C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Summary

Un método para evaluar cuantitativamente la respuesta quimiotáctica de los

Abstract

Muchos organismos utilizan la quimiotaxis a buscar las fuentes de alimentos, evitar sustancias nocivas, y encontrar pareja. Caenorhabditis elegans tiene impresionante comportamiento quimiotaxis.

La premisa detrás de probar la respuesta de los gusanos a un odorante es colocarlos en un área y observar el movimiento evocada en respuesta a un odorante. A pesar de los muchos ensayos disponibles, optimizando gusano de partida ubicación con respecto a tanto las zonas de ensayo y de control, y reducir al mínimo la interacción de los gusanos uno con el otro, mientras se mantiene un tamaño de la muestra significativa sigue siendo un trabajo en progreso ^1-10. El método descrito aquí tiene como objetivo hacer frente a estos problemas mediante la modificación del ensayo desarrollado por Bargmann et al. ^1. Una placa de Petri se divide en cuatro cuadrantes, dos cuadrantes opuestos marcados "Prueba" y dos se designan como "control". Anestésico se coloca en todos los sitios de control de prueba y. Los gusanos se colocan en el centro de la placa con un circle marcado alrededor del origen para asegurarse de que se ignoran los gusanos no móviles. La utilización de un sistema de cuatro cuadrantes en lugar de uno o dos 2 1 elimina el sesgo en el movimiento de los gusanos, ya que son equidistantes a partir de muestras de prueba y de control, independientemente de qué lado del origen que comenzaron. Esto evita el problema de los gusanos que se ven obligados a viajar a través de un conjunto de otros gusanos de responder a un olor, lo que puede retrasar gusanos u obligar a tomar una ruta más tortuosa, dando una interpretación incorrecta de su ruta prevista. Este método también presenta ventajas prácticas por tener un tamaño de muestra más grande y permite al investigador para ejecutar el ensayo sin supervisión y marcó los gusanos una vez que el tiempo asignado ha expirado.

Introduction

Ward, desarrollado por primera vez el ensayo de quimiotaxis en 1973 ^5, y desde entonces ha tenido aplicaciones de gran alcance. Neurobiología es un campo que se ha beneficiado del uso de una variedad de ensayos de quimiotaxis. Adaptación olfativa, una forma simple de aprendizaje y la memoria, se ha demostrado en C. elegans utilizando ensayos de quimiotaxis ^6. Ellos también se han utilizado para mostrar que C. elegans pueden desarrollar tolerancia a etanol-un resultado que no sólo demuestra la plasticidad de comportamiento de los gusanos, pero que también muestra que los gusanos pueden ser muy útiles en el estudio de la dependencia del alcohol en los seres humanos ^3. Los ensayos incluso han sido desarrollados para demostrar la capacidad de C. elegans para almacenar la memoria a corto y largo plazo, mostrando que las asociaciones son hechos por los gusanos entre quimioatrayentes y alimentos (OP50) ^7. Además, dada la amplia información disponible en la actualidad con respecto a la C. elegans genoma, la chemotaxis comportamiento de C. elegans ha sido modificado varias veces mediante la inducción de mutaciones ^1,8. Esto permite muchas posibilidades excitantes de ingeniería, tales como el desarrollo de C. elegans como una herramienta de biorremediación. Así, desde el desarrollo inicial del ensayo de quimiotaxis en 1973, ha sido frecuentemente alterado y utilizado para dilucidar misterios en una variedad de disciplinas.

Algunos ensayos dirigidos a descubrir la ruta específica adoptada por los gusanos hacia un objetivo. El ensayo de prototipo de este tipo fue desarrollado por Ward ^5. Tres gusanos fueron colocados en agar fundido durante 15 min. Sus movimientos fueron rastreadas por la huella que dejan al viajar de la periferia de la placa hasta un gradiente de un atrayente en el centro de la placa. Todos los gusanos en la placa fueron detenidos usando cloroformo al final de cada ensayo. Una descendiente de este método coloca un solo tornillo sin fin en el centro de la placa con el atrayente y el control de unt distancias iguales y opuestas desde el origen ^2.

Pierce-Shimomura et al. desarrollado un ensayo para observar la naturaleza exacta del movimiento involucrados en la quimiotaxis ^9. Gusanos individuales se colocaron en placas de Petri de 9 cm que contienen ya sea una concentración uniforme del atrayente o un gradiente de forma radial, que culmina en la fuente del atrayente. Un programa de software que reconoce el gusano se utiliza para registrar el comportamiento observado. Una cámara de vídeo conectada a un microscopio trabajó conjuntamente con la etapa de ajustar la placa de Petri automáticamente como el ensayo corrió para asegurar el gusano se mantuvo en el campo de visión. A partir de esto, la información más detallada fue descubierto con respecto a la causa de piruetas mostrados por C. elegans.

Otros ensayos, más similares a la descrita aquí, a prueba la respuesta de una gran población de gusanos a los compuestos de ensayo. Ensayos de dos cuadrantes quimiotaxis han sidoutilizados para explorar los roles que varios receptores, neuronas, y las moléculas de transducción de señales reproducen cuando C. elegans fue expuesto a varios compuestos ^1. Entre 20-50 gusanos lavados se colocan cerca del centro de la placa con un atrayente y un control en los extremos polares junto con el anestésico, azida de sodio _(NaN3). Después de 60 min, se generó un índice de quimiotaxis con valores de -1,0 a 1,0 en base a la diferencia entre el número de gusanos se colocará en el atrayente o el control. Un índice quimiotáctico similar se utilizó en el ensayo descrito en este artículo, aunque el ensayo anterior no evaluó estrictamente gusanos no móviles. A continuación, este ensayo se aplica aún más al ensayo de los efectos de la ablación neuronal sobre la quimiotaxis.

Otra variación del ensayo mencionado anteriormente se lleva a cabo donde 100-200 gusanos fueron colocados en el centro de una placa que contiene cuatro cuadrantes ^3. Cuadrantes adyacentes o bien contenían la prueba olas sustancias controladas. Al igual que en los ensayos anteriores, los gusanos fueron inmovilizados por la acción de azida de sodio antes de ser marcado. Un método similar se describe aquí como una forma de evaluar la respuesta de C. elegans a diversos compuestos. Sin embargo, el siguiente método tiene la ventaja añadida de sólo evaluar los gusanos que han pasado un umbral de distancia que separa móvil de gusanos inmóviles.

Otros ensayos han incorporado directrices similares para ignorar gusanos inmóviles. Frøkjær-Jensen et al. desarrollaron un ensayo versátil que puede ser utilizado para probar compuestos solubles tanto volátiles y el agua ^10. Una placa de Petri se dividió en cuatro cuadrantes. Los cuadrantes superior e inferior no contienen disolventes. El cuadrante izquierdo contenía agua y el derecho mencionado el atrayente. Al probar sustancias olorosas volátiles, el analito se coloca en la tapa de la placa, sobre el cuadrante correcto, mientras que los compuestos solubles en agua se colocaron directamente sobre la AGAr.

Los métodos existentes en la actualidad para evaluar la respuesta quimiotáctica de C. elegans están siendo constantemente refinado para optimizar su facilidad de uso, la eficiencia y exactitud. Así, mientras que el ensayo descrito aquí tiene la capacidad de evaluar el mayor número de gusanos (máximo rendimiento:. 250 gusanos / hora por placa, ligeramente mayor que el rendimiento demostrado por Lee et al ^3); la fuerza real de este método es el sucinta culminación de muchos de los atributos de los ensayos anteriores (Tabla 1).

Protocol

1. Preparación / lavado de los gusanos

1. Sincronizar los gusanos adultos jóvenes ^11.
2. Pipetear 2 ml de la basal S sobre una placa de 5 cm quimiotaxis de escena gusanos que han borrado sólo el césped del OP50 E. coli. Incline la placa según sea necesario para asegurar que los gusanos se lavan de la superficie de la placa en el búfer.
3. Pipetear 1 ml de la solución basal gusano-S en un tubo de microcentrífuga.
4. Centrifugar durante 10 segundos utilizando un PicoFuge a 6.600 rpm.
5. Aspirar el Basal S, dejando el sedimento de gusanos inalteradas.
6. Añadir 1 ml de solución S Basal al tubo de microcentrífuga, invertir varias veces para lavar los gusanos.
7. Repetir los pasos 1.4 a 1.6 otras tres veces.
8. Centrifugar durante 10 seg quinta vez, esta vez de aspirar el sobrenadante a un volumen final de ca. 100 l.
9. Pipetear 2 l de los gusanos en una placa de NGM para garantizar que no entre 50 y 250 gusanos en cada uno de 2 l de muestra. Ajustarla concentración de gusanos en la basal S según sea necesario por la resuspensión de los gusanos en un volumen más pequeño o más grande de S basal.
10. Usa los gusanos en el ensayo inmediatamente después de lavar los gusanos durante un máximo de 1 hora.

2. Preparación de las placas de prueba

1. Con motivo de la parte inferior de una placa de 5 cm, dividir el plato en 4 cuadrantes iguales. La quimiotaxis de agar NGM o pueden ser utilizados. Un mínimo de 3 ensayos son necesarios por cepa genética se está probando.
2. Marque un círculo de radio de 0,5 cm alrededor del origen (Figura 1).
3. Marque un punto en cada cuadrante, ya sea con una "T" de "Test" o "C" para el "control", asegurar que los sitios son equidistantes del origen y la otra. Los puntos deben ser de al menos 2 cm de distancia desde el origen. Marque los cuadrantes superiores izquierda e inferior derecha como cuadrantes de prueba y de la parte superior derecha y los cuadrantes inferior izquierda como controles (Figura 1).

3. Ejecución del ensayo

Mezclar la solución de ensayo mediante la combinación de volúmenes iguales del compuesto de ensayo y 0,5 M de azida (un anestésico utilizado para detener a los gusanos al llegar a un cuadrante). Mezclar la solución de control mediante la combinación del disolvente utilizado para diluir el compuesto de ensayo con 0,5 M de azida.

Pipetear 2 l de la solución de tornillo sin fin (preparado en 1.8) a partir del sedimento en el origen (donde las dos líneas se cruzan).

Inmediatamente después, pipeta de 2 l de la solución de prueba en los dos sitios de "T". Del mismo modo, pipetear la misma cantidad de la solución de control en los dos sitios de "C".

Una vez que las gotas de gusanos y olor han sido absorbidos en el agar, reemplace las tapas e invertir las placas.

Después de 60 minutos, colocar los gusanos en un 4 ° C incubadora. Sólo quitar una placa de la incubadora cuando se puede contar. Dejando gusanos a temperatura ambiente puede permitir a movilizar de nuevo.

Anote el número de gusanos en cada cuadrante que cruzó por completo la circ interiorle.

Repita los pasos 3.2 a 3.6 con la solución de control, tanto en la prueba y cuadrantes de control. Esto servirá como la placa de control. Tres de tales placas se deben hacer y ejecutar para servir como un control apropiado.

4. Interpretación de los Resultados / Determinación del índice de quimiotaxis

1. Calcular el índice de quimiotaxis utilizando la ecuación 1. Esto dará lugar a un índice de quimiotaxis entre -1,0 y 1,0.

(1)

La quimiotaxis Index = (# Los gusanos de las casillas de prueba - # gusanos de las casillas de control) / (# total de Worms arco)

Una puntuación de 1,0 indica atracción máxima hacia el objetivo y representa el 100% de los gusanos que llegan en los cuadrantes que contienen el objetivo química. Un índice de -1,0 evidencia de repulsión máxima. Métodos de ensayo similares ya se han empleado ³ (Tabla 1).

2. Reporte el Chemotaxi medias Índice (IC) y el error estándar de la media (SEM). Realizar la prueba T de Student comparando los datos de las placas de prueba y de control.

Representative Results

Comparación de tipo salvaje (N2) C. elegans para el ODR-10 (KY10) mutante.

Se utilizó diacetilo, un conocido C. elegans quimioatrayente, para comparar los gusanos de tipo salvaje a la de un mutante que carece del receptor para diacetil ^1,12. Para los gusanos de tipo salvaje (N2), el índice de quimiotaxis fue 0,100 ± 0,066 a etanol y 0,839 ± 0,031 hasta 0,5% diacetil. Como era de esperar, diacetilo provoca una respuesta quimioatrayentes significativa de los gusanos de tipo salvaje (P <0,003). En contraste los ODR-10 (KY10) mutantes que carece de los receptores diacetil tenían una IC diacetil que no fue significativamente diferente de los controles (Figura 3).

Autor	# Gusanos / placa	Duración (min)	1 hr rendimiento (máximo gusanos)	Pros	Contras
Distrito 5	3	15	12	• Movimiento de pista • Cuenta de gusanos inmóviles por la observación clara	depende de la participación de investigadores con intervalos cortos de tiempo (15 min)
Bargmann y Horvitz 2	1	60	1		• bajo rendimiento • difunde atrayentes de 12 a 24 horas
Bargmann, Hartwieg, Horvitz 1	20-50	60	50	• participación mínima investigador (NaN 3 se utiliza) • # gusanos moderadas	• no existe un método de puntuación inmóvil discreta • no seguir el movimiento
Lee Jee, McIntire 3	100-200	60	200	• participación mínima investigador (NaN 3 se utiliza) • alta #lombrices
Pierce-Shimomura, Morse, Lockery 9	1	20 (o hasta golpes gusano borde de la placa)	3	• Movimiento de pista • Cuenta de gusanos inmóviles por la observación clara • registro detallado y permanente del movimiento del gusano	requiere el sistema avanzado de seguimiento de equipo
Margie, Palmer, Chin-Sang (este método)	50-250	60	250	• participación mínima investigador (NaN 3 se utiliza) • altos # gusanos • Cuentas de gusanos inmóviles	• no seguir el movimiento

Tabla 1. Comparación de los métodos de ensayo descritos.

Figura 1. La placa de Petri de 5 cm se divide en cuatro cuadrantes, cada uno designado ya sea como prueba ("T") o de control ("C") área. El círculo interior delimita un área donde el movimiento no se ha marcado. Esto previene gusanos inmóviles de sesgar los datos. Los cuadrantes de crear un modelo de alternancia de ensayo y de control para evitar cualquier sesgo que puede ocurrir a partir de la colocación inicial de los gusanos.

Figura 2. Un esquemática del ensayo adaptado de Lee et al. (2009). Las placas se dividen en dos cuadrantes de ensayo (A y B) y dos controles (C + D). Azida de sodio también se incluye en los puntos de prueba y de control para paralizar los gusanos. Los gusanos se colocan en el centro de la placa y después de 60 minutos gusanos se cuentan en cada Quadrant. Las personas que no cruzan el círculo interior no se puntúan. Se indican ejemplos esquemáticos de neutro y atrayente. El índice de cálculo quimiotáctica (CI) se muestra a continuación.

Figura 3. Índices quimiotácticos generados a partir de ensayos realizados con los gusanos de tipo salvaje (wt) y ODR-10 (KY10) utilizando ya sea diacetil como un atrayente de prueba o etanol (placas de control). Los valores son promedios de al menos 3 experimentos independientes (n> 200 gusanos) para cada condición. Las barras de error reflejan el error estándar de la media (SEM) * = P <0,003 prueba T de Student.

Discussion

La quimiotaxis, aunque controlada por un complejo conjunto de mecanismos neuronales y celulares, puede ser fácil y objetivamente cuantificado utilizando ensayos de quimiotaxis. Para obtener los mejores resultados de los ensayos, se deben tomar ciertos pasos críticos. En primer lugar, la celebración de los gusanos es esencial en la obtención de resultados experimentales consistentes. Gusanos en diferentes etapas de la vida se comportan de manera diferente ^13; gusanos etapa tan mixtas pueden sesgar los resultados experimentales. En segundo lugar, asegurar que todos los E. coli se lava fuera de los gusanos es crucial, ya que las bacterias residuales pueden interferir con el ensayo. También es importante tener en cuenta que el anestésico, 0,5-1 M-azida de sodio, se detener gusanos dentro de un cm de radio de donde se colocó 1. Teniendo en cuenta esto, es muy importante que la azida puede colocar al menos 2 cm desde el origen. Si la azida se detecta 1,5 cm o menos desde el origen de los gusanos se paralizan en el círculo interior y no se puntuarán. El aún más la azida se coloca, el más en elcuadrantes, los gusanos pueden moverse. Las placas también deben ser mantenidos nivel para garantizar la coherencia entre los ensayos y para garantizar resultados no son confundidos por los sesgos gravitacionales. Además, no más de 250 gusanos deben ser utilizados en el experimento. El hacinamiento puede impedir el movimiento de tornillo sin fin por un número de razones. Hemos encontrado que los gusanos agrupados tienden a permanecer juntos, a favor de viajar a un cuadrante. Por último, la colocación de las placas de ensayo a 4 º C después de 60 min la mantiene a los gusanos se mueva, permitiendo que el investigador para preservar el estado de la placa hasta que es capaz de ser contados. Las placas se almacenan a 4 ° C y se obtuvo varios días más tarde sin afectar los resultados.

Algunas modificaciones de procedimiento pueden mejorar aún más la utilidad de este protocolo. Como es, este protocolo puede servir como un método de probar una variedad de fenotipos en ensayos separados. Idealmente, los resultados de los ensayos mutantes deben compararse en las mismas condiciones. Uso de las cepas que expresan fluorescrentes proteínas tales como GFP o RFP lograría esto. Esta modificación daría el investigador mayor consistencia experimental mediante la colocación de las diferentes cepas en la misma placa de ensayo y el beneficio de anotar una placa en lugar de anotar placas de ensayo frente al control.

Ensayos de quimiotaxis también pueden utilizarse para caracterizar el comportamiento quimiotáctico de los gusanos nematodos de ingeniería genética. Esto permite que la afinidad de unión de los receptores tomadas de otras especies para ser probado. Si estos receptores se expresan en las neuronas quimioatrayentes o chemorepulsive del gusano en una manera compatible, resultados esperados quimiotácticos deben ser observados ^8.

Este protocolo puede ser adaptado para satisfacer otras necesidades también. Actualmente, este método no permite que el investigador para rastrear el movimiento de los gusanos. Debido a que las placas 5 cm son aceptables para estos ensayos, una cámara de vídeo conectada a un microscopio estereoscópico puede filmar con eficacia el movimientode los gusanos hacia un cuadrante del ensayo sin el uso de una platina motorizada y software de seguimiento de gusano. Por último, aunque quimioatrayentes se denominan principalmente a como los compuestos de ensayo en el protocolo, también se pueden utilizar chemorepellents. Este protocolo, al igual que o modifica, es simple y eficiente y puede servir como una herramienta eficaz para cuantificar el comportamiento quimiotáctico de C. elegans, o para demostrar el comportamiento de los estudiantes en la escuela secundaria o el nivel de pregrado.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave
PicoFuge	Stratagene	400552
Microscopes	Leica
Dissecting	Leica
P1000 Pipette	Gilson
P10 Pipette	Gilson
0.5 M Sodium Azide
Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Ethanol/Distilled Water
Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)
Agar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0.25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531