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Biology

Mesure de la durée de vie en doi: 10.3791/50068 Published: January 7, 2013

Summary

Drosophila melanogaster est un organisme modèle puissant pour explorer la base moléculaire de la régulation longévité. Ce protocole discuter des étapes à suivre pour générer un reproductible, basée sur la population de mesure de la longévité ainsi que les pièges potentiels et comment les éviter.

Abstract

Le vieillissement est un phénomène qui se traduit par une détérioration physiologique stable dans pratiquement tous les organismes dans lesquels il a été examiné, conduisant à des performances physiques réduites et un risque accru de la maladie. Vieillissement individuel est manifeste au niveau de la population comme une augmentation de la mortalité liée à l'âge, ce qui est souvent mesurée en laboratoire en observant la durée de vie dans les grandes cohortes d'individus appariés selon l'âge. Les expériences qui cherchent à quantifier la mesure dans laquelle génétique ou l'impact environnemental des manipulations durée de vie dans des organismes modèles simples ont connu un succès remarquable pour comprendre les aspects du vieillissement qui sont conservés entre les taxons et d'inspirer de nouvelles stratégies pour étendre la durée de vie et la prévention des maladies liées à l'âge chez les mammifères .

La mouche du vinaigre, Drosophila melanogaster, est un organisme modèle intéressant pour l'étude des mécanismes de vieillissement en raison de sa relativement courte durée de vie, l'élevage pratique et la génétique faciles.Toutefois, les mesures démographiques du vieillissement, notamment l'âge de la survie spécifique et la mortalité, sont extrêmement sensibles aux variations, même mineures dans la conception expérimentale et de l'environnement, et le maintien de bonnes pratiques de laboratoire strictes pour la durée des expériences de vieillissement est nécessaire. Ces considérations, ainsi que de la nécessité de pratiquer un contrôle minutieux du contexte génétique, sont essentielles pour générer des mesures robustes. En effet, il existe de nombreuses controverses entourant notables inférence à partir des expériences de longévité chez la levure, les vers, les mouches et des souris qui ont été tracées à des artefacts environnementaux ou génétiques 1-4. Dans ce protocole, nous décrivons un ensemble de procédures qui ont été optimisés pendant de nombreuses années de mesure de la longévité chez la drosophile en utilisant des flacons de laboratoire. Nous décrivons également l'utilisation du logiciel dLife, qui a été développé par notre laboratoire et est disponible en téléchargement ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / logiciel). dLife accélère le débit et la promotion de bonnes pratiques en intégrant la conception expérimentale optimale, ce qui simplifie la manipulation mouche et la collecte de données, et en normalisant l'analyse des données. Nous discuterons également les nombreux pièges potentiels dans la conception, la collecte et l'interprétation des données de durée de vie, et nous fournissons des mesures pour éviter ces dangers.

Protocol

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Nous vous recommandons de conserver des aliments expérimentaux, la pâte de levure, et des plaques de gélose de raisin qui apparaissent dans le protocole à 4 ° C et les utiliser dans les 1-2 mois aussi longtemps que la moisissure et la sécheresse n'ont pas mis po standard des conditions environnementales à la fois pour les larves et les adultes scène impliquent l'entretien des mouches dans un incubateur à 25 ° C avec un cycle de lumière 12:12 h sombre et 60% d'humidité relative.

1. Préparation de l'alimentation expérimentale

  1. Pour la croissance larvaire, nous utilisons une version modifiée du Caltech Moyen 5, qui est abrégé dans ce protocole CT.
  2. Nous recommandons un régime alimentaire pour adultes Drosophila (SY) qui se compose de sucre (saccharose) et de la levure (levure lyophilisée brasseur entier) dans une base de gélose à 2%, qui a été bouillie, supplémenté avec des antibiotiques et antifongiques, et distribué (10 ml par flacon) 6. Les aliments doivent être autorisés à se solidifier et évaporer pendant 12-24 heures avant l'entreposage. Parce que le milieu nutritif peut substantiellelement la longévité d'impact, la cohérence dans les processus de cuisson est essentiel à la fois dans une expérience de comparaison entre les expériences.
  3. Si un agent pharmacologique doit être ajouté à la nourriture des adultes, ce médicament peut être mélangé dans un petit lot de nourriture et de couches (2 ml) à la surface des aliments, avec des flacons témoins recevant couches contenant véhicule seul.

2. Préparation d'une pâte de levure direct

Mélanger 5-6 ml d'eau avec 3 g de levure sèche active et bien mélanger. La consistance de la pâte de levure doit être celle d'un beurre d'arachide crémeux.

3. Préparation d'une plaque de gélose de raisin

  1. Ajouter un paquet d'un prémélange agar raisin dans 500 ml d'eau distillée dans une fiole de 1000 ml et suivez les instructions sur le paquet de dissoudre le mélange agar raisin.
  2. Verser soigneusement une couche épaisse du mélange dans des boîtes de Pétri 100 mm, tout en évitant la formation de bulles. Un sachet de prémélange produit environ 14 graplaques de gélose pe.
  3. Que les médias refroidir et se solidifier à la température ambiante avec des couvercles sur pendant 15 min. Les plaques peuvent être conservés à 4 ° C, enveloppé dans une pellicule plastique, ou utilisé immédiatement.

4. Collecte des oeufs synchronisés

Tous les médias utilisés dans ce protocole, la levure soit, plaques de gélose de raisin, CT et 10% des aliments SY, doit être à température ambiante.

  1. Étaler une couche de 2-3 cm de diamètre de levure coller sur une plaque de gélose de raisin et mettre de côté.
  2. Placez une cage gros œuf sur une collection de CO 2 pad avec le maillage vers le bas pour anesthésier les mouches. À base d'azote anesthésie est une alternative à CO 2, utilisé par certains laboratoires, qui peut produire des résultats de haute qualité 7.
  3. L'aide d'un entonnoir, transférer 150-200 paires de mouches dans la cage collecte des œufs.
  4. Placer la plaque de gélose de raisin pour couvrir l'extrémité ouverte de la cage et fixer avec un capuchon d'extrémité.
  5. Poser la cage sur le côté jusqu'à ce que les mouches se réveiller.Ensuite, garder la cage, côté raisin plaque de gélose vers le bas, dans l'incubateur pendant la nuit.
  6. Le lendemain, remettez la plaque de raisin avec une plaque de raisin nouvellement levure. Ne mettre environ 1 cm de diamètre de pâte de levure sur la surface de la plaque. Jetez la plaque 1 er jour de raisin.
  7. Permettre de recueillir des embryons sur la surface de la plaque de gélose de raisin pour 16-22 heures. Une fois cela fait, recueillir la plaque de gélose de raisin et jeter les mouches parents.
  8. Lavez la surface de la gélose de raisin avec 1x tampon phosphate salin (PBS). Les œufs peuvent être mobilisés en grattant doucement avec un coton-tige. Prenez soin de ne pas rayer, endommager ou gratter minces morceaux de gélose sur la surface de la plaque. Avec l'aide d'un entonnoir, versez les œufs lavés dans un tube conique de 15 ml.
  9. Laissez les oeufs se déposent au fond du tube et jeter le surnageant, en faisant attention de ne pas perdre les œufs. Le volume restant doit être d'environ 2-3 ml.
  10. Ajouter 8-10 ml de PBS dans le tube et répétez les étapes 2-3 ci-dessus more fois de se laver les œufs jusqu'à ce que le surnageant soit clair. Se débarrasser de la levure résiduelle est la clé dans cette étape.
  11. Après le lavage, vider toute surnageant jusqu'à ce que le volume restant est de 2 ml. Aliquoter 32 ul d'œufs dans des bouteilles CT à l'aide d'une pipette de gros calibre. Oeufs dans la pointe de la pipette doit être compact, avec peu ou pas de liquide aspiré. Ceci peut être réalisé en insérant la pointe de la pipette en profondeur dans le règlement d'oeuf et en relâchant le piston pour aspirer.
  12. Lieu tête de série CT bouteilles Retour dans l'incubateur au long du développement mouche.

5. Collection d'appariés selon l'âge adulte Flies

  1. Les adultes seront généralement Eclose de jour 9. Jeter les mouches qui ont émergé dès le premier jour et bouteilles lieu de retour dans la nuit incubateur. Cette pratique permet d'éviter la sélection accidentelle de début émergentes et permettre la collecte d'un nombre maximum de mouches synchronisés.
  2. 16-22 heures plus tard, transférer la journée adulte âgé de mouches into 10% des bouteilles alimentaires SY. Si nécessaire, un autre lot peut être prélevé le lendemain.
  3. Retour vole de nouveau dans l'incubateur et laisser les mouches pour atteindre la maturité sexuelle et s'accouplent pendant deux jours. Notez la date du transfert à 10% des bouteilles SY comme le premier jour de l'âge adulte.

6. Tri des mouches et configuration Expérience Longévité

  1. Anesthésier petits groupes de mouches sur le pavé anesthésie, puis les mâles et les femelles de tri en deux groupes à l'aide d'un pinceau. Si vous utilisez le CO 2, il est essentiel de minimiser l'exposition à prévenir d'éventuels problèmes de santé de longue durée qui peuvent compromettre l'intégrité de l'expérience longévité.
  2. Placez 30 mouches du même sexe dans des flacons individuels. En supposant qu'aucun chromosomes d'équilibrage de la population et de la descendance saine, chaque bouteille devrait produire environ 3-4 flacons de chaque sexe. Aliquotage mouches dans des flacons individuels ne devrait pas prendre plus de 3-4 minutes, de sorte que, au total, les mouches ne sont exposés à l'anesthésie pour un maximum de9-10 min.
  3. Répétez les étapes 6.1 à 6.2 jusqu'à ce qu'il n'y 8-10 flacon répétitions pour chaque sexe et les traitements expérimentaux.

7. Configuration de la feuille de calcul Excel pour suivre la longévité Expérience

  1. Nous vous recommandons de randomisation position de flacon plutôt que des flacons de regroupement par condition expérimentale afin d'éviter les biais associés à l'emplacement flacon dans l'incubateur et à masquer l'identité flacon à l'expérimentateur. Pour ce faire, d'abord affecter un ID aléatoire numérique à chaque flacon dans une feuille de calcul, puis disposez les flacons en barquettes par numéro d'identification. Si vous utilisez le logiciel de gestion dLife expérience, suivre le tutoriel sur le montage expérimental pour générer le numéro d'identification de chaque flacon.
  2. (Facultatif) Si vous utilisez un lecteur RFID ou lecteur de code à barres en association avec dLife, fixez une étiquette RFID ou étiquette code à barres sur chaque flacon et d'associer la marque à l'identifiant numérique du flacon dans dLife. Le programme reconnaît chaque flacon lors de la numérisation d'un lecteuret guider une pour enregistrer les données dans l'emplacement approprié dans une feuille de calcul. L'utilisation d'un lecteur d'étiquettes en conjonction avec dLife réduit considérablement le temps de collecte de données et d'erreurs d'enregistrement.

8. Le maintien de l'Expérience Longévité

Les flacons contenant de la nourriture fraîche doit être à la température ambiante pour chaque transfert.

  1. Au cours de la période expérimentale, les mouches transfert sur de nouveaux flacons contenant de la nourriture fraîche tous les 2 jours (les jeunes filles), ou 3 fois par semaine (mâles ou femelles> 3 semaines d'âge). Cette étape permet de s'assurer que l'environnement d'alimentation pour les jeunes femmes ne soit pas perturbé par la présence de larves. Ce transfert doit être effectué sans anesthésie, ce qui peut induire une mortalité élevée, en particulier dans les vieilles mouches (Pletcher, observations personnelles).
  2. Lors de chaque transfert de flacon, enregistrer l'âge, compter les mouches mortes dans le flacon vieux, et les mouches mortes qui sont menées dans le flacon de nouveau. Enregistrer cette information séparément dansdeux colonnes dans une feuille de calcul (soit dLife ou votre propre feuille de calcul). Cela permettra d'assurer que les mouches ne sont pas effectuées comptés deux fois. Le nombre total de décès (morts + réalisée) doit égaler au moins le nombre de mouches réalisées à partir du transfert précédent. Soustraire le nombre de mouches précédemment exercées par le nombre total de décès afin de déterminer le nombre de nouveaux décès.
  3. Une mouche est considérée comme censurées à droite si elle a quitté l'expérience avant la mort naturelle par la fuite ou la mort accidentelle. Animaux qui sortent de l'expérience de cette manière doivent être saisies dans une colonne séparée sur la journée que la mouche est sorti de l'expérience. Mouches censurés ne sont pas enregistrés comme décédés (voir ci-dessous).
  4. Continuer à répéter les étapes 8.1 à 8.2 jusqu'à ce que le dernier survivant est mort. Soyez conscient que l'âge des mouches, des mouches peut se coucher sur le dos et semblent morts en raison de leur inactiveness. Par conséquent, lorsque le comptage des mouches effectuées (morts), appuyez sur le côté des flacons pour déterminer s'il ya des mouvements de jambes. Si c'est le cas, these mouches sont encore en vie. Dans le cas où les mouches restent collées à la nourriture dans le flacon vieux mais en vie, ils ne doivent pas être comptés comme morts et devrait encore être sauvé par tapotant le flacon pour déloger la volée. Censurer ces mouches doivent être utilisés avec prudence, car elle peut entraîner des biais expérimentaux.

9. Analyse des données

  1. La courbe de survie affiche la probabilité qu'un individu survive à un âge donné et est généralement calculée en utilisant une approche de Kaplan-Meier (figure 1) 8. En l'absence de données censurées à droite, la formule peut être simplifiée telle que la survie selon l'âge à l'âge x (S x) est calculé en divisant le nombre d'individus vivants au début d'un temps recensement à l'âge x (N x) par le nombre total de mouches dans l'expérience (N 0), S x = x N / N 0. 9.2 Les courbes de survie) sont la forme la plus courante de présentation des données, et ilspeuvent être testés pour l'égalité entre les groupes à l'aide d'un test du log-rank. Inférence raisonnable ne peut être tirée d'aussi peu que 50 à 100 individus d'une cohorte. La survie est une mesure cumulative, cependant, et donc pas les morts qui ne sont pas liées au vieillissement, telles que celles tôt dans la vie, ralentira la survie tout au long de la durée de vie qui rend difficile de déterminer les effets spécifiques au vieillissement.
  2. Une méthode de visualisation secondes données est la fonction de mortalité par âge, qui affiche le risque de mourir par chaque tranche d'âge et présente une description plus nuancée de 9,10 données de survie. Mesures de la mortalité sont indépendants d'un âge à l'autre, et la forme de la courbe de mortalité est utile pour l'inférence sur la dynamique du vieillissement, en particulier lorsque les traitements sont ajustés au cours de la vie adulte. Les estimations de la mortalité par âge, cependant, manquent à la fois précision et l'exactitude des échantillons de petite taille, et nécessitent souvent plusieurs-vers-plusieurs centaines d'individus par cohorte pour une es fiabletimate 11.
  3. D'autres méthodes pour estimer les différences de longévité comprennent paramétrique (par exemple Gompertz) et semi-paramétriques (par exemple, la régression de Cox) modèles. Ces modèles peuvent être puissants, mais doivent être appliquées avec prudence en raison des hypothèses faites sur la forme des courbes de mortalité et la nature des effets du traitement, ce qui pourrait conduire à l'inférence incorrecte 11,12.

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Representative Results

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Un schéma simplifié du protocole est présenté à la figure 1, où les étapes clés sont décrits. La partie de synchronisation du protocole peut être utilisé pour différents essais qui nécessitent mouches adultes appariés par l'âge.

Courbes de survie typiques de mouches de type sauvage sont présentés dans la figure 2a, en utilisant le logiciel de gestion dLife expérience (Figure 2b, c). Les mâles adultes vivent généralement plus courte, avec deux populations atteindre une longévité moyenne et la médiane de> 50 jours sur une alimentation de 10% SY à 25 ° C. Notez que la survie reste élevée dans la première partie de l'expérience, puis décline de façon exponentielle.

Drosophila durée de vie est affectée par les conditions environnementales, comme la température et l'alimentation. Figure 3a montre que les mâles adultes vivent généralement nettement plus courte que la température augmente. De même, l'effet du régime alimentaire sur la durée de vie est présentée dans la figure 3b

La densité des cohortes au cours du développement peuvent influer sur la durée de vie des adultes et de modifier le calendrier de développement. Ici, nous montrons un exemple de la façon dont différentes densités d'oeufs synchronisés sur le développement des larves. Comme le montre la figure 4, le rendement mouche adulte est pauvre et la surface de l'aliment est susceptible de séchage lorsque le nombre d'oeufs est trop faible. À l'autre extrémité du spectre, le développement larvaire est retardée en surpeuplées bouteilles, et le rendement des mouches adultes est réduit.

La courbe de survie de la cohorte dans son ensemble peut être influencée de manière significative par les effets flacon anormales, comme le montre la figure 5. Les données de survie en situation irrégulière pour des flacons individuels peuvent avoir plusieurs causes, comme la mauvaise qualité des aliments ou bactérienne / fongique l'accumulation et l'infection. Bien que ces morts anormales cun biais de survie de la population de la mesure, il n'est pas une métrique simple pour déterminer de façon appropriée qu'un flacon doit être exclu de l'expérience. Ces situations sont donc mieux éviter de bonnes pratiques de manipulation et atténués en utilisant un échantillon de grande taille.

La figure 6 montre des exemples de conditions flacons qui peuvent conduire à des anomalies décès. En général, une condition qui peut conduire à des petites crevasses où les mouches peuvent se coincer et de mourir doit être évitée. Des exemples comprennent: des bulles dans l'aliment, l'aliment sec sous menant à l'écart de rétrécissement de la paroi du flacon, et à la fissuration dans la denrée alimentaire sont représentés sur la figure 5a (par exemple une légère avec une seule bulle), la figure 5b, et la figure 5c, respectivement . Aliments trop sec, comme indiqué sur la figure 5b et 5c Figure devrait être soigneusement renversé lors des transferts, car la nourriture peut se détacher et tomber sur les mouches dans le new flacon. La croissance bactérienne à la surface de l'aliment peut entraîner une infection ou piégeage physique et peut donc augmenter la mortalité. Certaines bactéries sur la surface de l'aliment semblent transparents et brillants comme s'il n'y avait la transpiration de la nourriture (non représenté), tandis que d'autres types de bactéries se manifestera sous forme de colonies blanches (figure 5d). Flacon présentant une des conditions suivantes doit être noté et examiné plus avant lorsque les données sont interprétées. En général, nous soulignons qu'une attention particulière à l'élevage dans les deux stades larvaire et adulte peut supporter la longévité et la santé des mouches adultes et réduire l'apparition de problèmes conduisant à des causes ambiguës de la mort dans la vie plus tard.

Figure 1
Figure 1. Schéma simplifié d'un essai de durée de vie chez la drosophile.

"Figure Figure 2. (A) représentant les courbes de durée de vie de la femme avec commande 1118 (cercles) et mâle (carrés) mouches adultes à 25 ° C sur un aliment SY10%. (B, C) des captures d'écran du logiciel de représentation dLife.

Figure 3
Effets Figure 3. De la température (A) et l'alimentation (B) sur la durée de vie des adultes. A. adultes de commande (Canton S) mouches mâles ont été maintenus à l'âge adulte à 18 ° C, 25 ° C ou 29 ° de commande adultes CB (w 1118) mouches femelles ont été exposés soit à un 15% ou 5% SY SY alimentation.

Figure 4
Figure 4. 9 ème jour de développement (à 25 ° C) des oeufs synchronisés, aliquotés dans des flacons alimentaires CT. Volume de l'aliquote contenant embryon est comme indiqué sous chaque bouteille.

Figure 5
Figure 5. Parcelle Représentant du logiciel dLife montrant la survie par flacon. La flèche indique un seul flacon anormale au sein d'un groupe.

Figure 6
Figure 6. Exemples de qualité alimentaire optimale. A. bulles à la surface des aliments. Nourriture B. rétréci l'écart du bord de la cuvette. C. Fissures dans la nourriture. Les bactéries D. accumulation sur la surface de l'aliment.

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Discussion

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Le protocole présenté ici décrit une méthode pour produire des mesures reproductibles de la longévité des adultes chez la drosophile qui est adaptable pour l'évaluation des ressources génétiques, des interventions pharmacologiques et environnementaux. Aspects cruciaux du protocole comprennent un contrôle minutieux de l'environnement de développement larvaire, la réduction du stress des adultes, et minimiser les biais entre les groupes expérimentaux et de contrôle. Nous présentons également l'utilisation du logiciel de gestion dLife durée de vie expérience. Par simple fixation d'un code à barres ou d'une étiquette RFID pour chaque flacon, le programme dLife contribuera à l'acquisition des données pour chaque mesure et en traçant la courbe de survie. Alors qu'il est actuellement le plus approprié pour les études de durée de vie volée en utilisant des flacons, cet outil de gestion expérience pourrait être facilement adapté pour une utilisation dans d'autres organismes, avec différents types de chambres population, ou pour des mesures supplémentaires de survie, y compris la résistance au stress et la toxicité des médicaments.

Pvant de commencer une évaluation de la longévité, il faut d'abord contrôler soigneusement la production de stocks parentaux. La variabilité génétique est un facteur important, de même que la santé des souches parentales. Ces facteurs ont conduit à la controverse publique considérable associée à des études antérieures qui ont déclaré des régulateurs putatifs longévité 13. Le chercheur dispose de plusieurs options pour minimiser les effets attribuables à la variabilité génétique en arrière-plan. Pour les manipulations génétiques, toutes les souches génétiquement modifiées devrait être d'arrière-plan soit contrôlé par rétrocroisement avec une souche témoin (au moins 6 fois) ou en utilisant des systèmes inductibles (par exemple, la température, les allèles sensibles ou expression du transgène drogue inductible). Le GeneSwitch et Tet-sur les systèmes d'14,15 sont populaires et permettre une comparaison directe des mouches avec le même fond génétique dans lequel le transgène est induite ou non induite. Pour tous les systèmes inductibles, des contrôles appropriés contemporains sont nécessaires pour éviter confounds associé à l'inducteur. L'incapacité à contrôler pour le fond génétique presque toujours conduit à la vigueur hybride, qui peuvent se prolonger la durée de vie de la génération F1 d'un croisement entre deux souches différentes pour des raisons non liées à la manipulation destinée 13. Ce facteur est particulièrement préoccupant lorsque vous utilisez le système GAL4-UAS. Pour les interventions de l'environnement (par exemple, un traitement médicamenteux, l'alimentation, température, etc), il est conseillé d'étudier les effets de l'intervention sur plus d'une souche. Enfin, les deux 16 ans l'âge des parents et le stress 17 peut influencer la longévité de la génération F1, et pour cette raison, les jeunes adultes sains devraient être choisis pour la production d'œufs.

Des aspects importants de contrôle de l'environnement des larves / nymphes inclure la prévention de la surpopulation et le maintien d'un environnement contrôlé avec une réglementation stricte de la lumière-obscurité périodes, l'humidité et la température. Ces facteurs auront une incidence à la fois le moment de developpement et de la qualité physique des adultes qui en résultent. Indésirables environnements larvaires, comme la densité des larves élevées, peut conduire à une activation du stress inductibles par des facteurs (par exemple, l'expression des protéines de choc thermique) qui sont connus pour influer sur la longévité des adultes 18.

Au cours de la phase adulte, une attention particulière à l'environnement demeure essentielle. Le choix du régime alimentaire seul peut grandement influer sur la durée de vie et peut interagir avec des facteurs génétiques pour produire l'alimentation des effets spécifiques sur la longévité. En outre, certaines alternatives communes de base alimentaires (extrait de levure au lieu de la levure de bière lyophilisée entier) peut réduire considérablement la durée de vie 19, en laissant ouverte la possibilité que la nourriture elle-même est une source de stress organismique qui peut nuire à l'évaluation de la longévité. Dans cet article, nous avons mis en évidence les sources potentielles de stress dans l'environnement alimentaire y compris les anomalies physiques dans les aliments (par exemple, des bulles, de la mousse, des fissures, des bactéries, etc) qui peuvent physically piéger les animaux. Le remplacement régulier de nourriture ancienne avec des produits frais (au moins trois fois par semaine) peut surmonter beaucoup de ces difficultés. En outre, la température de 20, humidité (observations personnelles), l'éclairage 21, et la présence de congénères (environnement social) 22 peuvent tous moduler la durée de vie, et attention au contrôle de ces facteurs au sein de l'expérience est importante pour éviter les biais dans les résultats. Alors que le nombre de mouches dans un flacon diminue avec le temps, nous avons constaté que l'utilisation de l'anesthésie pour ajuster le nombre de mouches peut augmenter la mortalité d'une manière dépendante de l'âge (Pletcher, observations personnelles), et nous ne recommandons pas cette procédure. La position exacte des flacons dans un incubateur est également un facteur, même dans un environnement apparemment contrôlé. Randomisée distribution physique des groupes expérimentaux avec des contrôles peuvent atténuer les biais liés au placement flacon et est nécessaire pour l'inférence statistique appropriée. Même avecdes conditions soigneusement contrôlées, de légères différences peuvent être observées entre les expériences et l'utilisation de l'intérieur d'expérimentation contrôles est essentielle.

Approches d'alimentation alternatives ont été proposées pour l'analyse durée de vie, y compris une approche d'alimentation capillaire (méthode CAFE) 23. Cette méthode excelle dans la capacité de fournir des mesures précises de la consommation alimentaire, mais il en résulte de façon marquée à vie courte mouches 24. Contraintes potentielles liées à l'environnement allaitement doit être considérée lors de l'évaluation de la relation entre l'alimentation et combiné des facteurs génétiques de la longévité globale.

L'analyse démographique, notamment le calcul des taux de survie et les courbes de mortalité peuvent révéler beaucoup d'informations sur la dynamique du vieillissement de la population. Une courbe de survie typique restera relativement stable pendant une longue période tôt dans la vie et d'accroître son taux de déclin chez les personnes âgées, ce qui correspond à une période de f faible mortalitéollowed par une période d'une augmentation exponentielle de la mortalité. Un environnement stressant volonté manifeste habituellement comme un excès de décès prématurés dans la population et une baisse anormale de la courbe de survie. Bien qu'un tel résultat peut indiquer des différences significatives entre les traitements, il ne sera normalement pas robuste à la réplication. Nous recommandons donc au moins deux indépendants (c.-à-contemporaine) répétés expériences soient exécutées avant toute conclusion ferme sont tirées. Il se peut que des efforts supplémentaires pour augmenter la taille de l'échantillon, le contrôle des conditions d'élevage et l'amélioration de la santé des stocks parentaux est nécessaire.

Censure à droite (retrait des animaux de l'expérience qui s'échappent ou sont présumés morts de causes accidentelles) des animaux qui meurent de conditions de stress doit être appliqué avec une extrême prudence. Strictement parlant, la censure doit se produire au hasard dans tous les traitements expérimentaux, et si l'expérimentation interventisur la sensibilité au stress module, on peut appliquer un traitement par inadvertance la sélection au niveau de la population. En règle générale, éviter la présence de facteurs qui pourraient produire ambiguë mort précoce (principalement associée à la source de nourriture) est meilleure que la censure, et la censure ne devrait être appliquée pour les organismes qui ont été observés à mourir ou s'échapper lors de la manipulation physique.

Une dernière considération est l'évaluation de la signification statistique. Alors que les grandes tailles d'échantillon de la cohorte de fournir une puissance impressionnante de distinguer de petites différences entre les traitements, la signification biologique potentielle d'une telle différence doit aussi être pris en considération. Avec des expériences de longévité de taille raisonnable, des différences aussi faibles que 1-2% sont souvent statistiquement très significative, mais l'impact global de l'intervention sur l'état de santé peut être mineur. Par conséquent, la signification statistique et biologique doit être pris en compte lors de l'interprétation des résultats globaux de l'expérience. Inference sur le processus de vieillissement à partir d'expériences de survie peuvent être complétées par des mesures liées à l'âge du déclin des mesures de santé comportementale ou physiologique, y compris capacité à monter 25 et intégrité de la paroi gastro-7.

En résumé, l'organisme modèle Drosophila un choix attrayant pour étudier les mécanismes du vieillissement. Avec une technique expérimentale minutieuse, solide analyse démographique peut donner une idée de l'impact de facteurs pharmacologiques et génétiques sur le processus de vieillissement.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par un financement de la Fondation Ellison Medical (SDP, http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) et le NIH R01AG030593 (SDP). Ce travail a utilisé les ressources de la base Drosophila vieillissement (CAD) de l'amortisseur Nathan Centre d'excellence en biologie du vieillissement financée par le National Institute of Aging P30-AG-013283 ( http://www.nih.gov/ ). Les auteurs tiennent à remercier le Laboratoire Pletcher pour des discussions utiles et notamment Brian Chung pour la lecture critique du manuscrit. Nous tenons à remercier Nick Asher et Kathryn Borowicz de l'aide pour la collecte de données.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active Dry Yeast Fleishmann’s Yeast 2192
Grape Agar Powder Premix Genesee Scientific 47-102
Large Embryo Collection Cages Genesee Scientific 59-101
Large Replacement End Caps Genesee Scientific 59-103
6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene Genesee Scientific 32-130
Flugs Closures for Stock Bottles Genesee Scientific 49-100
Drosophila Vials, Wide, Polystrene Genesee Scientific 32-117
Flugs Closures for Wide Vials Genesee Scientific 49-101
Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul Denville Scientific P1105-CP
Flystuff Flypad, Standard Size Genesee Scientific 59-114
BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; Fisher Scientific 08-757-12
Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow Fisher Scientific 10-200-47
PBS pH 7.4 10x Invitrogen 70011044
Gelidium Agar Mooragar n/a
Brewer's Yeast MP Biomedicals 0290331280
Granulated Sugar Kroger n/a
Tegosept Genesee Scientific 20-266 Fly Food Preservative
Propionic Acid, 99% Acros Organics 149300025 Fly Food Preservative
Kanamycin Sulfate ISC BioExpress 0408-10G
Tetracycline HCl VWR 80058-724

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toivonen, J. M., et al. No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects. PLoS Genet. 3, e95 (2007).
  2. Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. Testing an 'aging gene' in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background. Aging Cell. 2, 123-130 (2003).
  3. Burnett, C., et al. Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila. Nature. 477, 482-485 (2011).
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Mesure de la durée de vie en<em&gt; Drosophila melanogaster</em
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Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (71), e50068, doi:10.3791/50068 (2013).More

Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (71), e50068, doi:10.3791/50068 (2013).

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