Summary
דרוזופילה melanogaster הוא אורגניזם מודל רב עצמה לחקר הבסיס המולקולרי של ויסות אריכות ימים. פרוטוקול זה יעסוק השלבים הכרוכים ביצירת מדידה לשחזור, המבוסס על אוכלוסייה של אריכות ימים, כמו גם בעיות פוטנציאליות וכיצד להימנע מהם.
Abstract
הזדקנות היא תופעה שגורם להידרדרות פיזיולוגית מתמדת בכל כמעט אורגניזמים שבו זה כבר נבדק, מוביל לביצועים פיסיים מופחתים ועלייה בסיכון למחלה. הזדקנות אדם היא מניפסט ברמת האוכלוסייה כעלייה בתמותה תלויה גיל, אשר לעתים קרובות שנמדדה במעבדה על ידי התבוננות תוחלת חיים בקבוצות גדולות של אנשי גיל מתאים. ניסויים המבקשים לכמת את המידה שבה גנטית או סביבתית מניפולציות השפעת תוחלת החיים באורגניזמים מודל פשוטים הייתה מוצלחת להפליא להבנת ההיבטים של הזדקנות, הנשמרים על פני מינים ועל אסטרטגיות חדשות להארכת תוחלת חיים מעוררי השראה ומניעת גיל הקשורים למחלה ביונקים .
זבוב החומץ, דרוזופילה melanogaster, הוא אורגניזם מודל אטרקטיבי לחקר מנגנוני הזדקנות, בשל אורך חיים הקצרים יחסית, גידול נוח, ושטחית גנטיקה.עם זאת, צעדים דמוגרפיים של הזדקנות, כולל הישרדות גיל ספציפי ותמותה, הם רגישים במיוחד אפילו שינויים קלים בעיצוב וסביבה ניסיוניים, והתחזוקה של נהלים מחמירים למעבדת משך ניסויי הזדקנות נדרשה. שיקולים אלה, יחד עם הצורך לתרגל שליטה קפדנית של רקע גנטי, הם חיוניים ליצירת מדידות חזקות. ואכן, יש הרבה מחלוקות בולטות המקיפות היקש מניסויי מאריך חיים בשמרים, תולעים, זבובים ועכברים שהיו לייחס לחפצים סביבתיים או גנטיים 1-4. בפרוטוקול זה, אנו מתארים מערכת הנהלים שהיו מותאמים לאורך שנים רבות של מדידת אריכות ימים בדרוזופילה באמצעות בקבוקוני מעבדה. גם אנו מתארים את השימוש בתוכנת dLife, אשר פותח על ידי המעבדה שלנו, והוא זמין להורדה (http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / תוכנה). dLife מאיץ את התפוקה ומקדמת שיטות עבודה טובות בעיצוב ניסיוני אופטימלי שילוב, פישוט טיפול זבוב ואיסוף נתונים, ניתוח נתונים ותקנון. נדונונו גם את החסרונות הפוטנציאליים רבים בתכנון, איסוף, ופרשנות של נתוני תוחלת חיים, ואנו מספקים צעדים כדי למנוע סכנות אלה.
Protocol
אנו ממליצים אחסון מזונות ניסיוניים, רסק שמרים, וצלחות אגרו ענבים המופיעים בפרוטוקול ב 4 ° C ושימוש בם תוך 1-2 חודשים, כל עוד עובש ויובש לא להגדיר פנימה תנאים סביבתיים רגילים לזחל והן למבוגרים לביים כרוך תחזוקה של זבובים בחממה ב 25 ° C עם מחזור 12:12 שעתי אור חושך ולחות יחסית 60%.
1. הכנת מזון ניסויי
- להתפתחות רימות, אנו משתמשים modified קלטק בינוני 5, וזה מצוין בפרוטוקול זה כCT.
- אנו ממליצים על תזונה למבוגרת דרוזופילה (ש"י) שמורכבת מסוכר (סוכרוז) ושמרים (שמרים שלם שיכר lyophilized) בשיעור של 2% בסיס אגר, כי כבר רתח, בתוספת אנטיביוטיקה ותרופות אנטי פטרייתי, והופצנו (10 מ"ל לבקבוקון) 6. מזון צריך להיות מותר כדי לגבש ומתאדה ל12-24 שעות לפני האחסון. משום שהסביבה התזונתית יכולה substantially אריכות השפעה, עקביות בתהליכי בישול היא חיונית גם בתוך ניסוי ולהשוואה בין ניסויים.
- אם תרופתי הוא שיש להוסיף למזון למבוגר, תרופה זו יכולה להיות מעורבת לתוך יצווה קטנה של מזון ושכבתי (2 מ"ל) על פני האוכל, עם צלוחיות בקרה המקבלים שכבות המכילות רכב לבדו.
2. הכנת דבק שמרים חי
שלב 5-6 מיליליטר מים עם 3 גרם של שמרים יבשים פעילים ומערבב היטב. העקביות של רסק השמרים צריכה להיות זה של חמאת בוטנים חלקה.
3. הכנת צלחת אגרה ענבים
- הוסף חבילת premix אגר בענבי 500 מ"ל של מים מזוקקים בבקבוק 1000 מ"ל ובצע את ההוראות שעל השקית לפזר את התערובת אגרה ענבים.
- זהירות לשפוך שכבה עבה של התערובת לתוך צלחות פטרי 100 מ"מימ תוך הימנעות היווצרות בועה. מנה אחת premix מייצרת כ 14 graצלחות אגר PE.
- בואו התקשורת להתקרר ולהתמצק בטמפרטורת חדר עם מכסים למשך 15 דקות. צלחות יכולות להיות כל זמן ב 4 ° C, עטוף בניילון נצמד, או בשימוש באופן מיידי.
4. אוסף של ביצים מסונכרנות
כל כלי התקשורת בשימוש בפרוטוקול זה, שמרים כלומר, צלחות אגרו ענבים, CT ו 10% מזון ש"י, צריכה להיות בטמפרטורת חדר.
- מורחי שכבת 2-3 סנטימטר קוטר של שמרים להדביק על צלחת אגרה ענבים ומניחים בצד.
- הצב כלוב אוסף ביצה גדולה על משטח CO 2 עם הרשת בצד למטה כדי להרדים את הזבובים. הרדמת חנקן מבוסס היא חלופה לCO 2, בשימוש על ידי מעבדות מסוימות, שיכול להפיק תוצאות באיכות גבוהה 7.
- השתמש במשפך, להעביר 150-200 זוגות של זבובים לכלוב איסוף הביצים.
- הנח את הצלחת אגרה ענבים כדי לכסות את הקצה הפתוח של הכלוב ולאבטח עם כובע סוף.
- הנח את הכלוב בצד הדרך עד זבובים מתעוררים.לאחר מכן, לשמור את כלוב צד הצלחת, הענבים אגרו למטה, בחממה בן לילה.
- ביום המחרת, להחליף את צלחת ענבים עם צלחת ענבים חדשים yeasted. לשים רק על 1 סנטימטר קוטר של רסק שמרים על פני השטח של הצלחת. השלך את צלחת ענבי יום 1 st.
- אפשר לאסוף עוברים על פני השטח של הצלחת אגרה ענבים ל16-22 שעות. פעם עשה, לאסוף את הצלחת אגרה ענבים ולהשליך את הזבובים ההוריים.
- לשטוף את פני השטח של הצלחות אגרו ענבים עם 1x נאגר מלוח פוספט (PBS). ביצים יכולות להיות מגויסות על ידי גירוד בעדינות עם צמר גפן. הקפידו לא שריטה, ניזק, או לגרד חתיכות דקות של אגר מעל פני השטח של הצלחת. בעזרת משפך, יוצק את הביצים נשטפו לצינור 15 מיליליטר חרוטים.
- תן את הביצים ליישב לתחתית של התחתית ויוצקות את supernatant, נזהר שלא לאבד את כל ביצים. הנפח שנותר צריך להיות בסביבות 2-3 מ"ל.
- הוסף 8-10 מ"ל של PBS לצינור וחזור מעל צעד 2-3 המורזמני דואר ללשטוף ביסודיות את הביצים עד supernatant הוא ברור. איך להיפטר של שמרי שיורים הוא המפתח בשלב זה.
- לאחר השטיפה, לנקז את כל supernatant עד נפח נותר הוא 2 מ"ל. Aliquot 32 μl של ביצים לתוך בקבוקי CT באמצעות קצה פיפטה רחב משעמם. ביצים בקצה פיפטה צריכות להיות קומפקטיות, עם מעט נוזל aspirated. זו יכולה להיות מושגת על ידי הכנסת קצה פיפטה עמוקה לתוך יישוב הביצה ומשחרר את הבוכנה כדי לשאוב במהירות.
- מקום seeded CT בקבוקים מייד בחממה לאורך התפתחות זבוב.
5. אוסף של מבוגרי גיל מתאים זבובים
- מבוגרים בדרך כלל eclose מהיום 9 והלאה. השלך את הזבובים שעלו ביום הראשון ובקבוקים מכניסים ללילה החממה. בפועל זה ימנע את הבחירה שלא במתכוון לעולה וצומח מוקדמים ולאפשר לאוסף של מספר מרבי של זבובים מסונכרנים.
- 16-22 שעות מאוחר יותר, להעביר את המבוגר בן יום עף into בקבוקי SY מזון 10%. במידת צורך, עוד סדרה ניתן לאסוף ביום למחרת.
- חזור עף חזרה לחממה ולאפשר זבובים כדי להגיע לבגרות מינית ובן זוג לימים. הקלט את היום של העברה לבקבוקי 10% SY כמו ביום הראשון של בגרות.
6. מיון זבובים וביצוע ניסוי אריכות ימים
- הרדם קבוצות קטנות של זבובים על משטח ההרדמה, אז זכרים ונקבות מיון לשתי קבוצות באמצעות מכחול. אם אתם משתמשים בCO 2, זה קריטי כדי לצמצם את החשיפה כדי למנוע בעיות ארוכות טווח בריאותי אפשריות שיכול לסכן את היושרה של ניסוי אריכות הימים.
- הנח 30 זבובים מאותו המין לצלוחיות אישיות. בהנחה שאין כרומוזומים איזון באוכלוסייה והצאצאים בריאים, כל בקבוק צריך לייצר סביב 3-4 בקבוקונים של כל מין. Aliquoting זבובים לתוך צלוחיות בודדות צריכה לקחת לא יותר מ 3-4 דקות, כך ש, בסך הכל, זבובים נחשפים להרדמה רק לתקופה מקסימלית של9-10 דקות.
- חזור על שלבים 6.1-6.2 עד שיש 8-10 בקבוקון משכפל לכל מגדר וטיפול ניסיוני.
7. הגדרת הגיליון האלקטרוני של Excel כדי לעקוב אחר ניסוי אריכות הימים
- אנו ממליצים אקראיים עמדת בקבוקון במקום בקבוקוני קיבוץ בתנאי ניסוי כדי למנוע הטיה קשורה למיקום הבקבוקון בחממה ולטשטש את זהות הבקבוקון לנסיין. לשם כך, תקצה זיהוי מספרים אקראי לכל בקבוקון בתוכנת גיליונות אלקטרוניים ראשון, ואז לסדר את הבקבוקונים במגשים על ידי מספר תעודת זהות. אם אתה משתמש בתוכנת ניהול ניסוי dLife, בצע את ההדרכה על הגדרת ניסוי להפקת מספר זיהוי לכל בקבוקון.
- (אופציונלי) אם אתה משתמש בקורא RFID או קורא ברקוד בשיתוף עם dLife, לצרף RFID או תג הברקוד לכל בקבוקון ולשייך את התג עם המזהה המספרי של הבקבוקון בdLife. התכנית תזהה כל בקבוקון כשסרק עם קוראומדריך אחד כדי להקליט את הנתונים במיקום הנכון בגיליון אלקטרוני. שימוש בקורא תג בשיתוף עם dLife מפחית באופן משמעותי זמן איסוף נתונים וטעות הקלטה.
8. שמירת ניסוי אריכות הימים
הבקבוקונים המכילים מזון טרי צריכים להיות בטמפרטורת חדר במשך כל העברה.
- במהלך תקופת הניסוי, זבובי העברה על גבי בקבוקונים חדשים המכילים מזון טרי כל 2 ימים (נקבות צעירות), או 3 פעמים בשבוע (זכרים או נקבות> 3 שבועות של גיל). צעד זה יבטיח שסביבת ההאכלה לנקבות צעירות לא תופרע על ידי הנוכחות של זחלים. העברה זו אמורה להסתיים ללא הרדמה, שיכול לגרום לתמותה חריפה, במיוחד בזבובים בוגרים יותר (Pletcher, תצפיות אישיות).
- במהלך כל העברת בקבוקון, להקליט גיל, לספור את הזבובים המתים בבקבוקון הישן, והזבובים המתים שמתבצעים לבקבוקון החדש. לתעד מידע זה בנפרד בשתי עמודות בגיליון אלקטרוני (או dLife או הגיליון האלקטרוני שלך). זה יבטיח כי בצע את הזבובים הם לא כפול נספרו-. המספר הכולל של מקרי מוות (מת + ממומן) צריך לפחות שווה במספר הזבובים שבוצעו מההעברה הקודמת. להפחית את מספר הזבובים שבוצעו בעבר מהמספר הכולל של מקרי מוות, כדי לקבוע את מספר מקרי המוות חדש.
- זבוב נחשב ימני מצונזר אם הוא עזב את הניסוי לפני המוות טבעי באמצעות בריחה או מוות מתאונה. חיות יוצאות בניסוי באופן זה צריכה להיות נכנס לתוך עמודה נפרדת ביום שהזבוב יצא הניסוי. זבובים מצונזרים הם לא נרשמו כמתים (ראו להלן).
- תמשיך לחזור על שלבים 8.1-8.2 עד הניצול האחרון מת. להיות מודע לכך שככל שגיל הזבובים, כמה זבובים יכולים לשכב על הגב ונראו כמת עקב inactiveness. לכן כאשר סופרים זבובים בצעו (מת), קש בצד של הבקבוקונים כדי לקבוע אם יש תנועות רגליים. אם כן, thesזבובים אלקטרוניים הם עדיין בחיים. במקרה שבו זבובים נדבקים למזון בבקבוקון הישן, אבל בחיים, הם לא צריכים להיחשב כמתים וצריכים להינצל על ידי קשה של בקבוקון נוסף כדי לסלק זבוב. זבובים כאלה לצנזר יש להשתמש בזהירות כפי שהוא עלול לגרום להטיה ניסיונית.
9. ניתוח נתונים
- עקומת שאירים מציגה את ההסתברות שאדם ישרוד לגיל מסוים ובדרך כלל מחושב באמצעות גישת קפלן-מאייר (איור 1) 8. בהיעדר נתונים נכוני צנזורה, הנוסחא ניתן לפשט שאירים כך שהגיל ספציפי בגיל x (S x) נקבע על ידי חלוקת מספר אנשי חיים בתחילת זמן מפקד בגיל x (N x) במספר הכולל של זבובים בניסוי (N 0); S x = N X / N 0. 9.2) עקומות שארות הן הצורה הנפוצה ביותר של הצגת נתונים, והםניתן לבדוק את השוויון בין קבוצות באמצעות מבחן יומן משורה ראשונה. מסקנה הגיונית ניתן להסיק מכמה כמו 50-100 אנשים בקבוצה. אירי הוא מדד מצטבר, לעומת זאת, ולכן מוות שאינו הזדקנות קשורה, כגון אלה בשלב מוקדם בחיים, יהיה לדכא שאירים במהלך חיים ולכן קשה להשפעות ספציפיות להזדקנות לקבוע.
- שיטת הדמית נתונים שנייה היא פונקצית תמותת גיל הספציפית, המציגה את הסיכון למוות בכל מרווח גיל ומציג תיאור מורכב יותר של נתוני הישרדות 9,10. מדדי תמותה הם עצמאיים מגיל אחד למשנו, והצורה של עקומת התמותה שימושית להיסק על הדינמיקה של הזדקנות, במיוחד כאשר טיפולים מותאמים במהלך חיים בוגרים. אומדני תמותת גיל ספציפי, לעומת זאת, חסרי דיוק וגם דיוק עם גודל מדגם קטן, ולעתים קרובות דורשים כמה למאות רבות של אנשים לקבוצה לes אמיןtimate 11.
- שיטות אחרות לאמידת הבדלי אריכות ימים כוללות מודלים למחצה פרמטריים (למשל קוקס רגרסיה) פרמטרית (למשל Gompertz) ו. מודלים אלה יכולים להיות חזקים, אבל צריכים להיות מיושמים בזהירות בגלל ההנחות שנעשו על הצורה של עקומות התמותה והאופי של שפעות טיפול, דבר שעלול להוביל למסקנה שגויה 11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ערכה פשוטה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1, שבו מתוארים שלבים עיקריים. חלק הסנכרון של הפרוטוקול יכול לשמש למבחנים שונים הדורשים זבובים בוגרים שגילו מותאם.
עקומות שארות אופייניות של זבובי סוג פראי מוצגות באיור 2a, באמצעות תוכנת ניהול ניסוי dLife (האיור 2b, ג). זכרים בוגרים בדרך כלל קצרים יותר לחיות, עם שני אוכלוסיות השגת אריכות ימים ממוצעת והחציוני של> 50 ימים על 10% מזון ש"י ב 25 ° C. שים לב ששאירים נותרים גבוהים בחלק הראשון של הניסוי ולאחר מכן יורדים באופן אקספוננציאלי.
תסיסנית תוחלת החיים מושפעת מתנאים סביבתיים, כגון טמפרטורה ודיאטה. 3a האיור מראה כי גברים מבוגרים בדרך כלל קצר יותר במידה ניכרת לחיות כמו טמפרטורה היא גדלה. כמו כן, ההשפעה של תזונה על תוחלת חיים, מוצגת באיור 3b
הצפיפות של קבוצות במהלך ההתפתחות יכולה להשפיע על תוחלת חיים של מבוגרים ולשנות את העיתוי התפתחותית. כאן אנו מראים דוגמה של איך צפיפויות שונות של ביצים מסונכרנות להשפיע על התפתחות רימות. כפי שמוצג באיור 4, תשואת זבוב בוגר היא עניה ומשטח האוכל הוא רגיש לייבוש כאשר מספר הביצים הוא נמוך מדי. בקצה השני של הספקטרום, רימות מתפתחות הן מפגרות בבקבוקים מצפיפות, והתשואה של זבובים בוגרים היא מופחתת.
העקומה שהאירית של הקבוצה בכללותה יכולה להיות מושפעת באופן משמעותי על ידי אפקטי בקבוקון חריגים, כפי שמוצגת באיור 5. נתוני הישרדות הבלתי רגילים לבקבוקונים בודדים עשויים להיות מספר גורמים, כגון איכות מזון ירודה או הצטברות חיידקים / פטריות וזיהומים. בעוד מקרי מוות חריגים כאלה גלהטות את מידת העמידה של האוכלוסייה, אין מדד ברור לקביעה כראוי שבקבוקון צריך להיות מחוץ לניסוי. מצבים אלה ולכן נמנעים טובים ביותר על ידי שיטות טיפול טובות ומתנו באמצעות גודל מדגם גדול.
איור 6 מציג דוגמאות של תנאי בקבוקון שיכול להוביל למוות חריג. באופן כללי, בכל מצב שיכול להוביל לסדקים קטנים שבו עלולים להיתקע זבובים ולמות יש להימנע. דוגמאות כוללות: בועות במזון, היובש במזון שגורם לכיווץ מקיר הבקבוקון, וסדקים במזון מוצגות בציור 5a (דוגמה קלה עם בועה אחת), 5b איור והציור 5c, בהתאמה . אוכל יבש מדי, כפי שמוצג באיור 5b ואיור 5c צריך להיות בזהירות התהפך במהלך העברה, כמזון יכול לעקור ומתמוטט מעל הזבובים בnבקבוקון ew. התפתחות חיידקים על פני השטח של המזון יכולה להוביל לזיהום או מלכודת פיזית ובכך עשויה להגביר תמותה. חיידקים מסוימים על פני השטח של המזון להיראות שקופים ומבריקים כאילו יש זיעה מהמזון (לא מוצג), בעוד שסוגים אחרים של חיידקים יתגלו כמושבות לבנות (האיור 5D). בקבוקונים המציגים בתערוכה כלשהי של תנאים אלה ראויים לציין ונחשבו עוד יותר כאשר הנתונים מתפרשים. באופן כללי, אנו מדגישים כי תשומת לב רב לגידול בעלי בשני שלבי הזחל ומבוגרים יכול לתמוך אריכות הימים ובריאותם של זבובים בוגרים ולהפחית את ההתרחשות של בעיות שהובילו לניתוחים פתולוגיים מוות בהמשך החיים.
איור 1. סכמטית פשוט של בדיקת תוחלת חי דרוזופילה.
האיור 2. () עקומות מייצגות תוחלת חיים של נקבת w 1118 שליטה (חוגים) וגבר בוגר (ריבועים) טסה ב 25 ° C על אוכל SY10%. (B, C) תמונות מסך מייצג של תוכנת dLife.
איור 3. השפעות של טמפרטורה () ותזונה (ב ') על תוחלת חיים של מבוגרים. א למבוגרי שליטה (קנטון S) זבובי זכרים נשמרו דרך בגרות בגיל 18 מעלות צלזיוס, 25 מעלות צלזיוס, או 29 מעלות שליטת מבוגרי CB (w 1118) זבובי נשים נחשפו לאו 15% או 5% "י ש"י דיאטה.
איור 4. יום 9 של פיתוח (ב 25 ° C) של ביצים מסונכרנות, aliquoted בבקבוקי מזון CT. Volume של aliquot עובר המכיל הוא כפי שמוצג מתחת לכל בקבוק.
איור 5. עלילת נציגת תוכנת dLife מראה שאירים ידי בקבוקון. החץ מצביע על בקבוקון חריג יחיד בתוך קבוצה.
איור 6. דוגמאות לאיכות מזון תת אופטימלית. א בועות על פני שטח מזון. מזון ב התכווץ הרחק מהקצה של הבקבוקון. ג סדקים במזון. חיידקי ד הצטברות על פני השטח של המזון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה להפקת מדידות לשעתק לאריכות ימים בוגרות בדרוזופילה שניתן ליישם לצורך ההערכה של התערבויות גנטיות, תרופתיות וסביבתיות. היבטים חשובים של הפרוטוקול כוללים שליטה בזהירות את סביבת פיתוח הזחל, צמצום מתח למבוגרים, ומזעור הטיה על פני קבוצות ובקרות ניסיוניות. אנו מציגים גם את השימוש בתוכנת ניהול ניסוי תוחלת חי dLife. פשוט על ידי חיבור הברקוד או תג RFID לכל בקבוקון, תכנית dLife תסייע בהשגת מידע עבור כל מדידה וזוממת בעקומת שאירים. אמנם זה כרגע מתאים ביותר ללימודים של זבוב תוחלת חיים באמצעות בקבוקונים, כלי ניהול הניסוי הזה יכולים להיות מותאמים בקלות לשימוש באורגניזמים אחרים, עם סוגים שונים של תאי אוכלוסייה, או לצעדים נוספים של הישרדות, כולל עמידות למצבי עקה ורעילויות תרופה.
Prior לכל הערכה החל אריכות ימים, עליו לקבל תחילה בזהירות לשלוט על הייצור של מניות הורים. שונות גנטיות היא גורם חשוב, כמו הבריאות של זני הורים. גורמים אלו הובילו למחלוקת ציבורית ניכרת קשורה במחקרים מוקדמים שדיווחו רגולטורי אריכות ימים משוערים 13. החוקר יש כמה אפשרויות למזעור השפעות מיוחסות לשונות ברקע גנטי. למניפולציות גנטיות, כל הזנים שעברו שינוי גנטי צריכים להיות נשלטים על רקע השקוף או backcrossing למתח שליטה (לפחות 6 פעמים) או באמצעות מערכות מושרות (למשל, אללים רגישים לטמפרטורה או ביטוי transgene סמים מושרים). GeneSwitch וט על מערכות 14,15 הם פופולריים ומאפשר השוואה ישירה של זבובים עם אותו הרקע הגנטי שבי transgene מושרה או שאינו נגרם. עבור כל המערכות המושרות, פקדים של תקופה מתאימים נדרשים להימנע confounds קשור inducer. כישלון לשלוט על רקע גנטי כמעט תמיד תוצאות במרץ היברידי, אשר יכולה להאריך את תוחלת חיים בדור F1 של הכלאה בין שני זנים שונים מסיבות שאינם קשורות למניפולציה שנועדה 13. גורם זה הוא מדאיג במיוחד בעת שימוש במערכת GAL4-כטב"מ. להתערבויות סביבתיות (לדוגמה, טיפול תרופתי, תזונה, טמפרטורה וכו '), מומלץ ללמוד את ההשפעות של ההתערבות במתח יותר מאחד. לבסוף, גם גיל 16 הורים ומתח 17 יכולים להשפיע על תוחלת חיים של דור F1, ומסיבה זו, מבוגרים הצעירים הבריאים צריכים להיבחר לייצור ביצים.
היבטים חשובים של שליטה על סביבת הזחל / גלמים כוללים מניעת הצפיפות והתחזוקה של סביבה מבוקרת עם רגולציה קפדנית של תקופות אור כהים, לחות וטמפרטורה. גורמים אלה ישפיעו גם העיתוי של development והאיכות הפיסית של המבוגרים שהתקבלו. סביבות זחל לוואי, כגון צפיפות זחל גבוהה, עלולות להוביל להפעלה של גורמי מתח מושרה (למשל, ביטוי חלבון הלם חום) שידועות להשפיע אריכות ימי מבוגר 18.
בשלב הבוגר, תשומת לב קפדנית לסביבה נותרת חיונית. הבחירה בדיאטה בלבד יכולה להשפיע באופן משמעותי את תוחלת חיים ויכולה לקיים אינטראקציה עם גורמים גנטיים כדי לייצר השפעות תזונה ספציפיות על אריכות ימים. יתר על כן, כמה חלופות בסיס מזון שכיחות (שמרים לחלץ במקום שמרי השיכר כל lyophilized) יכולות לקצר באופן דרמטי את תוחלת חיים 19, השאירה פתוח את האפשרות שהאוכל עצמו גורם ללחץ האורגניזם שעלול לפגוע בהערכה של אריכות ימים. במאמר זה, יש לנו הדגיש מקורות פוטנציאליים של לחץ בסביבה התזונתית כוללים חריגות פיסיות במזון (למשל, בועות, קצף, סדקים, חיידקים וכו ') שיכול Physically ללכוד את בעלי החיים. החלפה סדירה של מזון ישן עם מזון טרי (לפחות שלוש פעמים בשבוע) יכולה להתגבר על רב מבעיות אלה. יתר על כן, טמפרטורה 20, לחות (תצפיות אישיות), תאורה 21, והנוכחות של conspecifics (הסביבה חברתית) 22 כולם יכולים לווסת את תוחלת חיים, ותשומת לב לשליטת גורמים אלה במסגרת הניסוי חשובה להימנע מהטיה בתוצאות. בעוד שמספר זבובים בתוך בקבוקון פוחת עם זמן, מצא כי השימוש בהרדמה כדי להתאים את מספר הזבובים יכול להגביר תמותה באופן תלוי גיל (Pletcher, תצפיות אישיות), ואנחנו לא המלצנו על הליך זה. המיקום המדויק של את הבקבוקונים בחממה הוא גם גורם, גם בסביבה מבוקרת לכאורה. הפצה פיזית אקראית של קבוצות ניסוי עם בקרות יכולה להקטין הטיות קשורות למיקום בקבוקון והוא נדרש להסקה סטטיסטית נכונה. אפילו עםתנאים מבוקרים בקפידה, הבדלים קלים ניתן להבחין בין ניסויים והשימוש בפקדים בתוך-ניסוי הוא חיוני.
גישות האכלה חלופיות הוצעו עבור ניתוח תוחלת חיים כוללים גישת מזין נימים (שיטת CAFE) 23. שיטה זו מצטיינת ביכולת לספק מדידות מדויקות של צריכת מזון, אבל היא גורם לזבובים ניכרים קצרי חיים 24. לחצים פוטנציאליים הקשורים בסביבת ההאכלה יש לקחת בחשבון בעת הערכת היחסים המשולבים בין תזונה וגורמים גנטיים בתוחלת חיים באופן כללי.
ניתוח דמוגרפי, כולל החישוב של שאירים ועקומות תמותה יכולות לחשוף מידע רב על הדינמיקה של האוכלוסייה המזדקנת. העקומה אירית טיפוסית תישאר שטוחה יחסית לתקופה ארוכה מוקדם בחיים ולהגדיל את שיעורה של ירידה בגילים מבוגרים, אשר תואם את התקופה של f תמותה הנמוכהollowed בתקופה של גידול מעריכי בתמותה. סביבה מלחיצה בדרך כלל להתבטא בעודף של מקרי מוות מוקדמים באוכלוסייה ולטבול חריגים בעקומת שאירים. למרות תוצאה כזו עשויה להצביע על הבדלים משמעותיים בין טיפולים, זה לא נורמלי להיות חזק לשכפול. לפיכך, אנו ממליצים על לפחות שני ניסויים (כלומר, שאינם זמניים) עצמאיים לשכפל יבוצעו לפני כל מסקנה ברורה נמשכות. יכול להיות שמאמץ נוסף לקראת הגדלת גודל המדגם, שליטה על תנאי גידול בעלי, ושיפור הבריאות של מניות הורים נדרשת.
ימני לצנזר (הסרת חיות מהניסוי שהבריחה או כנראה מת מגורמים מקריים) של בעלי חיים שמתים מתנאים סביבתיים מלחיצים צריך להיות מיושם בזהירות רבה. במובן צר, צנזורה חייבת להתרחש באקראי על פני טיפולים ניסיוניים, ואם interventi הניסיוניעל רגישות מתח מודולציה, אפשר בטעות להחיל בחירת טיפול ברמה לאוכלוסייה. ככלל, להימנע מהנוכחות של גורמים שיכולים להביא למוות מוקדם משמעי (הקשורים בעיקר עם מקור מזון) היא טובה יותר מצנזורה, והצנזורה רק צריכה להיות מוחלת על אורגניזמים שנצפו למות או לברוח במהלך טיפול פיזי.
שיקול סופי הוא ההערכה של מובהקות סטטיסטיות. למרות גודל מדגם עוקבה גדול מספק כוח מרשים להבחין הבדלים קטנים בין טיפולים, המשמעות הביולוגית הפוטנציאלית של הבדל כזה חייבת להיות גם נחשב. עם ניסויי אריכות ימים בגודל סביר, הבדלים נמוכים כמו 1-2% לעתים קרובות מאוד משמעותיים מבחינה סטטיסטית, אך ההשפעה הכוללת של ההתערבות על מצב בריאות עשויה להיות קטין. לכן, גם משמעות סטטיסטית וביולוגית יש לקחת בחשבון כאשר לפרש את התוצאות הכוללות של הניסוי. Infeלורנס על תהליך ההזדקנות מניסויי הישרדות ניתן בתוספת אמצעים של ירידות הקשורות לגיל במדדי בריאות התנהגותיים או פיסיולוגיים, כוללים טיפוס היכולת 25 ויושרת קיר עיכול 7.
לסיכום, אורגניזם מודל דרוזופילה בחירה מושכת ללימוד מנגנונים של הזדקנות. בעזרת טכניקה ניסויית זהירה, ניתוח דמוגרפי חזק יכול לספק תובנות לגבי ההשפעה של גורמים גנטיים ותרופתיים על תהליך ההזדקנות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מקרן אליסון הרפואי (SDP, http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/), NIH 5T32GM007315-35 (JR) וNIH R01AG030593 (SDP). עבודה זו מנוצלת משאבים של דרוזופילה הזדקנות Core (DAC) של מרכז ההלם נתן למצוינות בביולוגיה של ההזדקנות מומן על ידי המכון הלאומי להזדקנות P30-AG-013283 (http://www.nih.gov/). המחברים מבקשים להודות למעבדת Pletcher לדיונים מועילים ובעיקר בריאן Chung לקריאה ביקורתית של כתב היד. ברצוננו להודות ניק אשר וקתרין Borowicz לסיוע באיסוף נתונים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Fleishmann’s Yeast | 2192 | |
| Grape Agar Powder Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Large Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Large Replacement End Caps | Genesee Scientific | 59-103 | |
| 6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Flugs Closures for Stock Bottles | Genesee Scientific | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide, Polystrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Flugs Closures for Wide Vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul | Denville Scientific | P1105-CP | |
| Flystuff Flypad, Standard Size | Genesee Scientific | 59-114 | |
| BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow | Fisher Scientific | 10-200-47 | |
| PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 | |
| Gelidium Agar | Mooragar | n/a | |
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals | 0290331280 | |
| Granulated Sugar | Kroger | n/a | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-266 | Fly Food Preservative |
| Propionic Acid, 99% | Acros Organics | 149300025 | Fly Food Preservative |
| Kanamycin Sulfate | ISC BioExpress | 0408-10G | |
| Tetracycline HCl | VWR | 80058-724 |
References
- Toivonen, J. M., et al. No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects. PLoS Genet. 3, e95 (2007).
- Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. Testing an 'aging gene' in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background. Aging Cell. 2, 123-130 (2003).
- Burnett, C., et al. Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila. Nature. 477, 482-485 (2011).
- Bokov, A. F., et al. Does reduced IGF-1R signaling in Igf1r+/- mice alter aging? PLoS One. 6, e26891 (2011).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosophila Information Service. 34, 117-118 (1960).
- Skorupa, D. A., Dervisefendic, A., Zwiener, J., Pletcher, S. D. Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster. Aging Cell. 7, 478-490 (2008).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metab. 14, 623-634 (2011).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 53, 457-481 (1958).
- Pletcher, S. D. Mitigating the Tithonus Error: Genetic Analysis of Mortality Phenotypes. Sci. Aging Knowl. Environ. 2002, pe14 (2002).
- Pletcher, S. D., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Why do life spans differ? Partitioning mean longevity differences in terms of age-specific mortality parameters. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 381-389 (2000).
- Promislow,, Tatar,, Pletcher,, Carey, Below-threshold mortality: implications for studies in evolution, ecology and demography. Journal of Evolutionary Biology. 12, 314-328 (1999).
- Pletcher, Model fitting and hypothesis testing for age-specific mortality data. Journal of Evolutionary Biology. 12, 430-439 (1999).
- Partridge, L., Gems, D. Benchmarks for ageing studies. Nature. 450, 165-167 (2007).
- Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 12602-12607 (2001).
- Ford, D., et al. Alteration of Drosophila life span using conditional, tissue-specific expression of transgenes triggered by doxycyline or RU486/Mifepristone. Exp. Gerontol. 42, 483-497 (2007).
- Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, 927-935 (2002).
- Smith, E. M., et al. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J. Nutr. 137, 2006-2012 (2007).
- Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. J. Insect Physiol. 47, 1301-1307 (2001).
- Bass, T. M., et al. Optimization of dietary restriction protocols in Drosophila. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1071-1081 (2007).
- Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Minis, D. H. Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1537-1539 (1972).
- Joshi, A., Mueller, L. D. Adult crowding effects on longevity in Drosophila melanogaster: Increase in age-dependent mortality. Current Science. 72, 255-260 (1997).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 8253-8256 (2007).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2498-2503 (2008).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
