Summary
Drosophila melanogaster è un organismo modello potente per esplorare le basi molecolari della regolazione longevità. Questo protocollo discuterà i passaggi necessari per generare una riproducibile, basato sulla popolazione, la misurazione della longevità e gli eventuali rischi potenziali e come evitarli.
Abstract
L'invecchiamento è un fenomeno che si traduce in costante deterioramento fisiologico in quasi tutti gli organismi in cui è stato esaminato, con conseguente riduzione delle prestazioni fisiche e aumento del rischio di malattia. Invecchiamento individuale si manifesta a livello di popolazione, come un aumento della mortalità età-dipendente, che viene spesso misurata in laboratorio osservando la durata della vita in ampie coorti di individui di pari età. Gli esperimenti che cercano di quantificare la misura in cui le manipolazioni genetiche o ambientali impatto durata della vita in organismi modello semplici hanno riscosso un notevole successo per la comprensione degli aspetti dell'invecchiamento che si conservano in taxa e per ispirare nuove strategie per estendere la durata della vita e la prevenzione della malattia associata all'età nei mammiferi .
La mosca dell'aceto, Drosophila melanogaster, è un organismo modello attraente per lo studio dei meccanismi di invecchiamento a causa della sua relativamente breve vita, allevamento conveniente, e la genetica facili.Tuttavia, le misure demografiche di invecchiamento, tra cui l'età-specifica e la mortalità, sono straordinariamente sensibili a variazioni anche minime nel disegno sperimentale e l'ambiente, e il mantenimento di pratiche di laboratorio rigorose per tutta la durata degli esperimenti di invecchiamento è richiesto. Queste considerazioni, insieme con la necessità di praticare un attento controllo dei background genetico, sono essenziali per la generazione di misure robuste. In effetti, ci sono molte controversie notevoli circondano inferenza da esperimenti longevità in lievito, vermi, mosche e topi che sono stati tracciati di artefatti ambientali o genetici 1-4. In questo protocollo, si descrive una serie di procedure che sono stati ottimizzati per molti anni per misurare la longevità in Drosophila con fiale di laboratorio. Abbiamo anche descrivere l'uso del software dLife, che è stato sviluppato dal nostro laboratorio ed è disponibile per il download ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / software). dLife accelera la produttività e promuovere le buone pratiche, integrando design ottimale sperimentale, semplificare la gestione e la raccolta dei dati mosca, e la standardizzazione delle analisi dei dati. Discuteremo anche le numerose insidie potenziali nella progettazione, raccolta e interpretazione dei dati di durata della vita, e mettiamo a disposizione misure per evitare questi pericoli.
Protocol
Si consiglia la conservazione di alimenti, pasta di lievito sperimentali, e piastre di agar uva che appaiono nel protocollo a 4 ° C e il loro utilizzo entro 1-2 mesi fino a quando la muffa e l'aridità non sono impostare in condizioni ambientali standard sia per la larve e adulti fase di manutenzione comportano mosche in un incubatore a 25 ° C con un ciclo luce 12:12 hr scuro e 60% di umidità relativa.
1. Preparazione di alimenti Sperimentale
- Per la crescita delle larve, si usa una versione modificata del Caltech Media 5, che è abbreviato in questo protocollo come CT.
- Si consiglia una dieta per adulti Drosophila (SY), che consiste di zucchero (saccarosio) e lievito (lievito liofilizzato di birra intero) in una base di agar al 2%, che è stata bollita, integrato con antibiotici e anti-fungine agenti, e distribuito (10 ml per flaconcino) 6. Alimentare dovrebbe essere consentito di solidificare e far evaporare per 12-24 ore prima del rimessaggio. Perché l'ambiente nutriente può sostanzialmente longevità impatto, la coerenza nei processi di cottura è essenziale sia all'interno di un esperimento e per il confronto tra esperimenti.
- Se un agente farmacologico deve essere aggiunto al cibo per adulti, questo farmaco può essere miscelato in un piccolo lotto di alimenti e stratificato (2 ml) sulla superficie alimentare, con le fiale di controllo ricevono strati contenenti il solo veicolo.
2. Preparazione di una pasta di lievito vivo
Unire 5-6 ml di acqua con 3 g di lievito secco attivo e mescolare bene. La consistenza della pasta di lievito dovrebbe essere quella di un burro di arachidi liscia.
3. Preparazione di una piastra di agar Grape
- Aggiungere un pacchetto di una premiscela agar uva in 500 ml di acqua distillata in un matraccio tarato da 1000 ml e seguire le istruzioni sulla confezione di sciogliere l'uvaggio agar.
- Versare con cautela uno spesso strato della miscela in piastre di Petri da 100 mm, evitando la formazione di bolle. Una bustina di premix produce circa 14 grape piastre di agar.
- Ai media raffreddare e solidificare a temperatura ambiente con coperchi per 15 min. Piastre può essere conservato a 4 ° C, avvolto nella pellicola, o utilizzato immediatamente.
4. Raccolta di uova sincronizzato
Tutti i mezzi utilizzati in questo protocollo, vale a dire lievito, piastre di agar uva, CT e il 10% il cibo SY, devono essere a temperatura ambiente.
- Stendere uno strato di 2-3 cm di diametro di lievito in pasta su una piastra di agar uva e mettere da parte.
- Mettere una grande gabbia di raccolta delle uova su un CO 2 pad con la maglia sul lato verso il basso per anestetizzare le mosche. A base di azoto anestesia è un'alternativa a CO 2, utilizzato da alcuni laboratori, che può produrre risultati di alta qualità 7.
- Usando un imbuto, trasferire 150-200 coppie di mosche nella gabbia raccolta delle uova.
- Posizionare la piastra di agar dell'uva per coprire l'estremità aperta della gabbia e fissare con un cappuccio terminale.
- Posare la gabbia su un lato fino mosche svegliarsi.Quindi, assicurarsi che il gabbia uva lato piastra di agar verso il basso, in incubatrice durante la notte.
- Il giorno dopo, scambiare la piastra d'uva con una piastra di uva appena yeasted. Solo mettere circa 1 cm di diametro di pasta di lievito sulla superficie della piastra. Eliminare il giorno 1 ° piatto d'uva.
- Lasciare embrioni a raccogliersi sulla superficie della piastra di agar uva per 16-22 ore. Una volta fatto, raccogliere l'uva piastra agar ed eliminare le mosche padre.
- Lavare la superficie delle piastre di agar uva con 1x tampone fosfato isotonico (PBS). Le uova possono essere trasferite da raschiando delicatamente con un batuffolo di cotone. Fare attenzione a non graffiare, danneggiare o raschiare sottili pezzi di agar sulla superficie della piastra. Con l'aiuto di un imbuto, versare le uova lavate in una provetta conica da 15 ml.
- Lasciate che le uova si depositano sul fondo della provetta e versare il surnatante, facendo attenzione a non perdere tutte le uova. Il volume rimanente dovrebbe essere di circa 2-3 ml.
- Aggiungere 8-10 ml di PBS al tubo e ripetere il precedente passo 2-3 morvolte posta di lavare accuratamente le uova fino a quando il surnatante è chiara. Come liberarsi di lievito residuo è la chiave in questa fase.
- Dopo il lavaggio, prosciugare surnatante fino rimanente volume è di 2 ml. Aliquotare 32 pl di uova in bottiglie CT con un ampio foro punta della pipetta. Uova nel puntale della pipetta deve essere compatto, con poco o nessun liquido aspirato. Questo può essere ottenuto inserendo la punta della pipetta profondità nella composizione uovo e rilasciando lo stantuffo per aspirare.
- Luogo testa di serie CT imbottiglia torna in incubatrice durante tutto lo sviluppo mosca.
5. Raccolta di pari età Adulto Flies
- Gli adulti in genere Eclose dal giorno 9 in poi. Eliminare le mosche emerse il primo giorno e bottiglie posto di nuovo in incubatrice durante la notte. Questa pratica sarà evitare la selezione involontaria per Emergents precoci e consentire la raccolta di un numero massimo di mosche sincronizzati.
- 16-22 ore più tardi, trasferire il giorno di vita adulto vola into 10% SY alimentari bottiglie. Se necessario, un altro lotto possono essere raccolti il giorno successivo.
- Ritorno vola di nuovo nel incubatore e consentire in linea per raggiungere la maturità sessuale e compagno per due giorni. Registrare il giorno del trasferimento al 10% bottiglie SY come il primo giorno di adulta.
6. Ordinamento mosche e impostazione esperimento Longevità
- Anestetizzare piccoli gruppi di mosche sul pad anestetico, poi maschi e femmine di ordinamento in due gruppi utilizzando un pennello. Se si utilizza CO 2, è fondamentale ridurre al minimo l'esposizione di prevenire possibili duraturi problemi di salute che possono compromettere l'integrità dell'esperimento longevità.
- Posto 30 mosche dello stesso sesso in fiale singole. Supponendo che non cromosomi bilanciatori nella popolazione e progenie sana, ogni bottiglia dovrebbe produrre circa 3-4 fiale di ciascun sesso. Aliquotandolo mosche in fiale singole non dovrebbe richiedere più di 3-4 minuti, in modo che, in totale, le mosche sono solo esposti ad anestesia per un massimo di9-10 min.
- Ripetere i passaggi 6,1-6,2 fino a quando ci sono 8-10 flacone replicati per ogni genere e trattamento sperimentale.
7. Impostazione del foglio di calcolo Excel per tenere traccia dell'esperimento Longevità
- Si consiglia di randomizzazione posizione fiala piuttosto che fiale di raggruppamento di condizioni sperimentali, al fine di evitare distorsioni associate alla posizione flaconcino in incubatrice e di oscurare l'identità fiala per lo sperimentatore. Per fare questo, prima assegnare un ID numerico casuale ad ogni flacone in un programma di foglio di calcolo, quindi disporre i flaconi in vassoi per numero ID. Se si utilizza il software di esperimento dLife gestione, seguire il tutorial sulla configurazione di esperimento per generare il numero di ID per ogni flacone.
- (Facoltativo) Se si utilizza un lettore di RFID o lettore di codici a barre in associazione con dLife, collegare un codice a barre o tag RFID per ogni flacone e associare l'etichetta con l'ID numerico del flaconcino in dLife. Il programma riconosce ogni flacone durante la scansione con un lettoree guidare uno per registrare i dati nella posizione corretta in un foglio. Utilizzo di un lettore di tag in combinazione con dLife riduce significativamente il tempo di raccolta di dati e l'errore di registrazione.
8. Mantenere l'esperimento Longevità
Le fiale contenenti alimenti freschi devono essere a temperatura ambiente per ogni trasferimento.
- Durante il periodo di sperimentazione, mosche trasferimento su nuovi flaconi contenenti cibo fresco ogni 2 giorni (donne giovani), o 3 volte a settimana (maschi o femmine> 3 settimane di età). Questo passaggio farà in modo che l'ambiente di alimentazione per le femmine giovani non viene interrotto dalla presenza di larve. Questo trasferimento dovrebbe essere completato senza anestesia, che può indurre la mortalità acuta, in particolare nei vecchi mosche (Pletcher, osservazioni personali).
- Nel corso di ogni flacone di trasferimento, registrare l'età, contare le mosche morte nel flacone vecchio, e le mosche morte che vengono trasportati al nuovo flacone. Registrare tali informazioni separatamente neldue colonne in un foglio di calcolo (sia dLife o il tuo foglio di calcolo). Questo farà sì che le mosche non sono effettuati due volte. Il numero totale di morti (morti + effettuata) dovrebbe almeno uguale al numero di mosche effettuate dal trasferimento precedente. Sottrarre il numero di mosche precedentemente svolte dal numero totale di decessi per determinare il numero di morti nuove.
- Una mosca è considerata destro censurata se lasciato l'esperimento prima della morte naturale attraverso la fuga o la morte accidentale. Animali in uscita l'esperimento in questo modo deve essere inserito in una colonna a parte il giorno in cui la mosca è uscito l'esperimento. Mosche censurati non sono registrati come morti (vedi sotto).
- Continuare a ripetere i passaggi 8,1-8,2 fino a quando l'ultimo sopravvissuto è morto. Essere consapevoli del fatto che, come l'età mosche, alcune mosche può mentire sulla schiena e sembrano morti a causa della loro inactiveness. Pertanto, quando il conteggio mosche realizzate (morto), toccare il lato delle fiale per determinare se ci sono movimenti delle gambe. Se è così, thesmosche E sono ancora vivi. Nel caso in cui rimangono attaccate mosche per il cibo nel flaconcino vecchio ma vivo, non devono essere considerate come morta e deve essere salvato da un'ulteriore maschiatura del flaconcino per rimuovere al volo. Censura mosche dovrebbero essere usati con cautela in quanto può causare pregiudizi sperimentale.
9. Analisi dei dati
- La curva di sopravvivenza mostra la probabilità che un individuo sopravvive a una certa età ed è di solito calcolato utilizzando un metodo Kaplan-Meier (Figura 1) 8. In assenza di dati censurati destro, la formula può essere semplificata in modo tale che l'età-specifica sopravvivenza all'età x (x S) è determinata dividendo il numero di individui viventi all'inizio di un tempo censimento all'età x (N x) per il numero totale di mosche nell'esperimento (N 0); S x = x N / N 0. 9.2) le curve di sopravvivenza sono la forma più comune di presentazione dei dati, epuò essere testato per la parità tra i gruppi con un log-rank test. Ragionevole deduzione si può trarre da un minimo di 50-100 individui in una coorte. Sopravvivenza è una misura cumulativa, tuttavia e quindi morti che non sono legate all'invecchiamento, come quelli nella prima infanzia, si deprimono sopravvivenza per tutta la durata rendendo difficile riscontrare specifici all'invecchiamento.
- Un secondo metodo di visualizzazione dei dati è l'età-specifica funzione di mortalità, che visualizza il rischio di morire per ogni intervallo di età e presenta una descrizione più sfumata dei dati di sopravvivenza 9,10. Misure mortalità sono indipendenti da un'età all'altra, e la forma della curva di mortalità è utile per inferenza circa le dinamiche di invecchiamento, in particolare quando i trattamenti sono regolate durante la vita adulta. Le stime di mortalità specifica per età, tuttavia, mancano sia la precisione e l'accuratezza con campioni di piccole dimensioni, e spesso richiedono molti-a-molti centinaia di individui per coorte per un es affidabiletimate 11.
- Altri metodi per la stima delle differenze di longevità sono parametrici (ad esempio Gompertz) e semi-parametrici (ad esempio, della regressione di Cox) modelli. Questi modelli possono essere potenti, ma deve essere applicato con cautela a causa delle ipotesi formulate circa la forma delle curve di mortalità e la natura degli effetti del trattamento, che potrebbe portare a deduzione errata 11,12.
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Representative Results
Uno schema semplificato del protocollo viene presentata in figura 1, dove sono riportate passaggi chiave. La parte del protocollo di sincronizzazione può essere utilizzato per vari metodi che richiedono mosche adulte pari età.
Curve di sopravvivenza tipiche di wild-type mosche sono mostrati in figura 2a, utilizzando il software di gestione dLife esperimento (Figura 2b, c). Maschi adulti di solito vivono più breve, con entrambe le popolazioni conseguire una longevità medio e mediano di> 50 giorni su un alimento SY 10% a 25 ° C. Si noti che la sopravvivenza rimane alta nella prima parte dell'esperimento e poi declina in modo esponenziale.
Drosophila durata è influenzata dalle condizioni ambientali, come la temperatura e la dieta. Figura 3a mostra che i maschi adulti vivono tipicamente marcatamente più breve temperatura viene aumentata. Allo stesso modo, l'effetto della dieta sulla durata è presentato in Figura 3b
La densità delle coorti durante lo sviluppo può influenzare la durata della vita degli adulti e modificare tempi di sviluppo. Qui vi mostriamo un esempio di come diverse densità di uova sincronizzati influenzare lo sviluppo larvale. Come mostrato in figura 4, mosca resa adulto è scarsa e la superficie cibo è suscettibile di asciugatura quando il numero di uova è troppo basso. All'altra estremità dello spettro, sviluppo larvale è ritardata in sovraffollati bottiglie, e la resa di mosche adulte è ridotta.
La curva di sopravvivenza della coorte nel suo complesso può essere influenzata in misura significativa dalla fiala effetti anomali, come mostrato in Figura 5. Dati di sopravvivenza irregolari per fiale individuali possono avere diverse cause, come ad esempio la qualità del cibo scadente o batteri / funghi accumulo e l'infezione. Anche se tali decessi anomali cun inclinare la misura sopravvivenza della popolazione, non esiste una metrica semplice per determinare in modo appropriato che un flaconcino deve essere escluso dall'esperimento. Queste situazioni sono quindi meglio evitare di buone pratiche di manipolazione e attenuati utilizzando un campione di grandi dimensioni.
Figura 6 mostra esempi di condizioni fiala che possono portare a morti anomale. In generale, qualsiasi condizione che può portare a piccoli crepacci dove mosche possono rimanere bloccate e morire deve essere evitato. Esempi includono: bolle nella secchezza alimentare, nel cibo che porta al restringimento dalla parete flaconcino, e screpolature nel cibo sono mostrati in figura 5a (un esempio mite con una bolla singola), figura 5b, e la Figura 5c, rispettivamente . Alimentare eccessivamente secca, come mostrato nella figura 5b e 5c Figura devono essere attentamente capovolte durante i trasferimenti, come il cibo può rimuovere e crollare sugli mosche in new flaconcino. La crescita batterica sulla superficie del cibo può causare infezioni o intrappolamento fisico e quindi può aumentare la mortalità. Alcuni batteri sulla superficie del cibo appare trasparente e brillante come se vi è sudore dal cibo (non mostrato), mentre altri tipi di batteri si manifesterà come colonie bianche (figura 5d). Flaconcini che presentino una delle seguenti condizioni devono essere annotate e ulteriormente presa in considerazione quando i dati vengono interpretati. In generale, si sottolinea che la cura di allevamento in entrambi gli stadi larvali e adulti in grado di supportare la longevità e la salute delle mosche adulte e ridurre l'insorgenza di problemi che portano a cause ambigue di morte in età avanzata.
Figura 1. Schematica semplificata di un saggio di Drosophila durata.
Figura 2. (A) Rappresentante curve di durata di vita della femmina di controllo w 1118 (cerchi) e maschile (quadrati) adulti vola a 25 ° C su un alimento SY10%. (B, C) schermo scatti rappresentativi del software dLife.
Effetti Figura 3. Di temperatura (A) e la dieta (B) sulla durata della vita degli adulti. A. adulti di controllo (Cantone S) mosche di sesso maschile sono stati mantenuti fino all'età adulta a 18 ° C, 25 ° C o 29 ° di controllo per adulti CB (w 1118) mosche femmine sono stati esposti sia a un 15% o 5% SY SY dieta.
Figura 4. 9 ° giorno di sviluppo (a 25 ° C) di uova sincronizzati, aliquotati in bottiglie alimentari CT. Volume dell'embrione contenente aliquota è mostrata sotto ogni bottiglia.
Figura 5. Trama Rappresentante dal software dLife mostrando una sopravvivenza da flaconcino. La freccia indica un singolo flaconcino anomala all'interno di un gruppo.
Figura 6. Esempi di qualità alimentare non ottimale. A. Bolle sulla superficie degli alimenti. Alimenti B. ridotta distanza dal bordo della fiala. C. Crepe nel cibo. Batteri D. accumulo sulla superficie del cibo.
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Discussion
Il protocollo qui presentato descrive un metodo per produrre misurazioni riproducibili di longevità adulto in Drosophila che è adattabile per la valutazione di interventi farmacologici, genetici e ambientali. Aspetti cruciali del protocollo includono controllando attentamente l'ambiente di sviluppo larvale, riducendo al minimo lo stress degli adulti, e riducendo al minimo polarizzazione tra gruppi sperimentali e di controllo. Presentiamo anche l'utilizzo del software di gestione dell'esperimento dLife vita. Con un semplice collegamento di un codice a barre o tag RFID ad ogni flacone, il programma dLife aiuterà nell'acquisizione dati per ciascuna misura e nel tracciare la curva di sopravvivenza. Anche se in questo momento è più adatto per gli studi di mosca vita con fiale, questo strumento di gestione esperimento potrebbe essere facilmente adattato per l'uso in altri organismi, con diverse tipologie di camere di popolazione, o per misure aggiuntive di sopravvivenza, tra cui la resistenza allo stress e la tossicità dei farmaci.
Priore di iniziare qualsiasi valutazione longevità, si deve prima controllare attentamente la produzione delle scorte dei genitori. Variabilità genetica è un fattore importante, in quanto è la salute dei ceppi parentali. Questi fattori hanno portato ad una notevole polemica pubblica associata con i primi studi che hanno riportato le autorità di regolamentazione longevità putativi 13. Il ricercatore ha diverse opzioni per ridurre al minimo gli effetti attribuibili alla variabilità dei background genetico. Per le manipolazioni genetiche, tutti i ceppi geneticamente modificati dovrebbe tenere conto del fondo controllata attraverso sia reincrocio ad un ceppo di controllo (almeno 6 volte) o con sistemi inducibili (ad esempio, alleli sensibili alla temperatura o farmaco-inducibile espressione del transgene). Il GeneSwitch e Tet-on sistemi 14,15 sono molto popolari e permettere il confronto diretto di mosche con lo stesso background genetico in cui il transgene è o indotto o non indotta. Per tutti i sistemi inducibili, adeguati controlli contemporanee sono tenuti ad evitare confounds associata con l'induttore. Il mancato controllo di background genetico quasi sempre si traduce in vigore ibrido, che possono estendere la durata della vita nella generazione F1 di un incrocio tra due ceppi diversi per ragioni non correlate alla manipolazione previsto 13. Questo fattore è di particolare interesse quando si utilizza il GAL4 UAS-sistema. Per interventi ambientali (ad esempio, il trattamento farmacologico, dieta, temperatura, ecc), si consiglia di studiare gli effetti dell'intervento su più di un ceppo. Infine, entrambi 16 anni genitori 17 e lo stress può influenzare la longevità della generazione F1, e per questo motivo, giovani adulti sani dovrebbe essere scelto per la produzione di uova.
Aspetti importanti di controllo della larva / pupa ambiente di includere la prevenzione del sovraffollamento e il mantenimento di un ambiente controllato con rigorosa disciplina dei periodi di luce-buio, umidità e temperatura. Questi fattori influenzano sia i tempi di development e la qualità fisica degli adulti risultanti. Avversi ambienti larvali, come ad alta densità larvale, può portare all'attivazione di fattori di stress-inducibile (per esempio, shock termico espressione proteica), che sono noti per influenzare la longevità degli adulti 18.
Durante la fase adulta, attenzione per l'ambiente rimane essenziale. La scelta della dieta da sola può notevolmente influenzare la durata della vita e può interagire con i fattori genetici per produrre effetti specifici dieta sulla longevità. Inoltre, alcuni comuni alternative di base alimentari (estratto di lievito al posto del lievito di birra liofilizzato intero) può ridurre drasticamente la durata della vita 19, lasciando aperta la possibilità che il cibo in sé sta causando stress organismal che può compromettere la valutazione della longevità. In questo articolo, abbiamo evidenziato le potenziali fonti di stress in ambiente alimentare comprese anomalie fisiche nel settore alimentare (ad esempio, le bolle, schiuma, crepe, batteri, ecc) che possono physically intrappolare gli animali. La sostituzione regolare del vecchio cibo con il cibo fresco (almeno tre volte alla settimana), in grado di superare molte di queste difficoltà. Inoltre, temperatura 20, umidità (osservazioni personali), illuminazione 21, e la presenza di conspecifici (ambiente sociale) 22 possono modulare la durata, e attenzione al controllo di questi fattori durante l'esperimento è importante per evitare distorsioni nei risultati. Mentre il numero delle mosche all'interno di una fiala diminuisce con il tempo, abbiamo trovato che l'uso di anestesia per regolare il numero di mosche può aumentare la mortalità in età-dipendente (Pletcher, osservazioni personali), e non si raccomanda questa procedura. La posizione precisa dei flaconi in un incubatore è anche un fattore, anche in un ambiente apparentemente controllato. Randomizzato distribuzione fisica dei gruppi sperimentali con controlli in grado di attenuare polarizzazione associato con il posizionamento fiala ed è necessario per una corretta inferenza statistica. Anche concondizioni attentamente controllate, lievi differenze possono essere osservate tra esperimenti e l'uso di entro-esperimento controlli è essenziale.
Approcci alternativi di alimentazione sono stati proposti per l'analisi durata tra un approccio alimentatore capillare (metodo CAFE) 23. Questo metodo si distingue per la capacità di fornire misure precise del consumo di cibo, ma il risultato e marcatamente di breve durata mosche 24. Sottolinea potenziali associati con l'ambiente di alimentazione deve essere considerato nel valutare il rapporto combinato tra dieta e fattori genetici della longevità complessiva.
Analisi demografica, compreso il calcolo di sopravvivenza e le curve di mortalità può rivelare molte informazioni circa la dinamica della popolazione. Una tipica curva di sopravvivenza rimarrà relativamente piatta per un lungo periodo precoce della vita e aumentare il tasso di declino in età avanzata, che corrisponde ad un periodo di f bassa mortalitàsusseguono da un periodo di un aumento esponenziale della mortalità. Un ambiente stressante volontà manifesta di solito come un eccesso di morti premature nella popolazione e un tuffo nella curva anomala sopravvivenza. Mentre un tale risultato può indicare differenze significative tra i trattamenti, non sarà normalmente robusto per la replica. Si consiglia pertanto di almeno due indipendenti (vale a dire, non contemporanee) replicate gli esperimenti devono essere eseguiti prima di ogni conclusione definitiva sono disegnate. Può essere che sforzo supplementare verso l'aumento delle dimensioni del campione, il controllo delle condizioni di allevamento, e migliorare la salute degli stock dei genitori è richiesto.
Destro censura (ritiro degli animali dalla fuga o esperimento che si presume siano morti per cause accidentali) di animali che muoiono a causa di stressanti condizioni ambientali devono essere applicate con estrema cautela. A rigor di termini, la censura deve avvenire in modo casuale attraverso trattamenti sperimentali, e se la sperimentazione Interventiil modula sensibilità stress, si potrebbe applicare un trattamento inavvertitamente livello selezione alla popolazione. Come regola generale, evitando la presenza di fattori che potrebbero produrre ambigua morte precoce (associato principalmente alla fonte di cibo) è meglio di censura, e la censura deve essere applicata solo per gli organismi che si erano dimostrati morire o fuggire durante la movimentazione fisica.
Una considerazione finale è la valutazione di significatività statistica. Mentre le grandi dimensioni del campione di coorte forniscono una potenza impressionante di distinguere piccole differenze tra i trattamenti, il significato potenziale biologico di tale differenza deve essere considerato. Con esperimenti di longevità di dimensioni ragionevoli, le differenze di appena 1-2% sono spesso statisticamente molto significativa, ma l'impatto complessivo dell'intervento sullo stato di salute può essere minore. Pertanto, sia la significatività statistica e biologici devono essere considerati quando si interpretano i risultati complessivi della sperimentazione. Inferenza sul processo di invecchiamento da esperimenti di sopravvivenza può essere aumentata da misure di legati all'età declino produttivo di misure sanitarie comportamentali o fisiologici, tra cui arrampicata capacità di 25 e l'integrità della parete gastrointestinale 7.
In sintesi, l'organismo modello Drosophila una scelta attraente per studiare i meccanismi di invecchiamento. Con un'attenta tecnica sperimentale, fondata analisi demografica può fornire indicazioni in l'impatto dei fattori genetici e farmacologici sul processo di invecchiamento.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Fondazione Ellison Medical (SDP, http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) e NIH R01AG030593 (SDP). Questo lavoro ha utilizzato le risorse del Aging Drosophila Core (DAC) del Centro di Eccellenza Nathan Shock nella biologia dell'invecchiamento finanziato dal National Institute of Aging P30-AG-013283 ( http://www.nih.gov/ ). Gli autori desiderano ringraziare il Laboratorio Pletcher per le discussioni utili e, in particolare Brian Chung per la lettura critica del manoscritto. Si desidera ringraziare Nick Asher e Kathryn Borowicz per l'assistenza con la raccolta dei dati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Fleishmann’s Yeast | 2192 | |
| Grape Agar Powder Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Large Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Large Replacement End Caps | Genesee Scientific | 59-103 | |
| 6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Flugs Closures for Stock Bottles | Genesee Scientific | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide, Polystrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Flugs Closures for Wide Vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul | Denville Scientific | P1105-CP | |
| Flystuff Flypad, Standard Size | Genesee Scientific | 59-114 | |
| BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow | Fisher Scientific | 10-200-47 | |
| PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 | |
| Gelidium Agar | Mooragar | n/a | |
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals | 0290331280 | |
| Granulated Sugar | Kroger | n/a | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-266 | Fly Food Preservative |
| Propionic Acid, 99% | Acros Organics | 149300025 | Fly Food Preservative |
| Kanamycin Sulfate | ISC BioExpress | 0408-10G | |
| Tetracycline HCl | VWR | 80058-724 |
References
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