Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Mätning av livslängden i doi: 10.3791/50068 Published: January 7, 2013

Summary

Drosophila melanogaster är en kraftfull modell organism för att utforska den molekylära grunden för livslängd reglering. Detta protokoll kommer att diskutera de olika stegen i generering av en reproducerbar, populationsbaserade mätning av livslängden samt potentiella fallgropar och hur man undviker dem.

Abstract

Åldrande är ett fenomen som resulterar i jämn fysiologisk försämring nästan alla organismer som har undersökts, vilket leder till minskad fysisk prestationsförmåga och ökad risk för sjukdom. Individuell åldrande är uppenbar på populationsnivå som en ökning av åldersberoende dödlighet, som ofta mäts i laboratoriet genom att observera livslängd i stora kohorter av åldersmatchade individer. Experiment som syftar till att kvantifiera i vilken utsträckning genetisk eller miljömässig manipulationer påverkar livslängden i enkla modellorganismer har varit anmärkningsvärt framgångsrika för att förstå de aspekter av åldrandet som är konserverade mellan taxa och inspirerande nya strategier för att utöka livslängden och förhindra ålder-associerad sjukdom hos däggdjur .

Ättika flyga, Drosophila melanogaster, är en attraktiv modell organism för att studera mekanismerna för åldrande på grund av dess relativt korta livslängd, bekväm djurhållning, och enkel genetik.Men demografiska mått på åldrande, inklusive åldersspecifik överlevnad och dödlighet, är utomordentligt känsliga för även små variationer i experimentell design och miljö, och upprätthållandet av strikta laboratoriepraxis så länge åldrande experiment krävs. Dessa överväganden tillsammans med behovet att öva noggrann kontroll av genetisk bakgrund, är avgörande för att generera robusta mätningar. Det finns faktiskt många anmärkningsvärda kontroverser kring slutledning från livslängd experiment i jäst, maskar, flugor och möss som har spårats till miljö-eller genetiska artefakter 1-4. I detta protokoll beskriver vi en rad förfaranden som har optimerats under många år för att mäta livslängd i Drosophila med laboratorium flaskor. Vi beskriver också användningen av dLife programvara som har utvecklats av vårt laboratorium och finns för nedladdning ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / mjukvara). dLife accelererar genomströmningen och främjar god praxis genom att införliva optimal experimentell design, vilket förenklar flyga hantering och insamling av data, och standardisera dataanalys. Vi kommer också att diskutera de många potentiella fallgropar i utformningen, insamling och tolkning av livslängd data och vi tillhandahåller åtgärder för att undvika dessa faror.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi rekommenderar att lagra experimentella livsmedel, jäst pasta och druva agarplattor som visas i protokollet vid 4 ° C och använda dem inom 1-2 månader, så länge mögel och torrhet inte har ställt in standard miljöförhållanden för både larver och vuxna steg inbegripa bibehållande av flugor i en inkubator vid 25 ° C med en 12:12 timmars ljus mörkercykel och 60% relativ fuktighet.

1. Beredning av experimentell mat

  1. För larver tillväxt använder vi en modifierad Caltech medium 5, som förkortas i detta protokoll som CT.
  2. Vi rekommenderar en diet för vuxna Drosophila (SY) som består av socker (sackaros) och jäst (frystorkad hela öljäst) i en 2% agar bas, som har kokats, kompletterat med antibiotika och anti-svamp medel, och distribueras (10 ml per flaska) 6. Livsmedel bör tillåtas stelna och avdunsta för 12-24 timmar före lagring. Eftersom näringsämne miljön kan väsentligt påverka livslängd, konsekvens i matlagning processer är avgörande både inom ett experiment och för jämförelse mellan experimenten.
  3. Om ett farmakologiskt medel är att sättas till vuxenfoder, kan detta läkemedel blandas i en liten sats av livsmedel och skiktad (2 ml) på livsmedel ytan, med kontroll flaskor mottagande skikt innehållande enbart vehikel.

2. Beredning av en aktiv jäst Klistra

Kombinera 5-6 ml vatten med 3 g aktiv torrjäst och blanda väl. Konsistensen av jäst pastan bör vara att en smidig jordnötssmör.

3. Beredning av en druva agarplatta

  1. Lägg till ett paket av en druva agar förblandning i 500 ml destillerat vatten i en 1000 ml kolv och följ instruktionerna på paketet för att lösa upp druva agar mix.
  2. Häll ett tjockt skikt av blandningen till 100 mm Petri-skålar och samtidigt undvika bubbelbildning. Ett paket av förblandning producerar cirka 14 grape agarplattor.
  3. Låt medierna svalna och stelna i rumstemperatur med lock på under 15 min. Plattor kan hållas vid 4 ° C, insvept i plastfolie, eller användes omedelbart.

4. Insamling av Synkroniserade Ägg

All media som används i detta protokoll, dvs jäst, druva agarplattor, CT och 10% SY mat, bör vara rumstempererade.

  1. Sprid ett 2-3 lager cm diameter jäst klistra på en druva agarplatta och ställ åt sidan.
  2. Placera en stor bur ägg insamlingen en CO 2 pad med nätet nedåt för att bedöva flugorna. Kväve-baserade anestesi är ett alternativ till CO 2, som används av vissa laboratorier, som kan producera högkvalitativa resultat 7.
  3. Med hjälp av en tratt, överför 150-200 par flugor i insamling av ägg bur.
  4. Placera druva agarplattan för att täcka den öppna änden av buren och fäst med en ändkåpa.
  5. Lägg buren på sidan tills flugor vaknar.Sedan hålla buren, druva sidan agarplatta ner i inkubatorn över natten.
  6. Nästa dag, byta druva plattan med en nyligen yeasted druva plattan. Bara lägga ca 1 cm diameter jäst pasta på ytan av plattan. Kasta den 1 plattan dag druva.
  7. Låt embryon samlas på ytan av den druvan agarplattan för 16-22 tim. När detta är gjort, samla druvor agarplattan och kasta de överordnade flugor.
  8. Tvätta ytan av druva agarplattor med 1x Fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ägg kan mobiliseras genom att försiktigt skrapa med en bomullspinne. Se till att inte repa, skada eller skrapa tunna bitar av agar från plattans yta. Med hjälp av en tratt, häll tvättade äggen i en 15 ml koniskt rör.
  9. Låt äggen sjunka till botten av röret och häll bort supernatanten, försiktigt så att inte förlora några ägg. Den återstående volymen bör vara ca 2-3 ml.
  10. Lägg 8-10 ml PBS till röret och upprepa ovanstående steg 2-3 More gånger för att tvätta äggen tills supernatanten är klar. Att bli av med resterande jäst är nyckeln i detta steg.
  11. Efter tvätt, dränera alla supernatanten tills kvarvarande volymen är 2 ml. Alikvotera 32 il ägg i CT flaskor med hjälp av en bred borrning pipettspets. Ägg i pipettspetsen ska vara kompakt, med liten eller ingen aspirerade vätskan. Detta kan uppnås genom införande av pipettspetsen djupt in i ägget uppgörelse och snabbt frigöra kolven för att aspirera.
  12. Placera seedade CT flaskor tillbaka i inkubatorn under flyga utveckling.

5. Insamling av åldersmatchade Vuxen Flies

  1. Vuxna kommer oftast eclose från dag 9 och framåt. Släng flugorna som uppstod den första dagen och flaskor placera tillbaka i inkubatorn över natten. Denna praxis kommer att undvika oavsiktlig val för tidiga emergents och möjliggöra insamling av ett maximalt antal synkroniserade flugor.
  2. 16-22 timmar senare överför de dagsgamla vuxen flyger into 10% SY mat flaskor. Vid behov, kan en annan sats samlas nästa dag.
  3. Retur flyger tillbaka till inkubatorn och låt flugor för att nå sexuell mognad och mate i två dagar. Anteckna dagen för överföring till 10% SY flaskor som den första dagen i vuxenlivet.

6. Sortering Flugor och Ställa in Longevity Experiment

  1. Söva små grupper av flugor på bedövningsmedlet pad, sedan sortera män och kvinnor i två grupper med en pensel. Om du använder CO 2, är det viktigt att minimera exponeringen för att förhindra eventuella långvariga hälsoproblem som kan äventyra integriteten i livslängd experimentet.
  2. Placera 30 flugor av samma kön i enskilda flaskor. Förutsatt att inga balansaxlar kromosomer i befolkningen och frisk avkomma bör varje flaska producera cirka 3-4 flaskor av vardera könet. Alikvotering flugor i enskilda flaskor bör inte ta mer än 3-4 minuter, så att totalt är flugor endast utsatta för anestesi för maximalt9-10 minuter.
  3. Upprepa steg 6,1-6,2 tills det är 8-10 injektionsflaska replikat för varje kön och experimentell behandling.

7. Installera Excel för att spåra livslängden Experiment

  1. Vi rekommenderar randomisera flaska position snarare än grupperar flaskor genom experimentell tillstånd för att undvika partiskhet i samband med flaskan plats i inkubatorn och att dölja flaskan identitet till försöksledaren. För att göra detta måste du först tilldela en randomiserad numerisk ID för varje flaska i ett kalkylprogram, och sedan ordna flaskorna i magasinen med ID-nummer. Om du använder dLife programvara experimentet hantering, följ tutorial på experimentet att generera ID-nummer för varje flaska.
  2. (Valfritt) Om du använder en RFID-läsare eller streckkodsläsare i samband med dLife, bifoga en RFID eller streckkod etikett på varje flaska och associera taggen med flaskan är numeriska ID i dLife. Programmet kommer att känna igen varje injektionsflaska när skannas med en läsareoch vägleda en att registrera data i rätt plats i ett kalkylblad. Användning av en tagg läsare i samband med dLife minskar kraftigt datainsamling tid och inspelning fel.

8. Underhålla Livslängd Experiment

Flaskorna innehåller färska livsmedel ska vara i rumstemperatur för varje överföring.

  1. Under försöksperioden, överföra flugor på nya flaskor som innehåller färska livsmedel var 2 dagar (unga kvinnor) eller 3 gånger i veckan (män eller kvinnor> 3 veckors ålder). Detta steg kommer att säkerställa att utfodring miljö för unga kvinnor inte störs av närvaron av larver. Denna överföring ska fyllas utan bedövning, vilket kan framkalla akut dödlighet, särskilt i äldre flugor (Pletcher, personliga observationer).
  2. Under varje flaska överföring spela ålder, räkna de döda flugor i den gamla flaskan, och de döda flugor som bärs till den nya flaskan. Registrera denna information separat itvå kolumner i ett kalkylblad (antingen dLife eller ditt eget kalkylblad). Detta kommer att säkerställa att de genomförs flugor är inte dubbelt räknade. Det totala antalet dödsfall (död + som) bör vara minst lika antalet utförda flugor från föregående överföringen. Subtrahera antal tidigare utförda flugor från det totala antalet dödsfall för att bestämma antalet nya dödsfall.
  3. En fluga anses höger censurerade om det lämnade experimentet innan naturlig död genom flykt eller oavsiktlig död. Djur som lämnar försöket på detta sätt bör föras in i en separat kolumn på dagen att flugan lämnade experimentet. Censurerade flugor bokförs inte som död (se nedan).
  4. Fortsätt att upprepa steg 8,1-8,2 till sista överlevande är död. Var medveten om att när flugor åldern kan vissa flugor ligga på rygg och förefaller dött på grund av deras inactiveness. Därför när man räknar genomförs (döda) flugor trycker på sidan av flaskorna för att avgöra om det finns benrörelser. Om så är fallet These flugor lever fortfarande. I de fall där flugorna fastnar i livsmedlet i den gamla flaskan men vid liv, bör de inte räknas som död och bör räddas av ytterligare knacka på injektionsflaskan för att lösgöra flugan. Censurera sådana flugor bör användas med försiktighet, eftersom det kan leda till experimentell partiskhet.

9. Dataanalys

  1. Den efterlevande kurvan visar sannolikheten för att en individ överlever en viss ålder och är typiskt beräknas med hjälp av en Kaplan-Meier-analys (figur 1) 8. I avsaknad av höger censurerade data kan formeln förenklas så att åldersspecifika överlevnad vid åldern x (Sx) bestäms genom att dividera antalet individer vid liv i början av en folkräkning tid på åldern x (N x) med det totala antalet flugor i experimentet (N 0), S x = N x / N 0. 9,2) survivorship kurvor är den vanligaste formen av datapresentation, och dekan testas för jämställdhet mellan grupper som använder ett log-rank test. Rimlig slutsats kan dras så få som 50-100 individer i en kohort. Efterlevande är en kumulativ mått, dock, och därför dödsfall som inte åldersrelaterade, såsom de tidigt i livet, kommer pressa överlevnad hela livet gör det svårt att konstatera effekter specifika för åldrande.
  2. En andra datavisualisering metod är åldersspecifika dödligheten funktion, som visar risken att dö genom varje åldersintervall och presenterar en mer nyanserad beskrivning av överlevnadsdata 9,10. Dödlighet åtgärder är oberoende av en ålder till en annan, och formen på dödligheten kurvan är användbar för härledning om dynamiken i åldrande, särskilt när behandlingar justeras under vuxenlivet. Uppskattningar av åldersspecifika dödligheten, men saknar både precision och noggrannhet med små urvalsstorlekar, och kräver ofta flera-till-många hundra personer per kohort för en tillförlitlig esultimata 11.
  3. Andra metoder för att uppskatta livslängden skillnader inkluderar parametriska (t.ex. Gompertz) och semi-parametriska (t.ex. Cox regression) modeller. Dessa modeller kan vara kraftfull men bör tillämpas med försiktighet på grund av de antaganden som gjorts om formen på dödlighet kurvorna och arten av behandlingseffekter, vilket kan leda till felaktig slutsats 11,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ett enklare system av protokollet presenteras i figur 1, där viktiga steg beskrivs. Synkroniseringen del av protokollet kan användas för olika analyser som kräver åldersmatchade vuxna flugor.

Typiska survivorship kurvorna för vildtyp flugor visas i figur 2a, med användning av programvaran dLife experimentet hantering (figur 2b, c). Vuxna hanar lever oftast kortare, med båda populationerna uppnå en genomsnittlig och median livslängd> 50 dagar på en 10% SY mat vid 25 ° C. Observera att efterlevande fortsatt hög i början av experimentet och minskar exponentiellt.

Drosophila livslängd påverkas av miljöförhållanden, såsom temperatur och kost. Figur 3a visar att vuxna män vanligtvis lever betydligt kortare när temperaturen ökar. Likaså är effekten av diet på livslängd presenteras i figur 3b

Tätheten av kohorter under utveckling kan påverka vuxna livslängd och ändra utvecklande timing. Här visar vi ett exempel på hur olika tätheter av synkroniserade ägg påverkar larver utveckling. Såsom visas i fig 4, är vuxen flyga utbyte dålig och maten ytan är känslig för torkning när antalet ägg är alltför låg. På andra änden av skalan, är larvutveckling fördröjs i överbefolkade flaskor, och utbytet av vuxna flugor minskar.

Den efterlevande kurva kohorten som helhet kan påverkas avsevärt genom avvikande ampull effekter, såsom visas i fig. 5. Oregelbundna överlevnadsdata för enskilda flaskor kan ha flera orsaker, till exempel dålig livsmedelskvalitet eller bakteriell / svamp ackumulering och infektion. Medan sådana anomala dödsfall cen skev befolkningen överlevnad åtgärden, det finns inte en enkel mått för lämplig bestämma att en flaska bör undantas från experimentet. Dessa situationer är därför bäst undvikas genom god hantering praxis och lindras med hjälp av ett stort urval storlek.

Figur 6 visar exempel på injektionsflaska förhållanden som kan leda till onormala dödsfall. I allmänhet bör alla tillstånd som kan leda till små sprickor där flugorna kan fastna och dö undvikas. Exempel innefattar: bubblor i livsmedlet, torrhet i livsmedlet som leder till krympning bort från flaskan vägg, och sprickbildning i livsmedlet visas i figur 5a (en mild exempel med en enda bubbla), figur 5b, och figur 5c, respektive . Överdrivet torrfoder, som visas i figur 5b och figur 5c bör noga vänt under överföring, eftersom maten kan rubba och kollapsa på de flugor i new flaskan. Bakterietillväxt på ytan av livsmedlet kan leda till infektion eller fysisk infångning och kan således öka dödligheten. Vissa bakterier på ytan av livsmedlet verkar transparenta och glänsande som om det finns svett från mat (inte visad), medan andra typer av bakterier kommer att manifestera som vita kolonier (Figur 5d). Injektionsflaskor med något av dessa tillstånd bör noteras och ytterligare beaktas när uppgifterna tolkas. I allmänhet har vi betona att noggrann uppmärksamhet på djurhållning i både larv och vuxen steg kan stödja livslängd och hälsa vuxna flugor och minska förekomsten av problem som leder till tvetydiga dödsorsakerna senare i livet.

Figur 1
Figur 1. Förenklat schema över en Drosophila livslängd analys.

"Figur Figur 2. (A) Representativa livslängd kurvor w 1118 kontroll hona (cirklar) och manliga (kvadrater) vuxen flyger vid 25 ° C på en SY10% mat. (B, C) Representativa skärmdumpar av dLife programvara.

Figur 3
Figur 3. Effekter av temperatur (A) och kost (B) på vuxna livslängd. A. Vuxen kontroll (Canton S) manliga flugor bibehölls genom vuxenlivet vid 18 ° C, 25 ° C eller 29 ° CB Vuxen reglering (w 1118) kvinnliga flugor exponerades för antingen en 15% SY eller 5% SY dieten.

Figur 4
Figur 4. Dag 9 av utveckling (vid 25 ° C) av synkroniserade ägg, alikvoterades i CT livsmedel flaskor. Volume av embryot som innehåller alikvot som visas under varje flaska.

Figur 5
Figur 5. Representant tomt från dLife mjukvaran visar överlevnad efter flaskan. Pilen indikerar en onormal flaska i en grupp.

Figur 6
Figur 6. Exempel på suboptimal livsmedelskvalitet. A. bubblor på maten yta. B. Livsmedel krympt bort från kanten av flaskan. C. Sprickor i livsmedlet. D. Bakterier samlas på ytan av livsmedlet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollet som presenteras här beskriver ett förfarande för framställning av reproducerbara mätningar av vuxen livslängd i Drosophila som är anpassningsbart för bedömning av genetiska, farmakologiska och miljömässiga åtgärder. Avgörande aspekterna av protokollet inkluderar noggrant kontrollera larver utvecklingsmiljö, minimera vuxna stress och minimera partiskhet över experimentella grupper och kontroller. Vi presenterar också användningen av dLife livslängd experimentet programvara. Genom att helt enkelt fästa en streckkod eller RFID-tagg till varje flaska kommer dLife programmet hjälpa datainsamling för varje mätning och plotta överlevnad kurvan. Även om det är för tillfället mest lämpliga för studier av fluga livslängd med flaskor kan detta experiment verktyg enkelt anpassas för användning i andra organismer, med olika typer av befolkningen kammare, eller för ytterligare åtgärder för överlevnad, däribland stresstålighet och läkemedelstoxicitet.

Pinuti huset påbörjas någon livslängd bedömning måste man först noggrant kontrollera produktionen av föräldrarnas lager. Genetisk variabilitet är en viktig faktor, liksom hälsa moderstammarna. Dessa faktorer har lett till betydande offentliga tvister i samband med tidiga studier som rapporterade förmodade livslängd regulatorer 13. Forskaren har flera alternativ för att minimera effekter hänförliga till variation i genetisk bakgrund. Av genetiska manipulationer bör alla genetiskt förändrade stammar bakgrundskorrigeras-kontrolleras genom antingen återkorsning med en kontrollgrupp stam (minst 6 gånger) eller använda inducerbara system (t.ex. temperaturkänsliga alleler eller drog-inducerbara transgenexpression). Den GeneSwitch och Tet-on system 14,15 är populära och medger direkt jämförelse av flugor med samma genetiska bakgrund som transgenen antingen induceras eller inte framkallas. För alla inducerbara system, lämpliga samtida kontroller för att undvika confounds associerad med induceraren. Oförmåga att kontrollera för genetisk bakgrund nästan alltid resulterar i hybrid vigör, vilket kan förlänga livslängden i F1-generationen av en korsning mellan två olika stammar av skäl som saknar samband med den avsedda manipulering 13. Denna faktor är särskilt oroande när du använder GAL4-UAS-system. Av miljöskäl ingripanden (t.ex. missbruksbehandling, kost, temperatur, etc.), är det lämpligt att studera effekterna av interventionen på mer än en stam. Slutligen kan både föräldrarna ålder 16 och stress 17 påverka livslängden hos F1 generationen, och därför bör friska unga vuxna väljas för äggproduktion.

Viktiga aspekter att styra larver / pupal miljö omfattar förebygga överbeläggning och upprätthållandet av en kontrollerad miljö med strikt reglering av ljus-mörker perioder, luftfuktighet och temperatur. Dessa faktorer kommer att påverka både tidpunkten för deveckling och den fysiska kvaliteten av de resulterande vuxna. Negativa larver miljöer, såsom hög densitet larver, kan leda till aktivering av stress-inducerbara faktorer (t.ex., värmechockprotein uttryck) som är kända för att påverka vuxna livslängd 18.

Under den vuxna fasen förblir noggrann uppmärksamhet till miljön nödvändig. Valet av enbart diet kan kraftigt påverka livslängd och kan interagera med genetiska faktorer för att producera kost-specifika effekter på livslängd. Dessutom kan några vanliga livsmedel bas alternativ (jästextrakt istället för frystorkat hela öljäst) förkorta dramatiskt livslängd 19, lämnar möjligheten öppen att maten själv orsakar organismbiologi stress som kan påverka bedömningen av livslängden. I den här artikeln har vi markerat potentiella källor till stress i kosten miljö inklusive fysiska avvikelser i livsmedel (t.ex. bubblor, skum, sprickor, bakterier, etc.) som kan physically snärja djuren. Regelbunden byte av gamla mat med färska livsmedel (minst tre gånger varje vecka) kan övervinna många av dessa svårigheter. Dessutom kan temperaturen 20, luftfuktighet (personliga observationer), belysning 21, och närvaron av artfränder (social miljö) 22 modulerar alla livslängd och uppmärksamhet att styra dessa faktorer i experimentet är viktigt att undvika snedvridning i resultaten. Medan antalet flugor i en injektionsflaska minskar med tiden, har vi funnit att användningen av anestesi för att justera antalet flugor kan öka dödligheten i en ålder-beroende sätt (Pletcher, personliga observationer), och vi vill inte rekommenderat detta förfarande. Den exakta positionen av flaskorna i en inkubator är också en faktor, även i en till synes kontrollerad miljö. Randomiserad fysisk distribution av experimentella grupper med kontroller kan minska fördomar i samband med flaskan placering och krävs för korrekt statistisk slutledning. Även mednoggrant kontrollerade förhållanden kan små skillnader observeras mellan experiment och användning av inom-experiment kontroller är viktigt.

Alternativa utfodring metoder har föreslagits för livslängden analys med en kapillär matare strategi (CAFE metoden) 23. Denna metod utmärker möjligheten att ge exakta mätningar av livsmedelskonsumtionen, men det resulterar i markant kortlivade flugor 24. Potentiella spänningar i samband med utfodring miljön måste beaktas vid bedömningen av kombinerade sambandet mellan kost och genetiska faktorer i den totala livslängd.

Demografisk analys, inklusive beräkning av efterlevande och dödlighet kurvorna kan avslöja mycket information om dynamiken i den åldrande befolkningen. En typisk efterlevande kurva kommer att förbli relativt platt under en lång tid tidigt i livet och öka graden av nedgång i äldre åldrar, vilket motsvarar en period av låg dödlighet followed av en period av en exponentiell ökning i mortalitet. En stressig miljö kommer vanligtvis manifesteras som ett överskott av tidiga dödsfall i befolkningen och en onormal dopp i överlevnad kurvan. Medan ett sådant resultat kan indikera signifikanta skillnader mellan behandlingarna, kommer det normalt inte vara robust för replikering. Vi rekommenderar därför minst två oberoende (dvs icke-samtidiga) upprepade experiment utföras innan bestämd slutsats dras. Det kan vara att ytterligare ansträngningar för att öka urvalets storlek, kontrollera djurhållning förhållanden och förbättra hälsan hos föräldrarnas lager krävs.

Högerklicka censurera (ta bort djur från experimentet att fly eller antas döda från oavsiktliga orsaker) av djur som dör av stressiga miljöer bör tillämpas med stor försiktighet. Strängt taget måste censurera ske slumpmässigt över experimentella behandlingar, och om den experimentella interventipå modulerar stressen känslighet, kan en använda oavsiktligt behandling nivå markeringen till befolkningen. Som en allmän regel, undvika förekomsten av faktorer som kan ge tvetydiga tidig död (främst associerad med föda) är bättre än censurera och censurera bör endast tillämpas på organismer som observerades att dö eller fly vid fysisk hantering.

En sista faktor är bedömningen av statistisk signifikans. Medan stora kohort urvalsstorlekar ger imponerande kraft att skilja små skillnader mellan behandlingarna måste den potentiella biologiska betydelsen av en sådan skillnad också övervägas. Med relativt stora livslängd experiment, skillnader så låga som 1-2% är ofta mycket statistiskt signifikant, men den totala effekten av interventionen på hälsostatusen kan vara små. Därför måste både statistisk och biologisk signifikans beaktas vid tolkningen av övergripande resultaten av försöket. Inferens om åldrandet från överlevnad experiment kan ökas genom åtgärder av åldersrelaterade nedgångar i beteendemässiga eller fysiologiska hälsan åtgärder, bland annat klättring förmåga 25 och gastrointestinala väggen integritet 7.

Sammanfattningsvis, Drosophila modellorganism en tilltalande val för att studera mekanismer för åldrande. Med noggrann experimentell teknik, kan robusta demografisk analys ge insikt i hur farmakologiska och genetiska faktorer på åldrandet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av medel från Ellison Medical Foundation (SDP, http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) och NIH R01AG030593 (SDP). Detta arbete utnyttjade resurserna i Drosophila Aging Core (DAC) i Nathan Shock Center of Excellence i biologi av åldrandet finansieras av National Institute of Aging P30-AG-013.283 ( http://www.nih.gov/ ). Författarna vill tacka Pletcher Laboratoriet för hjälp diskussioner och särskilt Brian Chung för kritisk läsning av manuskriptet. Vi vill tacka för Nick Asher och Kathryn Borowicz för hjälp med datainsamling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active Dry Yeast Fleishmann’s Yeast 2192
Grape Agar Powder Premix Genesee Scientific 47-102
Large Embryo Collection Cages Genesee Scientific 59-101
Large Replacement End Caps Genesee Scientific 59-103
6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene Genesee Scientific 32-130
Flugs Closures for Stock Bottles Genesee Scientific 49-100
Drosophila Vials, Wide, Polystrene Genesee Scientific 32-117
Flugs Closures for Wide Vials Genesee Scientific 49-101
Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul Denville Scientific P1105-CP
Flystuff Flypad, Standard Size Genesee Scientific 59-114
BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; Fisher Scientific 08-757-12
Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow Fisher Scientific 10-200-47
PBS pH 7.4 10x Invitrogen 70011044
Gelidium Agar Mooragar n/a
Brewer's Yeast MP Biomedicals 0290331280
Granulated Sugar Kroger n/a
Tegosept Genesee Scientific 20-266 Fly Food Preservative
Propionic Acid, 99% Acros Organics 149300025 Fly Food Preservative
Kanamycin Sulfate ISC BioExpress 0408-10G
Tetracycline HCl VWR 80058-724

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toivonen, J. M., et al. No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects. PLoS Genet. 3, e95 (2007).
  2. Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. Testing an 'aging gene' in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background. Aging Cell. 2, 123-130 (2003).
  3. Burnett, C., et al. Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila. Nature. 477, 482-485 (2011).
  4. Bokov, A. F., et al. Does reduced IGF-1R signaling in Igf1r+/- mice alter aging? PLoS One. 6, e26891 (2011).
  5. Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosophila Information Service. 34, 117-118 (1960).
  6. Skorupa, D. A., Dervisefendic, A., Zwiener, J., Pletcher, S. D. Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster. Aging Cell. 7, 478-490 (2008).
  7. Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metab. 14, 623-634 (2011).
  8. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 53, 457-481 (1958).
  9. Pletcher, S. D. Mitigating the Tithonus Error: Genetic Analysis of Mortality Phenotypes. Sci. Aging Knowl. Environ. 2002, pe14 (2002).
  10. Pletcher, S. D., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Why do life spans differ? Partitioning mean longevity differences in terms of age-specific mortality parameters. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 381-389 (2000).
  11. Promislow,, Tatar,, Pletcher,, Carey, Below-threshold mortality: implications for studies in evolution, ecology and demography. Journal of Evolutionary Biology. 12, 314-328 (1999).
  12. Pletcher, Model fitting and hypothesis testing for age-specific mortality data. Journal of Evolutionary Biology. 12, 430-439 (1999).
  13. Partridge, L., Gems, D. Benchmarks for ageing studies. Nature. 450, 165-167 (2007).
  14. Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 12602-12607 (2001).
  15. Ford, D., et al. Alteration of Drosophila life span using conditional, tissue-specific expression of transgenes triggered by doxycyline or RU486/Mifepristone. Exp. Gerontol. 42, 483-497 (2007).
  16. Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, 927-935 (2002).
  17. Smith, E. M., et al. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J. Nutr. 137, 2006-2012 (2007).
  18. Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. J. Insect Physiol. 47, 1301-1307 (2001).
  19. Bass, T. M., et al. Optimization of dietary restriction protocols in Drosophila. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1071-1081 (2007).
  20. Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1976).
  21. Pittendrigh, C. S., Minis, D. H. Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1537-1539 (1972).
  22. Joshi, A., Mueller, L. D. Adult crowding effects on longevity in Drosophila melanogaster: Increase in age-dependent mortality. Current Science. 72, 255-260 (1997).
  23. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 8253-8256 (2007).
  24. Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2498-2503 (2008).
  25. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
Mätning av livslängden i<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (71), e50068, doi:10.3791/50068 (2013).More

Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (71), e50068, doi:10.3791/50068 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter