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Biology

एलिगेंस Chemotaxis परख

doi: 10.3791/50069 Published: April 27, 2013

Summary

मात्रात्मक की chemotactic प्रतिक्रिया के मूल्यांकन की पद्धति

Abstract

कई जीवों कीमोटैक्सिस, खाद्य स्रोतों बाहर की तलाश हानिकारक पदार्थों से बचने, और साथियों को खोजने के लिए उपयोग करें. Caenorhabditis एलिगेंस प्रभावशाली कीमोटैक्सिस व्यवहार किया है.

एक odorant को कीड़े की प्रतिक्रिया का परीक्षण करने के पीछे आधार यह एक क्षेत्र में उन्हें जगह और एक odorant के जवाब में पैदा आंदोलन का पालन है. यहां तक कि कई उपलब्ध assays के साथ, एक महत्वपूर्ण नमूना आकार को बनाए रखते हुए, एक दूसरे के साथ कीड़े की बातचीत, जबकि न्यूनतम नियंत्रण और परीक्षण दोनों क्षेत्रों के सापेक्ष स्थान शुरू कीड़ा अनुकूलन प्रगति 1-10 में एक काम रहता है. यहाँ वर्णित विधि Bargmann एट अल. 1 द्वारा विकसित की परख संशोधित करके इन मुद्दों का समाधान करना है. एक पेट्री डिश चार quadrants में बांटा गया है, 'टेस्ट मैच' और दो के रूप में चिह्नित दो विपरीत चतुर्भागों "नियंत्रण" नामित कर रहे हैं. संवेदनाहारी सभी परीक्षण और नियंत्रण साइटों में रखा गया है. कीड़े एक circl साथ थाली के केंद्र में रखा जाता हैई गैर चलता - फिरता कीड़े ध्यान नहीं दिया जाएगा कि यह सुनिश्चित करने के लिए मूल के आसपास चिह्नित. एक चार चतुर्थ भाग प्रणाली का उपयोग करने के बजाय एक 2 या दो 1 की परवाह किए बिना वे शुरू किया मूल के पक्ष में, वे परीक्षण और नियंत्रण के नमूने से समान दूरी पर स्थित हैं, के रूप में कीड़े के आंदोलन में पूर्वाग्रह समाप्त. इस कीड़े देरी या उन्हें अपने निर्धारित पथ से एक गलत व्याख्या उपज, एक अधिक घुमावदार मार्ग लेने के लिए मजबूर कर सकते हैं जो एक odorant, पर प्रतिक्रिया के लिए अन्य कीड़े का एक समूह के माध्यम से यात्रा करने के लिए मजबूर किया जा रहा कीड़े की समस्या circumvents. इस पद्धति का भी एक बड़ा नमूना आकार वाले और शोधकर्ता नायाब परख चलाने और आवंटित समय समाप्त हो गया है एक बार कीड़े स्कोर करने की अनुमति देकर व्यावहारिक लाभ से पता चलता है.

Introduction

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वार्ड पहले 1973 में 5 कीमोटैक्सिस परख विकसित की है, और उसके बाद से यह दूरगामी अनुप्रयोगों पड़ा है. तंत्रिका जीव विज्ञान कीमोटैक्सिस assays के एक किस्म का उपयोग करने से लाभान्वित किया है कि एक क्षेत्र है. घ्राण अनुकूलन, सीखने और स्मृति का एक सरल फार्म, सी में प्रदर्शित किया गया है chemotaxis assays 6 का उपयोग एलिगेंस. उन्होंने यह भी दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि सी. एलिगेंस इथेनॉल कीड़े के व्यवहार plasticity को दर्शाता है कि न केवल सहिष्णुता एक परिणाम विकसित कर सकते हैं, लेकिन वह भी कीड़े मनुष्यों 3 में शराब पर निर्भरता के अध्ययन में बहुत उपयोगी हो सकता है दिखाता है. Assays भी सी. की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए विकसित किया गया है एलिगेंस संघों chemoattractants और भोजन (OP50) 7 के बीच कीड़े द्वारा बनाई गई हैं कि दिखाकर लघु और दीर्घकालिक स्मृति की दुकान. इसके अतिरिक्त, सी. के बारे में वर्तमान में उपलब्ध व्यापक जानकारी दी एलिगेंस जीनोम, chemotaxiसी. का व्यवहार एलिगेंस म्यूटेशन 1,8 उत्प्रेरण द्वारा कई बार बदला गया है. इस तरह के सी. के विकास के रूप में कई रोमांचक इंजीनियरिंग संभावनाओं के लिए अनुमति देता है एक जैविक उपचार उपकरण के रूप में एलिगेंस. इस प्रकार, 1973 में कीमोटैक्सिस परख के प्रारंभिक विकास के बाद से, यह अक्सर बदल दिया है और विषयों की एक किस्म में रहस्यों को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

कुछ assays एक लक्ष्य की ओर कीड़े द्वारा उठाए गए विशिष्ट मार्ग की खोज के उद्देश्य से. इस तरह का प्रोटोटाइप परख वार्ड 5 से विकसित किया गया था. तीन कीड़े 15 मिनट के लिए पिघल अगर पर रखा गया था. उनके आंदोलनों वे प्लेट के केंद्र में एक attractant के लिए एक ढाल ऊपर प्लेट की परिधि से कूच के रूप में उन्हें छोड़ दिया छाप द्वारा पता लगाया गया. थाली पर सभी कीड़े प्रत्येक परीक्षण के अंत में क्लोरोफॉर्म का उपयोग करते हुए गिरफ्तार किया गया. इस विधि से एक वंशज attractant और नियंत्रण एक साथ थाली के बीच में एक कीड़ा रखामूल 2 से टी के बराबर और विपरीत दूरी.

पियर्स-शिमोमुरा एट अल. कीमोटैक्सिस 9 में शामिल आंदोलन की सही प्रकृति का निरीक्षण करने के लिए एक परख विकसित. व्यक्तिगत कीड़े attractant के स्रोत में बनी 9 सेमी पेट्री डिश attractant या एक रेडियल आकार ढाल के एक समान एकाग्रता युक्त या तो में रखा गया था. कीड़ा मान्यता प्राप्त है कि एक कंप्यूटर सॉफ्टवेयर प्रोग्राम मनाया व्यवहार रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एक खुर्दबीन से जुड़ी एक वीडियो कैमरा परख कीड़ा देखने के क्षेत्र में बने रहे यह सुनिश्चित करने के लिए दौड़ा के रूप में स्वतः पेट्री डिश समायोजित करने के लिए मंच के साथ संयोजन के रूप में काम किया. इस से, और अधिक विस्तृत जानकारी सी. द्वारा प्रदर्शित pirouettes के कारण के बारे में खोज की थी एलिगेंस.

यहाँ वर्णित एक के समान अन्य assays, परीक्षण यौगिकों के लिए कीड़े की एक बड़ी आबादी की प्रतिक्रिया का परीक्षण किया. दो चतुर्थ भाग chemotaxis assays किया गया हैविभिन्न न्यूरॉन्स, रिसेप्टर्स, और संकेत पारगमन अणु जब सी. निभाई भूमिकाओं कि पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया एलिगेंस विभिन्न यौगिकों 1 के संपर्क में था. 20-50 के बीच धोया कीड़े संवेदनाहारी, सोडियम azide (नेन 3) के साथ ध्रुवीय सिरों पर एक attractant और एक नियंत्रण के साथ प्लेट के केंद्र के पास रखा गया था. 60 मिनट के बाद, -1.0 से 1.0 तक मूल्यों के साथ एक chemotactic सूचकांक attractant के या नियंत्रण से चिपका रहे थे कि कितने कीड़े के बीच के अंतर के आधार पर उत्पन्न किया गया था. पहले परख सख्ती गैर चलता - फिरता कीड़े का मूल्यांकन करने में विफल रहा है, हालांकि एक समान chemotactic सूचकांक, इस लेख में बताया परख में इस्तेमाल किया गया था. यह परख तो आगे कीमोटैक्सिस पर न्यूरोनल पृथक के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए लागू किया गया था.

100-200 कीड़े चार quadrants 3 युक्त एक थाली के केंद्र में रखा गया है, जहां ऊपर उल्लिखित परख की एक और बदलाव किया गया था. निकटस्थ चतुर्भागों या तो या परीक्षण निहितपदार्थ नियंत्रण. पिछले assays में के रूप में, कीड़े बनाए जा रहा से पहले सोडियम azide की कार्रवाई से स्थिर किया गया. ऐसा ही एक विधि सी. की प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के तरीके के रूप में यहाँ वर्णित है विभिन्न यौगिकों के लिए एलिगेंस. हालांकि, नीचे विधि केवल स्थिर कीड़े से मोबाइल को अलग करने के लिए एक सीमा से दूरी पारित कर दिया है कि कीड़े के मूल्यांकन के अतिरिक्त लाभ है.

अन्य assays स्थिर कीड़े की अनदेखी के लिए इसी तरह के दिशा निर्देशों को शामिल किया है. Frøkjær-जेन्सेन एट अल. अस्थिर और पानी दोनों घुलनशील यौगिकों 10 परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एक बहुमुखी परख विकसित. एक पेट्री डिश चार quadrants में विभाजित किया गया था. ऊपर और नीचे चतुर्भागों सॉल्वैंट्स शामिल नहीं किया था. बाएं चतुर्थ भाग पानी निहित, और सही attractant के निहित. पानी में घुलनशील यौगिकों आगा पर सीधे रखा गया जबकि अस्थिर odorants जब परीक्षण, विश्लेष्य, उचित वृत्त का चतुर्थ भाग के ऊपर, डिश के ढक्कन पर रखा गया थाआर.

सी. के chemotactic प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए वर्तमान में अस्तित्व में तरीकों एलिगेंस लगातार उपयोग, दक्षता, और सटीकता के उनके आराम का अनुकूलन करने के लिए परिष्कृत किया जा रहा है. यहाँ वर्णित परख कीड़े की सबसे बड़ी संख्या (. अधिकतम प्रवाह: 250 कीड़े / प्लेट प्रति घंटा, ली एट अल 3 द्वारा प्रदर्शन throughput की तुलना में थोड़ा अधिक) का आकलन करने की क्षमता है तो, जबकि, इस विधि की असली ताकत है पहले assays के (1 टेबल) की विशेषताओं में से कई का संक्षिप्त परिणति.

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Protocol

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1. कीड़े की तैयारी / वाशिंग

  1. युवा वयस्क 11 से कीड़े सिंक्रनाइज़.
  2. एक 5 सेमी Chemotaxis थाली पर एस बेसल के पिपेट 2 मिलीलीटर सिर्फ OP50 ई. के लॉन मंजूरी दे दी है कि कीड़े का मंचन कोलाई. कीड़े बफर में थाली सतह से धो रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए जरूरत के रूप में थाली झुकाएँ.
  3. एक microcentrifuge ट्यूब में कीड़ा एस बेसल समाधान के पिपेट 1 मिलीलीटर.
  4. 10 सेकंड 6,600 rpm पर एक PicoFuge का उपयोग करने के लिए अपकेंद्रित्र.
  5. अबाधित कीड़े की गोली छोड़ने, एस बेसल महाप्राण.
  6. कीड़े धोने के लिए एक बार कुछ पलटना, microcentrifuge ट्यूब 1 मिलीलीटर एस बेसल समाधान जोड़ें.
  7. कदम 1.4-1.6 एक और तीन बार दोहराएँ.
  8. 10 सेकंड पांचवी बार, सीए की अंतिम मात्रा को तैरनेवाला aspirating इस समय के लिए अपकेंद्रित्र. 100 μl.
  9. प्रत्येक 2 μl नमूने में 50 और 250 के बीच कीड़े कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए एक एन जी एम थाली पर कीड़े के पिपेट 2 μl. समायोजित करेंएस बेसल की एक छोटी या बड़ी मात्रा में कीड़े resuspending द्वारा की जरूरत के रूप में एस बेसल में कीड़े की एकाग्रता.
  10. तुरंत 1 घंटा करने के लिए कीड़े धोने के बाद परख में कीड़े का प्रयोग करें.

2. टेस्ट प्लेट्स की तैयारी

  1. एक 5 सेमी प्लेट के नीचे चिह्नित, 4 बराबर quadrants में पकवान विभाजित करते हैं. Chemotaxis अगर या एन जी एम इस्तेमाल किया जा सकता है. 3 परीक्षण की एक न्यूनतम परीक्षण किया जा रहा आनुवंशिक तनाव के प्रति आवश्यक हैं.
  2. मूल के आसपास त्रिज्या 0.5 सेमी (चित्रा 1) के एक चक्र में चिह्नित करें.
  3. "टेस्ट" या साइटों के मूल और एक दूसरे से समान दूरी पर हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक "सी" "नियंत्रण" के लिए या तो एक "टी" के साथ प्रत्येक चक्र में एक बिंदु चिह्नित. अंक कम से कम 2 सेमी दूर मूल से होना चाहिए. परीक्षण चतुर्भागों और शीर्ष अधिकार और नियंत्रण के रूप में नीचे बाएँ चतुर्भागों (चित्रा 1) के रूप में ऊपर छोड़ दिया और नीचे सही चतुर्भागों चिह्नित करें.

3. परख रनिंग

  • परीक्षण परिसर और 0.5 एम azide (एक संवेदनाहारी एक वृत्त का चतुर्थ भाग पर पहुंचने पर कीड़े गिरफ्तार करने के लिए प्रयोग किया जाता है) के बराबर मात्रा के संयोजन के द्वारा परीक्षण समाधान मिश्रण. 0.5 एम azide के साथ परीक्षण परिसर पतला करने के लिए इस्तेमाल किया विलायक संयोजन से नियंत्रण समाधान मिश्रण.
  • मूल पर गोली से कीड़ा समाधान (1.8 में तैयार) (दो पंक्तियाँ एक दूसरे को काटना है) की पिपेट 2 μl.
  • दो "टी" साइटों पर परीक्षण समाधान के तुरंत बाद, पिपेट 2 μl. इसी तरह, दो "सी" साइटों पर नियंत्रण समाधान का एक ही राशि विंदुक.
  • कीड़ा और odorant बूंदों अगर में अवशोषित किया गया है एक बार, ढक्कन की जगह और प्लेट पलटना.
  • 60 मिनट के बाद, एक 4 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कीड़े जगह है. यह गिना जा सकता है जब केवल इनक्यूबेटर से एक प्लेट हटा दें. कमरे के तापमान पर कीड़े छोड़कर उन्हें फिर से जुटाने की अनुमति दे सकता है.
  • पूरी तरह से आंतरिक circ के पार कर गया है कि प्रत्येक चक्र में कीड़े की संख्या रिकार्डले.
  • परीक्षण और नियंत्रण चतुर्भागों दोनों में नियंत्रण समाधान का उपयोग कर कदम 3.2-3.6 दोहराएँ. इस नियंत्रण थाली के रूप में काम करेगा. तीन ऐसे प्लेटों बना दिया है और एक उचित नियंत्रण के रूप में काम करने के लिए चलाई जानी चाहिए.
  • 4. स्कोर की व्याख्या / Chemotaxis सूचकांक का निर्धारण

    1. 1 समीकरण का उपयोग कर कीमोटैक्सिस सूचकांक की गणना. इस -1.0 और 1.0 के बीच एक chemotactic सूचकांक निकलेगा.

    (1)

    Chemotaxis सूचकांक = (टेस्ट चतुर्भाग दोनों में # कीड़े - दोनों नियंत्रण quadrants में # कीड़े) / (रन बनाए कीड़े की # कुल)

    एक 1.0 स्कोर लक्ष्य के प्रति अधिक से अधिक आकर्षण का संकेत है और रासायनिक लक्ष्य युक्त quadrants में पहुंचने से कीड़े की 100% का प्रतिनिधित्व करता है. -1.0 की एक सूचकांक अधिकतम प्रतिकर्षण का सबूत है. इसी प्रकार की परख तरीकों पहले से ही 3 (1 टेबल) नियोजित किया गया है.

    1. मतलब Chemotaxi रिपोर्टएस सूचकांक (सीआई) और की मानक त्रुटि (SEM) का मतलब. एक छात्र की टी परीक्षण परीक्षण और नियंत्रण प्लेटों से डेटा की तुलना प्रदर्शन करना.

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    Representative Results

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    जंगली प्रकार (एन 2) सी. मुकाबले ओडीआर-10 (ky10) उत्परिवर्ती को एलिगेंस.

    हम एक ज्ञात सी. diacetyl इस्तेमाल किया एलिगेंस chemoattractant, diacetyl 1,12 के लिए रिसेप्टर का अभाव है कि एक उत्परिवर्ती की है कि wildtype कीड़े तुलना करने के लिए. Wildtype (एन 2) कीड़े के लिए chemotactic सूचकांक इथेनॉल, और 0.839-0.100 ± 0.066 था ± .031-0.5% diacetyl. जैसी कि उम्मीद थी, diacetyl जंगली प्रकार के कीड़े (पी <0.003) से एक महत्वपूर्ण chemoattractive प्रतिक्रिया elicits. इसके विपरीत diacetyl रिसेप्टर्स अभाव है जो ओडीआर-10 (ky10) म्यूटेंट नियंत्रण (चित्रा 3) से काफी अलग नहीं था कि एक diacetyl सीआई था.

    लेखक # कीड़े / प्लेट अवधि (मिनट) 1 घंटा थ्रूपुट (अधिकतम # कीड़े) पेशेवरों विपक्ष
    वार्ड 5 3 15 12 • ट्रैक आंदोलन
    स्पष्ट अवलोकन द्वारा स्थिर कीड़े के लिए • खाता
    शोधकर्ता भागीदारी @ थोड़े समय के अंतराल (15 मिनट) पर निर्भर
    Bargmann और Horvitz 2 1 60 1 • कम थ्रूपुट
    12-24 घंटे के लिए • attractant के diffuses
    Bargmann, Hartwieg, Horvitz 1 20-50 60 50 • न्यूनतम शोधकर्ता भागीदारी (नेन 3 प्रयुक्त)
    • मध्यम # कीड़े
    • कोई विचारशील स्थिर स्कोरिंग विधि
    • आंदोलन को ट्रैक नहीं करता
    ली, जेईई, McIntire 3 100-200 60 200 • न्यूनतम शोधकर्ता भागीदारी (नेन 3 प्रयुक्त)
    # • उच्चकीड़े
    पियर्स-शिमोमुरा, मोर्स, Lockery 9 1 20 (या थाली का कीड़ा हिट जब तक धार) 3 • ट्रैक आंदोलन
    स्पष्ट अवलोकन द्वारा स्थिर कीड़े के लिए • खाता
    कीड़ा आंदोलन की • विस्तृत, स्थायी रिकार्ड
    उन्नत कंप्यूटर प्रणाली पर नज़र रखने की आवश्यकता है
    मार्गी, पामर, चिन गाया (इस विधि) 50-250 60 250 • न्यूनतम शोधकर्ता भागीदारी (नेन 3 प्रयुक्त)
    स्थिर कीड़े के लिए • उच्च # कीड़े • खातों
    • आंदोलन को ट्रैक नहीं करता

    तालिका 1. परख तरीकों की तुलना में वर्णित है.


    चित्रा 1. 5 सेमी पेट्री डिश चार quadrants, टेस्ट ("टी") या नियंत्रण ("सी") क्षेत्र के रूप में भी नामित प्रत्येक में विभाजित है. आंतरिक चक्र आंदोलन स्कोरिंग नहीं होती है जहां एक क्षेत्र रूपरेखा बनाती है. इस डेटा skewing से स्थिर कीड़े से बचाता है. चतुर्भागों टेस्ट की एक बारी पैटर्न बनाने और कीड़े की प्रारंभिक नियुक्ति से उत्पन्न हो सकने वाली किसी भी पूर्वाग्रह को रोकने के लिए नियंत्रण रखें.

    चित्रा 2
    चित्रा 2. परख का एक योजनाबद्ध ली एट अल. (2009) से रूपांतरित किया. प्लेट्स चतुर्भागों दो परीक्षण (ए और बी) और दो ​​नियंत्रण (सी एंड डी) में बांटा जाता है. सोडियम azide भी कीड़े पंगु को टेस्ट और नियंत्रण के धब्बे के साथ शामिल है. कीड़े प्लेट के केंद्र में रखा जाता है और 60 मिनट के बाद कीड़े प्रत्येक क्वाड्रा पर गिने जाते हैंNT के. आंतरिक चक्र को पार नहीं किया व्यक्तियों है कि रन नहीं कर रहे हैं. तटस्थ और attractant के योजनाबद्ध उदाहरण संकेत कर रहे हैं. Chemotactic सूचकांक (सीआई) गणना के नीचे दिखाया गया है.

    चित्रा 3
    चित्रा 3. एक परीक्षण attractant या इथेनॉल (नियंत्रण प्लेटें) के रूप में या तो diacetyl उपयोग कर जंगली प्रकार (भार) और ओडीआर-10 (ky10) कीड़े के साथ प्रदर्शन assays से उत्पन्न chemotactic सूचकांक. मान कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगों (एन> 200 कीड़े) से औसत हैं हर हालत के लिए. त्रुटि सलाखों मतलब की मानक त्रुटि को प्रतिबिंबित SEM) (* = पी <0.003 छात्र की टी परीक्षण.

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    Discussion

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    Chemotaxis, neuronal और सेलुलर तंत्र की एक जटिल सेट के द्वारा नियंत्रित हालांकि, आसानी से और निष्पक्ष कीमोटैक्सिस assays का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. Assays से सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए जाने चाहिए. सबसे पहले, कीड़े मंचन लगातार प्रयोगात्मक परिणाम उपज में आवश्यक है. विभिन्न जीवन चरणों में कीड़े अलग ढंग से 13 से व्यवहार करते हैं, तो मिश्रित चरण कीड़े हो सकता है तिरछा प्रयोगात्मक परिणाम है. दूसरे, सब ई. सुनिश्चित करना अवशिष्ट बैक्टीरिया परख के साथ हस्तक्षेप कर सकता है कोलाई कीड़े धुल जाता है, महत्वपूर्ण है. संवेदनाहारी, 0.5-1 एम सोडियम azide, यह रखा गया था जहां से एक 1 सेमी दायरे में कीड़े गिरफ्तार करेगी कि यह नोट करना भी जरूरी है. यह देखते हुए, यह azide के मूल से कम से कम 2 सेमी रखा जाएगा कि सर्वोपरि है. Azide के मूल से 1.5 सेमी या उससे कम देखा जाता है, तो कीड़े अंदरूनी सर्कल के भीतर रुक जाएगा और कोई भी बना दिया जाएगा. आगे azide में, आगे रखा गया हैचतुर्भागों कीड़े स्थानांतरित कर सकते हैं. प्लेट्स भी परीक्षण भर में स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए और परिणाम गुरुत्वाकर्षण पूर्वाग्रहों से चकित नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए स्तर रखा जाना चाहिए. इसके अलावा, कोई 250 से अधिक कीड़े प्रयोग में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. भीड़ के एक नंबर के कारणों के लिए कीड़ा आंदोलन में बाधा हो सकती है. हम क्लस्टर कीड़े एक वृत्त का चतुर्थ भाग के लिए यात्रा करने के पक्ष में, एक साथ रह जाते हैं कि पाया. अंत में, 60 मिनट के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर परख प्लेटें रखकर यह गिना जा करने में सक्षम है जब तक शोधकर्ता थाली के राज्य की रक्षा करने के लिए अनुमति बढ़ने से कीड़े रहता है. प्लेट्स 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और परिणाम को प्रभावित किए बिना कई दिनों के बाद रन कर सकते हैं.

    कुछ प्रक्रियात्मक संशोधन आगे इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता बढ़ाने के लिए कर सकते हैं. है, इस प्रोटोकॉल अलग परीक्षणों में phenotypes की एक किस्म का परीक्षण करने की एक विधि के रूप में काम कर सकते हैं. आदर्श रूप में, उत्परिवर्ती परीक्षणों के परिणामों का एक ही परिस्थितियों में तुलना की जानी चाहिए. उपभेदों का उपयोग करना है कि एक्सप्रेस fluorescऐसे GFP या आरएफपी के रूप में ईएनटी प्रोटीन यह पूरा होगा. यह संशोधन उसी परख प्लेट और एक प्लेट स्कोरिंग के बजाय परीक्षण बनाम नियंत्रण प्लेटें स्कोरिंग के लाभ पर विभिन्न प्रकारों रखकर शोधकर्ता अधिक प्रयोगात्मक स्थिरता देना होगा.

    Chemotaxis assays भी अनुवांशिक इंजीनियर निमेटोड कीड़े की chemotactic व्यवहार को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह परीक्षण किया जा करने के लिए अन्य प्रजातियों से लिया रिसेप्टर्स के बंधन आत्मीयता की अनुमति देता है. इन रिसेप्टर्स एक संगत ढंग से कृमि के chemoattractant या chemorepulsive न्यूरॉन्स में व्यक्त कर रहे हैं, उम्मीद chemotactic परिणाम 8 मनाया जाना चाहिए.

    इस प्रोटोकॉल आगे के रूप में अच्छी तरह से अन्य आवश्यकताओं के अनुरूप रूपांतरित किया जा सकता है. वर्तमान में, इस विधि अन्वेषक कीड़े के आंदोलन को ट्रैक करने की अनुमति नहीं है. 5 सेमी प्लेटों इन assays के लिए स्वीकार्य हैं, क्योंकि एक stereomicroscope से जुड़ी एक वीडियो कैमरा प्रभावी ढंग से आंदोलन फिल्म कर सकते हैंएक motorized मंच और कीड़ा ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के इस्तेमाल के बिना परख से एक वृत्त का चतुर्थ भाग की ओर कीड़े की. Chemoattractants मुख्य रूप से प्रोटोकॉल में परीक्षण यौगिकों के रूप में भेजा जाता है, हालांकि अंत में, chemorepellents भी इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल के रूप में है या संशोधित, सरल और कुशल है और सी. के chemotactic व्यवहार बढ़ाता के लिए एक प्रभावी उपकरण के रूप में काम कर सकते हैं एलिगेंस, या उच्च विद्यालय या स्नातक स्तर पर छात्रों को व्यवहार प्रदर्शन के लिए.

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    Disclosures

    हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

    Acknowledgments

    हम लाइफ साइंसेज और इस काम के वित्तपोषण के लिए क्वींस विश्वविद्यालय में कला और विज्ञान संकाय धन्यवाद. साथ ही, हम आवश्यक अभिकर्मकों, उपकरण और तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए चिन गाया प्रयोगशाला धन्यवाद. हम भी चर्चा में उनके योगदान के लिए वह विशेष रूप से टोनी, QGEM 2011 धन्यवाद.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave
    PicoFuge Stratagene 400552
    Microscopes Leica
    Dissecting Leica
    P1000 Pipette Gilson
    P10 Pipette Gilson
    0.5 M Sodium Azide
    Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
    Ethanol/Distilled Water
    Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)
    Agar Bio-Rad 166-0600
    NH4Cl Amresco CA97062-046
    MOPS VWR CA12001-120
    NH4OH BDH CABDH8641-2
    0.25% Tween 20 Bio-Rad 170-6531

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    References

    1. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-527 (1993).
    2. Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7, 729-742 (1991).
    3. Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. Ethanol preference in C. elegans. Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).
    4. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).
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    <em>एलिगेंस</em> Chemotaxis परख
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    Cite this Article

    Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans Chemotaxis Assay. J. Vis. Exp. (74), e50069, doi:10.3791/50069 (2013).More

    Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans Chemotaxis Assay. J. Vis. Exp. (74), e50069, doi:10.3791/50069 (2013).

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