Summary
定量の走化性応答の評価方法
Abstract
多くの生物は、食料源を模索有害物質を避け、仲間を見つけるために走化性を使用しています。 線虫（Caenorhabditis elegans）は、印象的な走化性行動を持っています。
着臭剤のワームの応答を試験後ろ前提領域に置き、臭剤に応答誘発動きを観察することである。でも、多くの利用可能なアッセイで、有意なサンプルサイズを維持しながら、互いにワームの相互作用を最小限に抑えながら、対照および試験領域の両方に対して開始位置ワームを最適化が進行中1-10の作業のままである。ここで説明する方法は、Bargmann らによって開発されたアッセイ1を変更することによってこれらの問題に対処することを目的とする。ペトリ皿を4つの象限に分割され、 "テスト"二マーク二つの対向する象限は "コントロール"を付している。麻酔薬は、すべてのテストおよび制御部位に配置される。ワームがcircl、プレートの中央に配置されているeは非運動ワームは無視されることを保証するために原点を中心となった。彼らは試験および対照試料から等距離にあるように、4つの象限システムを利用ではなく、1 2または2 1にかかわらず、それらが始まった起源の側の、ワームの動きにバイアスを排除します。これは、ワームを遅らせたり、彼らの意図されたパスの不正確な解釈をもたらし、多くの遠回りルートを取るように強制することができ匂い、に対応するために他のワームのクラスタを通過することを余儀なくされているワームの問題を回避します。また、このメソッドは、より大きなサンプルサイズを有する研究者が無人の検定を実行し、割り当てられた時間の有効期限が切れた後のワームを獲得できるようにすることで、実用的な利点を示しています。
Introduction
ウォードは、最初の1973年5で走化性アッセイを開発し、それ以来、それははるかに到達するアプリケーションを持っています。神経生物学は、走化性アッセイのさまざまな方法を使って恩恵を受けた一つのフィールドである。嗅覚適応、学習および記憶の単純な形式は、C.において実証されている走化性アッセイ6を使用してエレガンス 。それらはまた、C.を示すために使用されているエレガンスは、エタノールワームの行動の可塑性を示していないだけ寛容結果を開発することができますが、それはまた、ワームは人間3でアルコール依存症の研究に非常に有用であることを示しています。アッセイは偶数℃の能力を実証するために開発されているelegansのアソシエーションが化学誘引物質と食品（OP50）7間ワームによって作られていることを示すことによって、短期および長期記憶を保存する。さらに、C.に関する広範な情報は、現在入手可能な与えられたelegansのゲノム、chemotaxiC.のS振る舞いエレガンスは、変異1,8を誘導することによって何度も変更されています。これは、Cの開発など多くのエキサイティングなエンジニアリングの可能性を、可能にバイオレメディエーションツールとしてエレガンス 。したがって、1973年に走化性アッセイの初期の開発以来、それが頻繁に変更され、さまざまな分野の中で謎を解明するために使用されています。
特定のアッセイは、標的に向かってワームが撮影した特定のルートを発見することを目的とした。この種の典型的アッセイはウォード5によって開発されました。三ワームを15分間溶かした寒天上に置いた。彼らの動きは、それらが、プレートの中央に誘引へ勾配アッププレートの周囲から旅し、彼らが残した痕跡によってトレースされた。プレート上のすべてのワームは、各試験の終了時にクロロホルムを使用して逮捕された。この方法の一つの子孫誘引し、コントロールとプレートの中央に単一のワームを置い起源2からT等しく反対の距離。
ピアース·下村ら 。走9に関わる動きの正確な性質を観察するアッセイ法を開発しました。個々のワームが誘引のソースで最高潮に達する、誘引または放射状の形の勾配の均一濃度を含むいずれかの9センチメートルペトリ皿に入れた。ワームを認識し、コンピュータ·ソフトウェア·プログラムが観察された挙動を記録した。アッセイは、ワームを確実にするために実行したとして自動的にシャーレを調整する段階と一緒に働いていた顕微鏡に取り付けられたビデオカメラの視野内に残った。このことから、より詳細な情報は、Cで表示されたピルエットの原因について、発見されましたエレガンス 。
ここで説明したものに類似の他のアッセイは、試験化合物へのワームの大規模な人口の応答をテストした。 2象限走化性アッセイはあったC.様々な神経細胞、受容体、およびシグナル伝達分子がでるという役割を探索するために使用される線虫は、種々の化合物1に曝した。 20-50の間に洗浄したワームが麻酔、アジ化ナトリウム（NaN 3を）と一緒に極両端誘引とコントロールとのプレートの中央付近に配置した。 60分後、-1.0から+1.0までの値を有する走化性インデックスが誘引またはコントロールに貼付されたどのくらいのワームの差に基づいて生成した。以前のアッセイは厳密に非運動ワームを評価するために失敗したものの、同じような走化インデックスは、この記事で報告されたアッセイで使用されていました。このアッセイは、さらに走化性に神経切除の効果を試験に適用した。
100-200ワームは、4つの象限3を含むプレートの中央に配置した場合に前述のアッセイの別の変形を行った。隣接象限のいずれかのテストが含まれていたり、物質を制御します。前のアッセイと同様に、ワームがスコアリングされる前に、アジ化ナトリウムの作用により固定化した。同様の方法は、C.の応答を評価する方法として、ここで説明されている種々の化合物に虫 。しかし、以下の方法は、唯一不動ワームから携帯分離閾値距離に合格したワームを評価するという利点を持っています。
他のアッセイは、不動のワームを無視するための同様のガイドラインを取り入れています。 Frøkjær·ジェンセンら 。揮発性および水溶性化合物10の両方をテストするために使用できる汎用性の高いアッセイを開発した。ペトリ皿を、4つの象限に分割した。上部と下部の象限は、溶媒を含まなかった。水を含んでいた左象限、右は誘引が含まれていました。水溶性化合物がAGAに直接配置されたのに対し、揮発性の匂い物質をテストする場合、分析物は、適切な象限にわたって、シャーレの蓋の上に置いたR。
Cの走化性応答を評価するための現在の存在のメソッド線虫は常に使用効率と精度の容易さを最適化するために洗練されている。アッセイは、ここで説明しながら、だから、ワームの最大数（最大スループット：Lee らによって実証スループットよりわずかに大きいプレート当たり250ワーム/時間、3）を評価する機能があり、この方法の本当の強さはある以前アッセイ（ 表1）の属性の多くの簡潔集大成。
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Protocol
1。ワームの準備/洗濯
- 若い成人11にワームを同期させます。
- ただOP50 E.の芝生をクリアした段階的なワーム5センチメートル走プレート上にSの基底のピペット2ミリリットル大腸菌 。ワームがバッファにプレート表面から洗浄されていることを確認するために、必要に応じてプレートを傾けて。
- マイクロ遠心チューブにワーム-S基底解のピペット1ミリリットル。
- 10秒は6,600 rpmでPicoFugeを使用するために遠心分離します。
- 邪魔されずにワームのペレットを残して、Sの基礎を吸引。
- ワームを洗浄するために数回反転、マイクロ遠心チューブに1ミリリットルS基礎溶液を加える。
- 手順1.4から1.6、さらに3回繰り返します。
- CAの最終体積に上清を吸引10秒5回目、今回のために遠心。 100μlの。
- 各2μlのサンプルでは50〜250ワームが存在することを確認するためのNGMプレート上にワームのピペット2μlの。調整するSの基礎の小さいまたは大きい音量でワームを再懸濁することにより、必要に応じてSの基底におけるワームの濃度。
- 1までの時間ワームを洗浄した後すぐにアッセイでワームを使用してください。
2。テストプレートを準備
- 4等しい象限に皿を分ける5センチメートルプレートの下側をマーキング。走化性寒天又はNGMを使用することができる。 3試験の最小値は、テストされている遺伝的系統ごとに必要とされています。
- 原点を中心半径0.5センチメートル（ 図1）の円をマークします。
- サイトが起源と互いに等距離にあることを確認し、 "コントロール"のどちらか "テスト"のための "T"または "C"と各象限内のポイントをマークします。点が原点から少なくとも2cm離れてなければなりません。テスト象限と右上やコントロールなどの左下の象限（ 図1）のように左上と右下の象限をマーク。
3。アッセイを実行する
4。スコアの解釈/走指数の決定
- 式（1）を使用して走化性指数を計算します。これは、-1.0と+1.0の間で走指数が得られます。
（1）
走化性指数=（テスト象限の両方で＃ワーム - 両方のコントロール象限＃ワーム）/（得点ワームの＃合計）
+1.0スコアが目標に向かって最大限の魅力を示しており、化学的な目標を含む象限に到着ワームの100％を表します。 -1.0のインデックスは、最大反発力の証拠である。同様のアッセイ法は、既に3（ 表1）を用いてきた。
- 平均Chemotaxiを報告のインデックス（CI）及び平均値の標準誤差（SEM）。試験および対照プレートからのデータを比較するスチューデントのt検定を実行します。
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Representative Results
野生型（N2）C.を比較するODR-10（KY10）変異にエレガンス 。
私たちは、知られているCをジアセチル使用エレガンスは化学誘引物質、ジアセチル1,12の受容体を欠いた変異のそれに野生型ワームを比較する。 野生型（N2）ワームを走化指数は、エタノール、および0.839から0.100±0.066であった±0.031から0.5パーセントジアセチル。予想通り、ジアセチル、野生型ワーム（P <0.003）より有意な化学誘引性応答を誘発する。これとは対照的にジアセチル受容体を欠いODR-10（KY10）変異体はコントロール（ 図3）から、有意差は認められなかったジアセチルCIを持っていた。
| 筆者 | ＃ワーム/プレート | 再生時間（分） | 1時間のスループット（最大＃ワーム） | プロたち | コンズ |
| 病棟5 | 3 | 15 | 12 | •トラックの動き 明確な観察により不動ワーム•アカウント | 研究者の関与@短い時間間隔（15分）に依存 |
| Bargmann＆ホービッツ2 | 1 | 60 | 1 | •低いスループット 12-24時間、•誘引拡散 | |
| Bargmann、Hartwieg、ホービッツ1 | 20-50 | 60 | 50 | •最小限の研究者の関与（NaN 3を使用 ） •適度＃ワーム | •無控えめ不動採点方法 •動きを追跡しません |
| リー、ジヨン、マッキンタイア3 | 100-200 | 60 | 200 | •最小限の研究者の関与（NaN 3を使用 ） •高い＃寄生虫 | |
| ピアース·下村、モールス、Lockery 9 | 1 | 20（またはプレートのワームヒットエッジまで） | 3 | •トラックの動き 明確な観察により不動ワーム•アカウント ワームの動き•詳細な、永久的な記録 | 高度なコンピュータトラッキングシステムを必要とする |
| マージー、パーマー、チン·サンウ（この方法） | 50-250 | 60 | 250 | •最小限の研究者の関与（NaN 3を使用 ） •高い＃ワーム•不動ワームを占め | •動きを追跡しません |
表1は、アッセイ方法の比較説明した。
図1。 5センチメートルシャーレは、4象限は、[テスト（ "T"）またはControlキー（ "C"）の領域のいずれかとして指定され、それぞれに分かれています。内側の円は動きが得点されていない区域を線引き。これは、データをスキューから不動のワームを防ぐことができます。象限は、ワームの初期配置から発生する可能性のある偏りを防ぐためにテストおよびコントロールの交互のパターンを作成します。
図2。アッセイの概略図は、Lee ら （2009）から適応。プレートを象限つのテスト（＆B）と2つのコントロール（C＆D）に分かれています。アジ化ナトリウムはまた、ワームを麻痺させるためのテストおよびコントロールスポットに含まれています。ワームは、プレートの中心に配置され、60分後にワームが各クアドラにカウントされますNT。内側の円を越えていなかった個人が獲得していません。中性と誘引の概略例が示されている。走化性インデックス（CI）の計算を以下に示す。
図3。 野生型（wt）およびテスト誘引又はエタノール（コントロールプレート）のいずれかとしてジアセチル用いODR-10（KY10）ワームを用いて行ったアッセイから生成された走化性指標。値は、少なくとも3つの独立した実験（nは> 200ワーム）からの平均である各条件のため。エラーバーは、平均の標準誤差を反映している（SEM）* = P <0.003、スチューデントのT検定。
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Discussion
走化性は、神経細胞及び細胞機構の複雑なセットによって制御されているが、容易にかつ客観的に走化性アッセイを用いて定量することができる。アッセイから最良の結果を得るためには、特定の重要なステップを払わなければなりません。まず、ワームをステージングすると、一貫性のある実験結果をもたらすに不可欠である。異なるライフステージでのワームは13異なる振る舞い;ので混合ステージワームスキュー実験結果をすることがあります。第二に、すべてのE.を確保コリワーム洗い流す残留細菌がアッセイを妨害する可能性があるので、非常に重要です。麻酔薬、0.5-1 M-アジ化ナトリウムは、それが置かれた場所から1cmの半径内のワームを逮捕することに注意することも重要である。このことを考えれば、アジは少なくとも2cm原点から配置することが最も重要です。アジ、原点より1.5 cm以下を発見された場合、ワームは、内側の円内に麻痺され、いずれも得点されません。さらにアジドに、さらに配置され象限は、ワームが移動することができます。プレートはまた、試験間の一貫性を確保するために、結果が重力バイアスによって混乱されないようにレベルを維持する必要があります。また、これ以上250未満のワームは、実験で使用されるべきである。混雑は、多数の理由でワームの動きを妨げることがあります。私たちは、クラスタ化されたワームは象限への旅行に賛成して、一緒にとどまる傾向があることがわかった。最後に、60分後、4℃でアッセイプレートを配置することは、カウントされることができるまで、研究者は、プレートの状態を保存することができ、移動がワームを保つ。プレートを4℃で保存し、その結果に影響を与えることなく、数日後に得点ができる。
いくつかの手続きの変更はさらに、このプロトコルの有用性を高めることができる。であるように、このプロトコルは、別の試験での様々な表現型を試験する方法として働くことができる。理想的には、突然変異試験の結果を、同じ条件下で比較されるべきである。菌株を使用して、その急行fluorescこのようなGFPやRFPなどENTタンパク質はこれを達成するだろう。この変更は、同じアッセイプレートと一枚の板を得点の代わりにテスト対コントロールプレート得点の利益に種々の株を配置することにより、研究者の大きな実験的一貫性を与えるだろう。
走化性アッセイはまた、遺伝子操作された線虫の走化性挙動を特徴付けるために使用することができる。これは、試験される他の種から採取した受容体の結合親和性を可能にする。これらの受容体は、互換性のある方法で、ワームの化学誘引物質または化学反発ニューロンに発現している場合は、期待される走の結果は8を観察しなければならない。
このプロトコルはさらに、他のニーズに合うように適合され得る。現在、この方法では、捜査官は、ワームの動きを追跡することはできません。 5センチメートルプレートはこれらのアッセイのために許容されるので、実体顕微鏡に取り付けられたビデオカメラが効果的に動きを撮影することができ電動ステージとウォームトラッキングソフトウェアを使用せずにアッセイの1象限に向かってワーム。化学誘引物質は主にプロトコルの試験化合物と呼ばれているが、最終的に、chemorepellentsを用いてもよい。このプロトコルは、そのまま、または修正された、シンプルかつ効率的であり、Cの走化性行動を定量化するための有効なツールとして機能することができエレガンス 、あるいは高校や学部レベルで学生に動作を実証するため。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちはこの仕事に資金を提供するためのクイーンズ大学で生命科学と芸術と科学の学部に感謝。同様に、我々は必要な試薬、機器や技術サポートを提供するためにチン·サンウ研究室に感謝します。また、議論への貢献のために特にトニーQGEM 2011、彼に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave | |||
| PicoFuge | Stratagene | 400552 | |
| Microscopes | Leica | ||
| Dissecting | Leica | ||
| P1000 Pipette | Gilson | ||
| P10 Pipette | Gilson | ||
| 0.5 M Sodium Azide | |||
| Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4] | |||
| Ethanol/Distilled Water | |||
| Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl) | |||
| Agar | Bio-Rad | 166-0600 | |
| NH4Cl | Amresco | CA97062-046 | |
| MOPS | VWR | CA12001-120 | |
| NH4OH | BDH | CABDH8641-2 | |
| 0.25% Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 |
References
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-527 (1993).
- Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7, 729-742 (1991).
- Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. Ethanol preference in C. elegans. Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14, 803-812 (1995).
- Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
- Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans. Cell. 91, 161-169 (1997).
- Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).
- Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 3, e2467 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Sengupta, P., Bargmann, C. I. Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans. Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).
- Hart, A. C. Behavior. WormBook. , (1895).
