C. elegans Chemotaxis Assay

Summary

Procédé d'évaluation quantitative de la réponse chimiotactique des

Abstract

De nombreux organismes utiliser chemotaxis à rechercher des sources de nourriture, éviter les substances nocives, et trouver des partenaires. Caenorhabditis elegans a un comportement de chimiotactisme impressionnant.

La prémisse de tester la réponse des vers à une substance odorante est de les placer dans une zone et observer le mouvement évoquée en réponse à une substance odorante. Même avec les nombreux tests disponibles, l'optimisation ver lieu de départ par rapport à la fois le contrôle et d'essai, tout en minimisant l'interaction du virus avec l'autre, tout en conservant une taille importante de l'échantillon reste un travail en cours ^1-10. La méthode décrite ici a pour but de remédier à ces problèmes en modifiant le dosage développée par Bargmann et al. ^1. Une boîte de Pétri est divisé en quatre quadrants, deux quadrants opposés marqués "Test" et deux sont désignés "Control". Anesthésique est placé dans tous les essais et les sites témoins. Les vers sont placés au centre de la plaque avec une Circle marquée autour de l'origine de veiller à ce que les vers non mobiles seront ignorés. Utilisant un système à quatre quadrants plutôt que 2 ou deux 1 élimine biais dans le mouvement des vers, car ils sont à égale distance à partir d'échantillons de test et de contrôle, quel que soit le côté de l'origine, ils ont commencé. Cela évite le problème de vers peuvent être contraints de voyager à travers un ensemble d'autres vers de terre pour répondre à une substance odorante, ce qui peut retarder les vers ou les forcer à prendre une voie plus détournée, ce qui donne une interprétation erronée de leur trajectoire prévue. Cette méthode présente également des avantages pratiques en ayant une taille d'échantillon plus large et permettant au chercheur d'exécuter le test sans surveillance et marquer les vers une fois le temps imparti est écoulé.

Introduction

Ward abord développé le test de chimiotactisme en 1973 ^5, et depuis lors il a eu des applications de grande envergure. Neurobiologie est un domaine qui a bénéficié de l'aide d'une variété d'essais de chimiotaxie. Adaptation olfactive, une forme simple d'apprentissage et la mémoire, a été démontrée dans C. elegans utilisant des dosages de chimiotaxie ^6. Ils ont également été utilisés pour montrer que C. elegans peuvent développer l'éthanol tolérance un résultat qui démontre non seulement la plasticité comportementale des vers, mais qui montre aussi que les vers peuvent être très utiles dans l'étude de la dépendance à l'alcool chez l'homme ^3. Les analyses ont même été élaborés pour démontrer la capacité de C. elegans de stocker court et la mémoire à long terme, en montrant que les associations sont faites par les vers entre chemoattractants et alimentaires (OP50) ^7. En outre, étant donné les nombreuses informations disponibles au sujet de la C. elegans génome, le chemotaxile comportement de C. elegans a été modifié à plusieurs reprises par l'induction de mutations ^1,8. Cela permet de nombreuses possibilités d'ingénierie passionnants, tels que le développement de C. elegans comme un outil de bioremédiation. Ainsi, depuis le développement initial de l'essai de chimiotaxie en 1973, il a été souvent modifié et utilisé pour élucider des mystères dans une variété de disciplines.

Certains tests visant à découvrir l'itinéraire spécifique prise par les vers vers une cible. Le test prototype de ce genre a été développé par Ward ^5. Trois vers ont été placés sur gélose fondue pendant 15 min. Leurs mouvements ont été tracées par l'empreinte qu'ils ont quitté alors qu'ils se rendaient à la périphérie de la plaque jusqu'à un dégradé à un appât au centre de la plaque. Tous les vers sur la plaque ont été arrêtés avec du chloroforme à la fin de chaque essai. Un descendant de cette méthode d'une seule vis sans fin placée dans le milieu de la plaque avec l'attractif et le contrôle d'unt distances égales et opposées de l'origine ^2.

Pierce-Shimomura et al. développé un test pour observer la nature exacte du mouvement impliqué dans le chimiotactisme ^9. Vers individuelles ont été placés dans des boîtes de Pétri de 9 cm soit contenant une concentration uniforme de l'appât ou un dégradé radial en forme, aboutissant à la source de l'attractif. Un programme de logiciel d'ordinateur qui a reconnu la vis sans fin est utilisé pour enregistrer le comportement observé. Une caméra vidéo fixée à un microscope travaille en conjonction avec l'étape d'ajuster automatiquement la boîte de Pétri que l'essai de court à assurer le ver est resté dans le champ de vision. Sur cette base, des informations plus détaillées a été découvert sur ​​la cause de pirouettes affichées par C. elegans.

D'autres épreuves, plus semblable à celle décrite ici, tester la réponse d'une population de vers de composés à tester. Dosages de chimiotaxie deux quadrants ont étéutilisés pour explorer les rôles que les différents neurones, des récepteurs et des molécules de transduction des signaux lus lorsque C. elegans ont été exposés à divers composés ^1. Entre 20 à 50 vers la chaux ont été placés à proximité du centre de la plaque avec une substance attractive et d'un contrôle au niveau des extrémités polaires ainsi que l'anesthésique, l'azoture de sodium _(NaN3). Après 60 min, un indice chimiotactique avec des valeurs de -1,0 à 1,0 a été générée sur la base de la différence entre le nombre de vers de terre ont été fixés sur l'attractif ou la commande. Un indice chimiotactique similaire a été utilisée dans le dosage indiqué dans cet article, bien que le test plus tôt n'a pas réussi à évaluer rigoureusement les vers non mobiles. Ce test a ensuite été appliqué à la suite de tester les effets de l'ablation neuronale sur la chimiotaxie.

Une autre variante de l'essai ci-dessus a été réalisée de 100 à 200 où les vers ont été placés au centre d'une plaque contenant quatre quadrants ^3. Quadrants adjacents contenaient soit le test ousubstance contrôler. Comme dans les tests précédents, les vers ont été immobilisées par l'action de l'azoture de sodium, avant d'être marqué. Une méthode similaire est décrite ici comme un moyen d'évaluer la réponse de C. elegans à différents composés. Cependant, la méthode ci-dessous présente l'avantage supplémentaire de seulement évaluer les vers qui ont passé un seuil de distance séparant mobile à partir vers immobiles.

D'autres essais ont incorporé des directives similaires pour ignorer les vers immobiles. Frøkjær-Jensen et al. mis au point un test polyvalent qui peut être utilisé pour tester des composés solubles à la fois volatiles et l'eau ^10. Une boîte de Pétri a été divisé en quatre quadrants. Les quadrants du haut et du bas ne contiennent pas de solvants. Le quadrant gauche contenait de l'eau, et le droit contenait la substance attractive. Lors du test de substances odorantes volatiles, l'analyte a été placé sur le couvercle de la boîte, sur le quadrant approprié, tandis que les composés solubles dans l'eau ont été placés directement sur l'agar.

Les méthodes actuellement en vigueur pour l'évaluation de la réponse chimiotactique de C. elegans sont constamment affinés pour optimiser leur facilité d'utilisation, l'efficacité et la précision. Ainsi, alors que le test décrit ici a la capacité d'évaluer le plus grand nombre de vers (débit maximal:. 250 vers / heure par plaque, légèrement supérieur au débit démontré par Lee et al ^3); la véritable force de cette méthode est l' succinct aboutissement de plusieurs des attributs d'essais antérieurs (tableau 1).

Protocol

1. Préparation / laver les Worms

1. Synchroniser vers de jeune adulte ^11.
2. Pipette 2 ml de la Basal S sur une plaque de Chemotaxis de 5 cm de scène vers qui viennent défrichées la pelouse du OP50 E. coli. Inclinaison de la plaque en fonction des besoins pour assurer les vers sont lavées à partir de la surface de la plaque dans la mémoire tampon.
3. Pipette 1 ml de la solution Basal ver-S dans un tube de centrifugation.
4. Centrifuger pendant 10 secondes à l'aide d'un PicoFuge à 6600 rpm.
5. Aspirer le Basal S, laissant le culot de vers non perturbées.
6. Ajouter 1 ml solution Basal S au tube de centrifugation, la retournant plusieurs fois de se laver les vers.
7. Répétez les étapes 1.4 à 1.6 encore trois fois.
8. Centrifuger pendant 10 secondes une cinquième fois, cette fois aspirer le surnageant dans un volume final de ca. 100 pi.
9. Pipette 2 pl des vers sur une plaque NGM pour s'assurer qu'il n'y a entre 50 et 250 vers dans chaque échantillon 2 pl. Réglerla concentration de vers dans le Basal S au besoin en remettant en suspension les vers dans un volume plus petit ou plus grand de S basale.
10. Utilisation des vers dans l'essai immédiatement après le lavage des vers pendant jusqu'à 1 heure.

2. Préparation des plaques d'essai

1. Marquant la face inférieure d'une plaque 5 cm, il faut diviser le plat en 4 quadrants égaux. agar Chemotaxis ou NGM peuvent être utilisés. Un minimum de 3 essais sont requis pour chaque souche génétique testé.
2. Marquez un cercle de rayon de 0,5 cm autour de l'origine (Figure 1).
3. Marquer un point dans chaque quadrant soit avec un "T" pour "Test" ou "C" pour "configuration", assurant que les sites sont à égale distance de l'origine et de l'autre. Les points doivent être d'au moins 2 cm de l'origine. Marquer le coin supérieur gauche et inférieur droit quadrants comme quadrants de test et en haut à droite et en quadrants en bas à gauche que les contrôles (Figure 1).

3. Exécution de l'essai

Mélanger la solution d'essai en combinant des volumes égaux de composé d'essai et de 0,5 M d'azoture (anesthésique utilisé pour arrêter les vers de terre après avoir atteint un quart de cercle). Mélanger la solution de commande en combinant le solvant utilisé pour diluer le composé d'essai avec 0,5 M azoture.

Pipette 2 pl de la solution de ver (préparé en 1.8) de la pastille sur l'origine (où les deux lignes se croisent).

Immédiatement après, pipette 2 pl de la solution de test sur les deux sites "t". De même, une pipette la même quantité de la solution de contrôle sur les deux sites «C».

Une fois le ver et odorant gouttes ont été absorbés dans l'agar, remplacez les couvercles et retournez les plaques.

Après 60 minutes, placez les vers dans un 4 ° C incubateur. Ne retirez une plaque de l'incubateur quand il peut être compté. Laissant les vers à la température ambiante peut leur permettre de mobiliser à nouveau.

Notez le nombre de vers dans chaque quadrant qui a complètement traversé la circulaire intérieurele.

Répéter les étapes 3.2 à 3.6 à l'aide de la solution de commande dans les deux quadrants du test et de contrôle. Cela servira de la plaque de commande. Trois de ces plaques doivent être prises et exécutées pour servir un contrôle approprié.

4. Interprétation des Scores / Détermination de l'indice Chemotaxis

1. Calculer l'indice de chimiotactisme en utilisant l'équation 1. Cela donnera un indice chimiotactique entre -1.0 et +1.0.

(1)

Index Chemotaxis = (# Worms inscrites dans les quadrants d'essai - # Worms dans les deux quadrants de contrôle) / (Nombre total de Worms marqués)

Un score +1.0 indique attraction maximale vers la cible et représente 100% des vers qui arrivent dans les quadrants contenant la cible chimique. Un index de -1,0 est la preuve de répulsion maximale. Méthodes d'analyse similaires ont déjà été employées ³ (Tableau 1).

2. Signaler le Chemotaxi moyennes Index (CI) et l'erreur standard de la moyenne (SEM). Effectuez le test t de Student comparant les données des plaques d'essai et de contrôle.

Representative Results

Comparaison de type sauvage (N2) C. elegans à l'ODR-10 (KY10) mutant.

Nous avons utilisé le diacétyle, un C. connu elegans chimiotactique et de comparer les vers de type sauvage à celui d'un mutant qui manque le récepteur de diacétyle ^1,12. Par type sauvage (N2) vers l'index chimiotactique était 0,100 ± 0,066 pour l'éthanol et 0,839 ± 0,031 à 0,5% diacétyle. Comme prévu, le diacétyle provoque une réponse chimioattractives importante de vers de type sauvage (P <0,003). En revanche, les ODR-10 (KY10) mutants qui n'a pas les récepteurs diacétyle avaient une CI diacétyle qui n'était pas significativement différente de celle des témoins (Figure 3).

Auteur	# Vers / plaque	Durée (min)	1 h débit (Max # vers)	Pros	Moins
Ward 5	3	15	12	• Le mouvement de piste • compte des vers immobiles par l'observation claire	dépend de la participation de chercheur @ intervalles de temps courts (15 min)
Bargmann & Horvitz 2	1	60	1		• bas débit • diffuse attractifs pour les 12-24 heures
Bargmann, Hartwieg, Horvitz 1	20-50	60	50	• La participation du chercheur minimal (NaN3 utilisé) • # vers modérés	• Aucune méthode de notation immobile discret • ne pas suivre le mouvement
Lee, Jee, McIntire 3	100-200	60	200	• La participation du chercheur minimal (NaN3 utilisé) • haut #vers
Pierce-Shimomura, Morse, Lockery 9	1	20 (ou jusqu'à ce que coups de ver bord de la plaque)	3	• Le mouvement de piste • compte des vers immobiles par l'observation claire • détaillé, enregistrement permanent des mouvements du ver	exige un système avancé de suivi informatique
Margie, Palmer, Chin-Sang (cette méthode)	50-250	60	250	• La participation du chercheur minimal (NaN3 utilisé) • HIGH # vers • comptes pour les vers immobiles	• ne pas suivre le mouvement

Tableau 1. Comparaison des méthodes de dosage décrit.

Figure 1. La boîte de Pétri 5 cm est divisé en quatre quadrants, chacun désigné soit comme test ("T") ou d'une zone de contrôle ("C"). Le cercle délimite une zone où le mouvement n'est pas marqué. Cela empêche les vers immobiles de biaiser les données. Les quadrants créer un modèle alternatif de test et de contrôle pour éviter tout biais pouvant résulter de la mise en place initiale des vers.

Figure 2. Un schéma du dosage adapté de Lee et al. (2009). Plaques sont divisées en quadrants deux essais (A & B) et deux témoins (C & D). L'azoture de sodium est également inclus avec le test et le contrôle des taches de paralyser les vers. Worms sont placés au centre de la plaque et après 60 minutes vers sont comptés sur chaque quadrant. Les personnes qui n'ont pas franchi le cercle intérieur ne sont pas notées. Exemples schématiques de neutre et attractif sont indiqués. Le calcul de l'indice de Chemotactic (CI) est indiqué ci-dessous.

Figure 3. indices chimiotactiques générés à partir des analyses effectuées par des vers de type sauvage (WT) et ODR-10 (KY10) en utilisant soit le diacétyle comme attractif de test ou de l'éthanol (plaques de contrôle). valeurs sont des moyennes d'au moins 3 expériences indépendantes (n> 200 vers) pour chaque condition. Les barres d'erreur reflètent l'erreur-type de la moyenne (SEM) * = P <T-Test de 0.003 étudiants.

Discussion

Chemotaxis, bien que contrôlé par un ensemble complexe de mécanismes neuronaux et cellulaire, peut être facilement et objectivement quantifiée en utilisant des dosages de chimiotaxie. Pour obtenir les meilleurs résultats des tests, certaines étapes cruciales doivent être prises. Tout d'abord, la mise en scène des vers est essentiel à donner des résultats expérimentaux cohérents. Worms à différents stades de la vie comportent différemment ^13; vers la scène de manière mixte peut fausser les résultats expérimentaux. Deuxièmement, s'assurer que tous les E. coli est lavé les vers est crucial, car les bactéries résiduelles peuvent interférer avec le dosage. Il est également important de noter que l'anesthésie, 0,5-1 azoture de sodium M, va arrêter vers l'intérieur d'un rayon de cm où il a été placé 1. Compte tenu de cela, il est primordial que l'azoture être placé à au moins 2 cm de l'origine. Si l'azoture est repéré 1,5 cm ou moins de l'origine les vers seront paralysés dans le cercle interne et ne seront pas notées. La poursuite de l'azoture est placé, le plus loin dans l'quadrants les vers peuvent se déplacer. Les plaques doivent également être conservés niveau pour assurer la cohérence entre les essais et pour garantir des résultats ne sont pas faussées par des biais gravitationnelles. En outre, pas plus de 250 vers doivent être utilisés dans l'expérience. Le surpeuplement peut entraver les mouvements du ver pour un certain nombre de raisons. Nous avons constaté que les vers en cluster ont tendance à rester ensemble, en faveur du déplacement à un quadrant. Enfin, en plaçant les plaques de dosage à 4 ° C après 60 min le maintient les vers de se déplacer, ce qui permet au chercheur de préserver l'état de la plaque jusqu'à ce qu'elle puisse être comptées. Les plaques peuvent conservé à 4 ° C et a marqué plusieurs jours plus tard, sans affecter les résultats.

Quelques modifications procédurales peuvent encore améliorer l'utilité de ce protocole. Comme il est, ce protocole peut servir de méthode d'essai d'une variété de phénotypes dans des procès séparés. Idéalement, les résultats des essais mutants doivent être comparés dans les mêmes conditions. En utilisant des souches qui expriment Déessrents des protéines telles que la GFP ou RFP seraient accomplir cette tâche. Cette modification permettrait au chercheur une plus grande cohérence expérimental en plaçant les différentes souches sur la même plaque de dosage et l'avantage de marquer une plaque au lieu de marquer des plaques d'essai versus contrôle.

Dosages de chimiotaxie peuvent également être utilisés pour caractériser le comportement chimiotactique des vers nématodes génétiquement modifiés. Cela permet à l'affinité de liaison de récepteurs provenant d'autres espèces à tester. Si ces récepteurs sont exprimés dans les neurones chimioattractives ou chemorepulsive du ver d'une manière compatible, résultats chimiotactiques attendus doivent être observées ^8.

Ce protocole peut être plus adapté à d'autres besoins aussi bien. Actuellement, cette méthode ne permet pas à l'enquêteur de suivre le mouvement des vers. Parce que les plaques de 5 cm sont acceptables pour ces analyses, une caméra vidéo fixée à un microscope stéréoscopique peut effectivement filmer le mouvementdes vis sans fin vers un quadrant de l'essai, sans l'utilisation d'une platine motorisée et un logiciel de suivi de la vis sans fin. Enfin, bien que chemoattractants sont principalement désignés comme les composés d'essai dans le protocole, chemorepellents peuvent également être utilisés. Ce protocole, tel quel ou modifié, est simple et efficace et peut servir comme un outil efficace pour quantifier le comportement chimiotactique de C. elegans, ou pour démontrer le comportement des élèves au niveau secondaire ou universitaire.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave
PicoFuge	Stratagene	400552
Microscopes	Leica
Dissecting	Leica
P1000 Pipette	Gilson
P10 Pipette	Gilson
0.5 M Sodium Azide
Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Ethanol/Distilled Water
Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)
Agar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0.25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531