benyttes:
      [A _N] [I _N - _IB]
   6. Prosenten av cytoplasmisk mRNA som er ER-målrettet kan beregnes ved å ta gjennomsnittet ER fluorescens på 30-40 hentet celler (se 4.2.4) dividert på gjennomsnittlig cytoplasmisk fluorescens 30-40 unextracted celler (igjen se 4.2.4) . Det er viktig at de utklipte og unextracted celler er forberedt, farget og avbildes parallelt.

Representative Results

Å bestemme prosentandelen av mRNA som er ER-assosiert, COS-7-celler som ble transfektert med plasmider som inneholdt placenta alkalisk fosfatase (ALPP) eller cytokrom P450-8B1 (CYP8B1) ble enten ekstrahert med digitonin og deretter fast, eller direkte festet (se figur 1, sammenligne "Unextracted Ctrl" til "Utdrag Ctrl"). Den ikke-nukleær fluorescens ble kvantifisert i begge prøver og fraksjonen av ER-assosiert mRNA ble beregnet (figur 2). Våre data viser tydelig at både ALPP og CYP8B1 er ca 60% av den cytoplasmiske mRNA forbundet med ER. Siden begge disse mRNA koder proteiner som behandles i ER-lumen, våre resultater er konsistente med ideen om at slike mRNAer omregnes på overflaten av ER.

Å overvåke ER-sammenslutning av disse transkripsjoner etter ribosom dissosiasjon, transfektert COS-7 celler var treated med kontroll medier, puromycin eller HHT i 30 min deretter ekstrahert, fiksert og farget med bestemte FISH sonder rettet mot hver mRNA (for representative images se Figur 1, for kvantifisering av ER-og kjerne-assosiert mRNA se Figur 3). Merk at bare ALPP, og ikke CYP8B1 mRNA, opprettholdes på ER etter ribosomer er demontert med puromycin eller HHT (Tall 2-3). Viktigere nivået av kjernefysisk mRNA ikke endret mellom de varierende behandlede prøvene for enten mRNA (figur 3). Denne konstante kjernefysisk FISH signal indikerer at endringene i fluorescensintensitet i ER brøkdel skyldes ikke endringer i mRNA uttrykk eller variasjoner i FISH farging.

Fra disse resultatene kan vi konkludere at en undergruppe av ER-målrettede mRNAer, som ALPP transkripsjon, opprettholdes på overflaten av denne organeller etter ribosom demontering.

"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "always">
Figur 1. ALPP, men ikke CYP8B1 mRNA fortsatt forbundet med ER uavhengig av ribosomer og oversettelse. COS-7 celler ble tilført plasmider inneholder enten ALPP (øverste rad), eller CYP8B1 (nederste rad) gener og lov til å uttrykke mRNA for 18-24 hr. Cellene ble deretter behandlet med DMSO kontrollmediet ("Ctrl"), puromycin ("Puro") eller HHT i 30 min. Celler ble enten direkte festet ("unextracted") eller første ekstrahert deretter fast. Merk at mens kontroll og HHT-behandlede celler ble ekstrahert med digitonin alene, Puro-behandlede celler ble ekstrahert med digitonin og EDTA. Celler ble farget for mRNA ved hjelp av bestemte FISH sonder, og avbildes. Skala bar = 20 mikrometer.

lltid ">
Figur 2. Kvantifisering av nivået av ER-forening for ALPP og CYP8B1 mRNA. Transfekterte COS-7 celler ble enten direkte festet til bestemme det totale nivået av mRNA i cytoplasma (se figur 1, "Unextracted CTRL" celler) eller første ekstrahert og deretter fast for å bestemme mengden av ER-assosiert mRNA (se figur 1, "utpakkede CTRL" celler). For hvert forsøk den gjennomsnittlige ER-assosiert fluorescens av 30-40 utpakkede celler ble delt på gjennomsnittlig cytoplasmisk fluorescensen av 30-40 unextracted celler, for å gi fraksjon av ER-bundet mRNA (y-akse). Hver stolpe representerer gjennomsnittsverdien og standard feil av tre uavhengige eksperimenter.

Figur 3. Kvantifisering av ER-assoninger av ALPP og CYP8B1 mRNA etter ribosom dissosiasjon. transfekterte COS-7 celler ble behandlet med kontroll medium eller ulike oversettelse hemmere, ekstrahert, fast, farget for mRNA ved hjelp av bestemte FISH sonder og avbildes (se figur 1, "ut" celler). De fluorescensintensiteter av mRNA i ER og kjernen ble kvantifisert. Hver stolpe representerer gjennomsnittlig og standard feil av tre uavhengige eksperimenter, som hver består av den gjennomsnittlige integrerte intensiteten av 30 celler over bakgrunn og normalisert til fluorescensen i ER av kontroll-behandlede celler (y-akse). Vær oppmerksom på at selv om ribosom avbrudd forårsaket CYP8B1 mRNA å distansere seg fra den ER, nivåene av kjernefysisk mRNA var upåvirket.

Discussion

Lokalisering av mRNA til ulike subcellulære områder, gjennom samspillet av transkripsjoner med mRNA lokalisering proteiner, er et utbredt fenomen viktig for riktig sortering av proteiner til det endelige bestemmelsessted, og for finjustering av genekspresjon til lokale krav til et subcellulære region ^19,20.

Bruke-analysen beskrevet her, revisited vi spørsmålet om mRNA som koder sekretoriske proteiner kan opprettholdes på ER i nærvær eller fravær av ribosomer eller oversettelse. Ja, vi fant at en undergruppe av disse mRNA har denne aktiviteten ^11. For eksempel, ved hjelp av denne ekstraksjonen protokollen, vi fastslått at både ALPP og CYP8B1 mRNAs er lokalisert på overflaten av ER i kontrollen behandlet COS-7 celler (figurene 1-2). Imidlertid, etter behandling av cellene med oversettelse hemmere puromycin eller HHT, bare ALPP, men ikke CYP8B1 mRNA,forble assosiert med ER i fravær av funksjonelle ribosomer og oversettelse (figurene 1, 3). I tillegg har vi funnet at tidligere ALPP mRNA forblir ER-forbundet i COS-7 celler som ble behandlet med ¹¹ pactamycin. Siden disse ulike behandlinger handle gjennom avvikende mekanismer for å fjerne mRNA av tilknyttede ribosomer, er det usannsynlig at ER-sammenslutning av ALPP er resultatet av noen indirekte cellulær respons til noen bestemt legemiddel. For å bekrefte at disse oversettelse hemmere er effektive, er det også nyttig for å teste om de inhiberer inkorporering av ³⁵ S-metionin i nylig syntetiserte proteiner. For eksempel har vi funnet at MDMP-behandling (100 uM, 15 min), kan kun hemme 40-60% av all proteinsyntesen i COS-7 celler (XA Cui og AF Palazzo, upubliserte observasjoner). Som et resultat, ikke dette stoffet ikke effektivt forstyrre ER-lokalisering av mRNA som krever oversettelse for deres målgruppe og vedlikehold (XA Cui og AF Palazzo, upubliserte observasjoner).

For ytterligere å sikre at ER-målretting av mRNA er ikke avhengig kodet signalsekvens eller transmembrane domener, kan en endre eksogene transkripsjon, slik at det koder for et cytoplasmatisk protein. Faktisk viser vi tidligere vist at en versjon av ALPP mRNA som mangler både signalsekvensen og transmembrane koding regioner er fortsatt i stand til å lokalisere til ER ^11.

Det er også verdt å merke seg at metoden presentert her når det kombineres med andre assays som brukes for å analysere mRNA kjernefysiske eksport ^21, kan brukes til å definere kinetikk og krav av mRNA transport fra en kammer til et annet (f.eks fra kjernen til overflaten av ER). Faktisk, ved microinjecting plasmider som inneholder ALPP genet i kjerner av COS-7 celler som ble forbehandlet med oversettelse hemmere, vi tidligere demonstrert at nylaget ALPPmRNAs er målrettet mot ER uavhengig av oversettelse eller ribosom-foreningen ^11.

Selv om vi ikke fullt ut forstår hvordan disse mRNA er målrettet og forankret til ER, er det sannsynlig at dette organelle inneholder mRNA reseptorer. Faktisk vi nylig identifisert P180, et stort positivt ladet membran-bundet protein, som nødvendige for evnen ALPP mRNA skal opprettholdes på ER uavhengig av oversettelse ^11. Imidlertid er det sannsynlig at andre mRNA reseptorer må være til stede på overflaten av ER ^11. Med hjelp av teknikken beskrevet her, håper vi å identifisere og dissekere mange av de molekylære mekanismene som bidrar regulere mRNA lokalisering i mammalske celler.