C. elegans Chemotaxis analysen

Summary

Fremgangsmåte for kvantitativt å evaluere den kjemotaktiske respons

Abstract

Mange organismer bruker kjemotaksis å oppsøke mat kilder, unngå skadelige stoffer, og finne kameratene. Caenorhabditis elegans har imponerende kjemotakse atferd.

Forutsetningen bak teste responsen av ormer for en odorant er å plassere dem på et sted og observere bevegelsen fremkalt i respons på en odorant. Selv med de mange tilgjengelige analyser, noe som optimaliserer orm startposisjon i forhold til både kontroll-og test-områder, mens minimere interaksjonen av ormer med hverandre, samtidig som en betydelig prøvestørrelse forblir i arbeid ^1-10. Metoden er beskrevet her tar sikte på å løse disse problemene ved å endre analysen utviklet av Bargmann et al. ^En. En petriskål er delt inn i fire kvadranter, er to motsatte kvadranter merket "Test" og to utpekte "Control". Bedøvelse er plassert i alle test og kontroll nettsteder. De ormer er plassert i sentrum av platen med en circle merket rundt origo for å sikre at ikke-motile ormer vil bli ignorert. Utnytte en fire-kvadrant system snarere enn en to eller to en eliminerer skjevhet i bevegelsen av ormer, som de er like langt fra test og kontroll prøvene, uavhengig av hvilken side av opprinnelsen de begynte. Dette omgår problemet med ormer som blir tvunget til å reise gjennom en klynge av andre ormer å svare på en odorant, noe som kan forsinke ormer eller tvinge dem til å ta en mer omvei, noe som gir en uriktig tolkning av sin opprinnelige kurs. Denne metoden viser også praktiske fordeler ved å ha en større utvalgsstørrelse og tillater forskeren å kjøre analysen uten tilsyn og scorer ormer når den avsatte tiden er utløpt.

Introduction

Ward først utviklet kjemotaksis analysen i 1973 ^fem, og siden da har det hatt vidtrekkende applikasjoner. Nevrobiologi er et felt som har dratt nytte av å bruke en rekke kjemotaksen analyser. Olfactory tilpasning, en enkel form for læring og hukommelse, har blitt vist i C. elegans med kjemotaksen analyser ^6. De har også blitt brukt til å vise at C. elegans kan utvikle toleranse etanol-et resultat som ikke bare viser de atferdsmessige plastisitet av ormer, men som også viser at ormene kan være meget nyttig i studiet av alkohol-avhengighet hos mennesker ^tre. Analyser har også blitt utviklet for å demonstrere evnen som C. elegans å lagre kort og lang sikt minne ved å vise at foreninger er laget av ormer mellom chemoattractants og mat (OP50) ^7. I tillegg gis det omfattende informasjon tilgjengelig om C. elegans genom, den chemotaxis oppførselen til C. elegans har blitt endret mange ganger ved å indusere mutasjoner ^1,8. Dette gjør det mulig for mange spennende tekniske muligheter, slik som utviklingen av C. elegans som bioremediation verktøy. Således, ettersom den innledende utvikling av kjemotaksis-analyse i 1973 har det vært hyppig forandres og brukes til å belyse hemmeligheter i ulike disipliner.

Enkelte analyser som mål å oppdage den spesifikke ruten tatt av ormer mot et mål. Det prototypiske analysen av denne type ble utviklet av Ward ^5.. Tre ormer ble plassert på smeltet agar i 15 min. Deres bevegelser ble spores ved avtrykk de igjen på veien fra periferien av platen opp en gradient til et tiltrekningsmiddel i sentrum av platen. Alle ormer på plate arrestert anvendelse av kloroform ved slutten av hvert forsøk. En etterkommer av denne fremgangsmåte plasseres en enkelt orm i midten av platen med lokkemidlet og kontrollen ent like og motsatt avstander fra opprinnelsen ^to.

Perforerings-Shimomura et al. utviklet en analyse for å observere den eksakte natur av bevegelsen som er involvert i chemotaxis ^9.. Individuelle ormer ble plassert i 9 cm petriskåler inneholdende enten en ensartet konsentrasjon av lokkemidlet eller en radial gradient formet som kulminerer i kilden lokkemidlet. Et dataprogram som anerkjent ormen ble brukt til å spille inn den observerte atferden. Et videokamera tilknyttet et mikroskop arbeidet i forbindelse med trinn for å justere petriskål automatisk som analysen løp for å sikre ormen forble i synsfeltet. Fra dette, ble mer detaljert informasjon oppdaget om årsaken til piruetter vises av C. elegans.

Andre analyser, mer lik den som er beskrevet her, testet responsen på en stor bestand av ormer å teste forbindelser. To-kvadrant kjemotaksen analysene erbrukes til å utforske de rollene som ulike nerveceller, reseptorer, og signalformidling molekyler spilt da C. elegans ble utsatt for forskjellige forbindelser ^en. 20-50 vaskede ormer ble plassert nær midten av platen med et tiltrekningsmiddel og en kontroll på polare ender sammen med bedøvelse, natriumazid (NaN _3). Etter 60 min, ble en kjemotaktisk indeks med verdier fra -1,0 til +1,0 genereres basert på forskjellen mellom hvor mange ormer ble festet til lokkemidlet eller kontrollen. En lignende kjemotaktisk indeksen ble benyttet i analysen rapportert i denne artikkelen, selv om den tidligere analysen sviktet strengt å evaluere ikke-motile ormer. Denne analysen ble deretter ytterligere anvendt for å teste effekten av neuronal ablasjon på kjemotaksis.

En annen variant av den forannevnte prøven ble utført der 100-200 ormer ble plassert i midten av en plate som inneholder fire kvadranter ^3. Tilstøtende kvadranter enten inneholdt test-ellerkontrollere substansen. Som i tidligere assays, ble ormene immobilisert ved virkningen av natriumazid før de ble avsluttet. En lignende metode er beskrevet her som en måte å evaluere responsen av C. elegans til ulike forbindelser. Imidlertid har metoden under den ekstra fordelen av bare vurdere ormer som har passert en terskel avstanden skille mobil fra immobile ormer.

Andre analyser har innarbeidet lignende retningslinjer for ignorerer immobile ormer. Frøkjær-Jensen et al. utviklet en allsidig analyse som kan brukes til å teste både flyktige og vannløselige forbindelser ^ti. En petriskål ble delt i fire kvadranter. Den øverste og nederste kvadranter ikke inneholde løsemidler. Den venstre kvadrant inneholdt vann, og den høyre inneholdt lokkemidlet. Når du skal teste flyktige odorants ble analytten plassert på lokket av fatet, over riktig kvadrant, mens vannløselige forbindelser ble plassert direkte på agar.

Metodene som finnes i dag for å vurdere kjemotaktisk respons C. elegans blir stadig raffinert å optimalisere deres brukervennlighet, effektivitet og nøyaktighet. Så, mens analysen beskrevet her har evnen til å vurdere det største antall ormer (maksimal gjennomstrømming:. 250 ormer / time per plate, litt større enn gjennomstrømningen demonstrert av Lee et al ^3), den virkelige styrken til denne metoden er fyndig kulminasjonen av mange av attributtene av tidligere analyser (tabell 1).

Protocol

En. Forberede / vaske Worms

1. Synkronisere ormer til ung voksen ^11.
2. Pipette 2 ml av S Basal på en 5 cm Chemotaxis plate av iscenesatte ormer som nettopp har ryddet plenen av OP50 E. coli. Vippe plate som nødvendig for å sikre ormene er vasket fra platen overflaten inn i bufferet.
3. Pipetter en ml av orm-S Basal løsning inn i et mikrosentrifugerør.
4. Sentrifuger i 10 sekunder ved hjelp av en PicoFuge ved 6600 rpm.
5. Aspirer S Basal, forlater pellet av ormer uforstyrret.
6. Tilsett 1 ml S Basal løsning på mikrosentrifugerør, snu noen ganger for å vaske ormer.
7. Gjenta trinn 01.04 til 01.06 ytterligere tre ganger.
8. Sentrifuger i 10 sekunder en femte gang, denne gang aspirering av supernatanten til et sluttvolum på ca. 100 pl.
9. Pipetter 2 ul av ormer på en NGM plate for å sikre at det er mellom 50 og 250 ormer i hver 2 mL prøve. Justerkonsentrasjonen av ormer i S Basal etter behov ved å oppslemme de ormer i et større eller mindre volum av S Basal.
10. Bruk ormer i analysen umiddelbart etter vasking ormene i opp til 1 time.

2. Forberede Test Plates

1. Merking undersiden av en 5 cm plate, dele fatet i 4 like kvadranter. Chemotaxis agar eller NGM kan brukes. Et minimum av tre studier er nødvendig per genetiske belastningen blir testet.
2. Marker en sirkel med radius 0,5 cm rundt opprinnelsen (figur 1).
3. Marker et punkt i hver kvadrant med enten en "T" for "Test" eller en "C" for "Control", som sikrer at nettstedene er like langt fra opprinnelsen og hverandre. Punktene må være minst 2 cm vekk fra origo. Marker øverst til venstre og nederst til høyre kvadranter som test kvadranter og det øverste høyre og nederste venstre kvadrant som kontroller (figur 1).

3. Kjøre analysen

Bland testoppløsning ved å kombinere like volum av testforbindelsen og 0,5 M azid (et bedøvelsesmiddel som brukes til å arrestere ormene ved oppnåelse av en kvadrant). Bland kontrolløsningen ved å kombinere det løsningsmiddel som anvendes for å fortynne testforbindelsen med 0,5 M azid.

Pipetter 2 pl av orm-oppløsning (fremstilt i 1.8) fra bunnfallet til origo (hvor de to linjer skjærer hverandre).

Umiddelbart etter, pipette 2 ul av prøveoppløsningen på de to "T"-områder. Likeledes, pipetteres den samme mengde av kontroll-løsning på de to "C"-områder.

Når ormen og odorant dråper har blitt absorbert i agar, erstatte lokkene og snu platene.

Etter 60 min, legg ormer i en 4 ° C inkubator. Bare fjerne en plate fra inkubatoren når det kan telles. Forlater ormer ved romtemperatur, kan tillate dem å mobilisere igjen.

Registrere antall ormer i hver kvadrant som fullstendig krysset indre circle.

Gjenta trinn 3.2 til 3.6 ved hjelp av kontroll-løsning i både test-og kontroll-kvadranter. Dette vil tjene som kontroll plate. Tre slike plater skal gjøres og drives for å tjene som en passende kontroll.

4. Tolke Poeng / Bestemme Chemotaxis Index

1. Beregn kjemotaksis indeksen ved å bruke ligning 1. Dette vil gi en kjemotaktisk indeks mellom -1,0 og +1,0.

(1)

Kjemotaksis Index = (# Worms i både test kvadranter - # Worms i både kontroll kvadranter) / (Total # of scoret Worms)

En 1,0 poeng indikerer maksimal tiltrekning mot målet og representerer 100% av ormer som ankommer i kvadranter som inneholder det kjemiske målet. En indeks på -1,0 er bevis for maksimal frastøting. Lignende analysefremgangsmåter er allerede anvendt ³ (tabell 1).

2. Rapportere gjennomsnittlig Chemotaxis Index (CI) og standard feil av mean (SEM). Utfør en Student T-test for sammenligning av data fra test og kontroll plater.

Representative Results

Sammenligning av villtype (N2) C. elegans til ODR-10 (KY10) mutant.

Vi brukte diacetyl, en kjent C. elegans chemoattractant, å sammenligne villtype ormer som for en mutant som mangler reseptoren for diacetyl ^1,12. For hvete (N2) ormer den kjemotaktiske indeksen var 0.100 ± 0.066 til etanol, og 0,839 ± 0,031 til 0,5% diacetyl. Som forventet, utløser diacetyl en betydelig chemoattractive respons fra vill type ormer (P <0.003). I motsetning ODR-10 (KY10) mutanter som mangler diacetyl reseptorer hadde en diacetyl CI som ikke var signifikant forskjellig fra kontrollene (figur 3).

Forfatter	# Ormer / plate	Varighet (min)	1 time gjennomløp (Max # ormer)	Pros	Cons
Ward 5	3	15	12	• sporbevegelse • står for immobile ormer av klare observasjon	avhengig av forskeren involvering @ korte tidsintervaller (15 min)
Bargmann & Horvitz 2	1	60	1		• lav gjennomstrømming • tiltrekkende diffunderer for 12-24 hr
Bargmann, Hartwieg, en Horvitz	20-50	60	50	• minimal forsker engasjement (NaN 3 brukes) • Moderat # ormer	• ingen diskret immobile scoring metode • sporer ikke bevegelse
Lee, Jee, 3 McIntire	100-200	60	200	• minimal forsker engasjement (NaN 3 brukes) • høyt #orm
Pierce-Shimomura, Morse, Lockery 9	1	20 (eller inntil orm treff kant av platen)	3	• sporbevegelse • står for immobile ormer av klare observasjon • detaljert, permanent registrering av ormen bevegelse	krever avansert computer tracking system
Margie, Palmer, Chin-Sang (denne metoden)	50-250	60	250	• minimal forsker engasjement (NaN 3 brukes) • høye # ormer • står for immobile ormer	• sporer ikke bevegelse

Tabell 1. Sammenligning av analysemetoder beskrevet.

Figur 1. Den 5 cm petriskål er inndelt i fire kvadranter, hver betegnet enten som Test ("T") eller kontroll ("C") område. Den indre sirkelen markerer et område der bevegelse ikke er scoret. Dette hindrer immobile ormer fra forvrenger data. Kvadrantene skape et vekslende mønster av test-og kontrollcellene til å forhindre eventuelle skjevheter som kan oppstå fra den første plassering av ormer.

Figur 2. En skjematisk av analysen tilpasset fra Lee et al. (2009). Plater er delt opp i fire kvadranter to test (A & B) og to kontroller (C og D). Natriumazid er også inkludert med test og kontroll spots å lamme ormer. Worms, plasseres på midten av platen og etter 60 minutter ormer telles på hver Quadrant. Individer som ikke krysser den indre sirkelen ikke scoret. Skjematisk eksempler på nøytral og tiltrekkende er indikert. Kjemotaktisk indeks (CI) Beregningen er vist nedenfor.

Figur 3. Kjemotaktisk indekser generert fra analyser som ble utført med vill-type (wt) og ODR-10 (KY10) ormer ved hjelp av enten diacetyl som en test tiltrekningsmiddel eller etanol (kontroll-plater). Verdier er gjennomsnitt av minst tre uavhengige eksperimenter (n> 200 ormer) for hver tilstand. Feilfelt gjenspeiler standarden for gjennomsnittet (SEM) * = P <0.003 Student T-test.

Discussion

Chemotaxis, selv styres av et komplekst sett av neuronal og cellulære mekanismer, kan enkelt og objektivt kvantifiseres ved hjelp av kjemotaksen assays. For å oppnå de beste resultatene fra analysene, må visse viktige skritt tas. For det første, iscenesettelse ormer er viktig i gir konsistente eksperimentelle resultater. Worms på ulike livsstadier oppføre seg annerledes ^13; så blandede scenen ormer kan skjeve eksperimentelle resultater. Dernest, som sikrer alle E. coli er vasket av ormer er avgjørende, så gjenværende bakterier kan påvirke analysen. Det er også viktig å merke seg at bedøvelse, 0,5-1 M-natriumazid, vil arrestere ormer innenfor en radius på 1 cm hvor det var plassert. Gitt dette, er det viktig at azidet plasseres på minst 2 cm fra origo. Hvis azidet er flekket 1,5 cm eller mindre fra opprinnelsen ormer vil bli lammet i den indre sirkel, og ingen vil bli scoret. Den ytterligere azidet er plassert, jo lenger inn ikvadranter ormer kan flytte. Plater bør også holdes nivå for å sikre konsistens på tvers av studier og for å sikre resultatene er ikke tilbakevist av gravitasjonsfelt skjevheter. I tillegg bør ikke mer enn 250 ormer bli brukt i forsøket. Trenging kan hindre ormen bevegelse for en rekke årsaker. Vi fant ut at gruppert ormer tendens til å forbli sammen, til fordel for å reise til en kvadrant. Til slutt, å plassere analyseresultatene platene ved 4 ° C etter at 60 min holder ormene fra å bevege seg, slik at forskeren å bevare tilstanden av platen før den er i stand til å bli talt. Platene kan lagres ved 4 ° C og scoret flere dager senere uten å påvirke resultatene.

Noen prosessuelle endringer kan forbedre nytten av denne protokollen. Som er, kan denne protokoll tjene som en fremgangsmåte for å teste en rekke fenotyper i separate forsøk. Ideelt, bør resultatene av den muterte forsøk sammenlignes under de samme betingelser. Ved hjelp av stammer som uttrykker fluorescerendeent proteiner som GFP eller RFP ville oppnå dette. Denne endringen vil gi forskeren større eksperimentell konsistens ved å plassere de ulike stammene på den samme analysen plate og fordelen av å score en plate i stedet for scoring test versus kontroll plater.

Kjemotaksis assays kan også bli brukt for å karakterisere den kjemotaktiske virkemåten av genetisk modifiserte rundorm. Dette gjør at bindingsaffiniteten av reseptorer som tas fra andre arter som skal testes. Hvis disse reseptorene er uttrykt i chemoattractant eller chemorepulsive nevroner av ormen i en kompatibel måte, bør forventes kjemotaktiske resultater observeres ^åtte.

Denne protokollen kan videre tilpasses andre behov i tillegg. Foreløpig ikke denne metoden ikke tillater etterforsker for å spore bevegelsen av ormer. Fordi 5 cm plater er akseptable for disse analysene, kan et videokamera festet til et stereomikroskop effektivt filme bevegelseav ormer mot en kvadrant av analysen uten bruk av en motorisert scene og orm for sporing. Til slutt, selv chemoattractants er hovedsakelig referert til som testforbindelsene i protokollen, kan chemorepellents også anvendes. Denne protokollen, som er eller endring, er enkel og effektiv, og kan tjene som et effektivt verktøy for å kvantifisere den kjemotaktiske oppførselen til C. elegans, eller for å demonstrere oppførselen til elevene på videregående skole eller lavere nivå.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave
PicoFuge	Stratagene	400552
Microscopes	Leica
Dissecting	Leica
P1000 Pipette	Gilson
P10 Pipette	Gilson
0.5 M Sodium Azide
Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Ethanol/Distilled Water
Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)
Agar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0.25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531