C. elegans Kemotaksis Deneyi

Summary

Niceliksel kemotaktik tepkiyi değerlendirmek için bir yöntem

Abstract

Birçok organizma kemotaksis, gıda kaynakları bulmak zararlı maddeler önlemek ve arkadaşları bulmak için kullanın. Caenorhabditis elegans etkileyici kemotaksis davranış vardır.

Bir odorant için solucanlar yanıtı test arkasında öncül bir alanda koyun ve bir odorant yanıt olarak uyarılmış hareketi gözlemlemektir. Hatta mevcut olan birçok deneyleri ile, önemli örnek boyutu korunarak birbirleriyle solucanlar etkileşimi en aza indirirken, kontrol ve test alanları hem de göreli konumu başlangıç ​​solucan optimize ilerleme ^1-10 bir çalışma devam etmektedir. Burada anlatılan yöntemi Bargmann ve ark. ^1. tarafından geliştirilen test değiştirerek bu konuları ele amaçlamaktadır. Bir Petri kabı dört parçaya bölünür, "Test" ve iki işaretli iki zıt kadran "Kontrol" belirlenir. Anestezik tüm test ve kontrol sitelerinin yerleştirilir. Solucanlar bir Circl ile plaka ortasına yerleştirilire non-motil solucanlar yok sayılır sağlamak için kökenli etrafında oldu. Dört kadran sistemi kullanılarak yerine bir 2 ya da iki 1 bakılmaksızın başladı kökeni hangi tarafında, onlar test ve kontrol örnekleri eşit uzaklıkta olduğu gibi, solucanlar hareketi önyargı ortadan kaldırır. Bu solucan gecikme ya da amaçlanan yolun yanlış yorumlanması verimli, daha dolambaçlı yol almaya zorlayabilir bir odorant, cevap diğer solucanlar bir küme ile seyahat etmek zorunda olan solucanlar sorunu circumvents. Bu yöntem aynı zamanda daha büyük bir örneklem büyüklüğü olan ve araştırmacı katılımsız tahlil çalıştırın ve ayrılan zaman süresi bitiminde solucanlar puan için izin vererek pratik avantajlar gösterir.

Introduction

Ward, 1973 ⁵ kemotaksis testi geliştirdi, ve o zamandan beri geniş kapsamlı uygulamalar olmuştur. Nörobiyoloji kemotaksi testleri kullanarak çeşitli yararlanmıştır olan bir alandır. Koku uyum, öğrenme ve bellek basit bir formu, C. gösterilmiştir kemotaksi testleri ⁶ kullanarak elegans. Ayrıca göstermek için kullanılmış olduğunu ° C. elegans etanol solucanlar davranışsal plastisite gösterir sadece hoşgörü-bir sonucu gelişebilir, ama bu da solucanlar insanlarda ³ alkol bağımlılığının çalışmada çok yararlı olabilir göstermektedir. Tahliller da C yeteneğini göstermek için geliştirilmiştir elegans dernekler chemoattractants ve gıda (OP50) ⁷ arasındaki solucanlar tarafından yapılmış olduğunu göstererek kısa ve uzun süreli hafıza depolamak için. Ayrıca C, ilgili mevcut geniş bilgi verilir elegans genomunun, KemotaksiC. s davranış elegans mutasyonlar ^1,8 uyararak defalarca değiştirilmiş. Bu, C. geliştirilmesi gibi birçok heyecan verici mühendislik olanakları, sağlar bir biyoremidasyon aracı olarak elegans. Böylece, 1973 yılında kemotaksis testin ilk geliştirme yana, sık sık değişmiş ve disiplinlerden çeşitli gizemleri aydınlatmak için kullanılmıştır.

Bazı testler bir hedefe doğru solucanlar tarafından alınan belirli bir rota keşfetmek amaçladık. Bu tür prototip testi Ward ⁵ tarafından geliştirilmiştir. Üç solucanlar 15 dakika boyunca erimiş agar üzerine yerleştirilmiştir. Onların hareketleri onlar plakasının merkezinde bir çekici bir degrade kadar plaka çevre gitti onlar sol baskı tarafından takip edildi. Plaka üzerinde tüm solucanlar her deneme sonunda kloroform kullanılarak gözaltına alındı. Bu yöntemin bir alt çekici ve kontrol ile bir levhanın ortasında bir tek solucan yerleştirilmiştirkökeni ² t eşit ve zıt mesafelerde.

Pierce-Shimomura'nın ve ark. Kemotaksis ⁹ dahil hareketinin tam doğası gözlemlemek için bir analiz geliştirdik. Bağımsız solucanlar çekici madde kaynağı ile sonuçlanan, 9 cm Petri tabakları çekici veya radyal şekilli degrade bir konsantrasyonunu ihtiva eden ya da yerleştirilmiştir. Solucan tanınan bir bilgisayar yazılım programı gözlenen davranışı kaydetmek için kullanıldı. Mikroskop bağlı bir video kamera tahlil solucan görüş alanında kaldı sağlamak için koştu otomatik olarak Petri kabı ayarlamak için sahne ile birlikte çalıştı. Buradan, daha ayrıntılı bilgi C. tarafından görüntülenen pirouettes nedeni ile ilgili keşfedildi elegans.

Burada açıklanan daha yakın bir şekilde diğer analizler, test bileşikleri için solucanlar büyük bir nüfusun yanıt olarak test edilmiştir. İki çeyrek kemotaksi deneyleri olmuşturÇeşitli nöronlar, reseptörler, ve sinyal iletim molekülleri, C 'oynadığı roller keşfetmek için kullanılan elegans çeşitli bileşikler ¹ maruz kalmıştır. 20-50 arasında yıkanır solucanlar, anestetik, sodyum azit _(NaN3) birlikte polar ucunda bir çekici ve bir kontrol plakasının merkezine yakın yerleştirilmiştir. 60 dakika sonra, -1.0 den +1.0 değerleri ile bir kemotaktik indeksi cezbedici veya kontrol yapıştırılmış kaç solucan arasındaki fark esas alınarak oluşturulmuştur. Daha önce tahlil katı non-motil solucanlar değerlendirmek için başarısız olsa da benzer bir kemotaktik indeksi, bu makalede rapor tahlilinde kullanılmıştır. Bu deney, daha sonra daha fazla kemotaksisidir nöronal ablasyon etkilerini test uygulandı.

100-200 solucanlar dört kadran ³ içeren bir tabak ortasına yerleştirildi nerede söz konusu testin başka bir varyasyonu yapıldı. Bitişik çeyrek daireler ya ya da test yermadde kontrol. Önceki deneylerde olduğu gibi, solucanlar atılan önce sodyum azid hareketi ile hareketsizleştirildi. Benzer bir yöntem, C cevabı değerlendirmek için bir yol olarak burada açıklanan çeşitli bileşikler için elegans. Ancak, aşağıdaki yöntemi yalnızca hareketsiz solucanlardan mobil ayıran bir eşik mesafe geçti solucanlar değerlendirilmesi yararı vardır.

Diğer testler hareketsiz solucanlar görmezden için benzer yönergeleri dahil etmişlerdir. Frøkjær-Jensen ve diğerleri. Uçucu ve su hem de çözünebilir bileşikler ¹⁰ test etmek için kullanılabilecek bir analiz geliştirdik yönlü. Bir Petri kabı dört parçaya bölündü. Üst ve alt çeyrek solvent içermemektedir. Sol kadran su içerdiği ve doğru cezbedici içeriyordu. Suda çözünen bileşikler aga doğrudan yerleştirildi ise uçucu koku test ederken, analit, uygun kadran üzerinde, çanak kapağı yerleştirildir.

C. kemotaktik tepkiyi değerlendirmek için şu anda var olan yöntemler elegans sürekli kullanımı, verimlilik ve doğruluk kolaylığı optimize etmek için rafine edilmektedir. Burada açıklanan tahlil solucanlar en fazla (. Maksimum verim: 250 solucanlar / plaka başına saat, Lee ve ark ³ gösterdiği verim biraz daha fazla) değerlendirmek yeteneğine sahipken Yani,, bu yöntemin gerçek gücü olan Daha önce testleri (Tablo 1) özelliklerini birçok kısa doruk noktası.

Protocol

1. Worms hazırlanması / yıkama

1. Genç erişkin ¹¹ solucanlar senkronize.
2. Bir 5 cm Kemotaksis plaka üzerine S Bazal Pipet 2 ml sadece OP50 E. çim temizlendiğini solucanlar düzenledi coli. Solucanlar tampona plaka yüzeyinden yıkanır sağlamak için gerektiği gibi plaka yatırın.
3. Bir mikrosantrifüj tüp içine solucan-S Bazal çözüm pipet 1 ml.
4. 10 sn 6.600 rpm bir picofuge kullanmak için santrifüj.
5. Rahatsız solucanlar pelet bırakarak, S Bazal aspire.
6. Solucanlar yıkamak için birkaç kez ters, mikrosantrifüj tüpüne 1 ml S Bazal çözüm ekleyin.
7. Adımları 1,4-1,6 başka üç kez tekrarlayın.
8. 10 saniye, beşinci kez, yaklaşık bir nihai hacme süpernatan aspire bu süre santrifüjleyin. 100 ul.
9. Her 2 ul örnek 50 ila 250 solucanlar olmadığından emin olmak için bir NGM plaka üzerine solucanlar Pipet 2 ul. AyarlamakG Bazal daha küçük ya da daha büyük hacimde solucanlar yeniden süspansiyona tabi olarak, S Bazal solucanlar konsantrasyonu.
10. Hemen 1 saat için solucan yıkandıktan sonra tahlilinde solucanlar kullanın.

2. Test Tabaklar hazırlanması

1. 5 cm plakanın alt işaretleme, 4 eşit parçaya bölünür çanak bölmek. Kemotaksis NGM agar veya kullanılabilir. 3 çalışmaların en az test edilen genetik gerginlik başına gerekmektedir.
2. Kökeni etrafında yarıçapı 0.5 cm (Şekil 1) bir daire işaretleyin.
3. "Test" veya siteleri kökeni ve birbirinden eşit uzaklıkta olmasını sağlamak için bir "C" "Kontrol," için ya bir "T" ile her kadranda bir nokta işaretleyin. Noktaları en az 2 cm uzakta kökenli olmalıdır. Testi kadran ve sağ üst ve kontrol grubu olarak sol alt kadran (Şekil 1) olarak sol üst ve sağ alt kadran işaretleyin.

3. Testi Koşu

Test bileşiği ve 0.5 M azit (bir anestezik bir kadran erişme üzerine solucanlar tutmak için kullanılan), eşit hacimlerde birleştirerek test çözeltisi karıştırın. 0.5 M azid ile, test bileşiğinin seyreltmek için kullanılan çözücü ile birleştirilmesi ile kontrol solüsyonu karıştırın.

Kalkış üzerine pelet solucan çözeltisi (1.8 'de hazırlanan) (iki satır kesiştiği) Pipet 2 ul.

Iki "T" siteleri üzerine test çözeltisinin hemen sonra, pipet 2 ul. Benzer şekilde, iki "C" siteleri üzerine kontrol solüsyonu ile aynı miktarda pipetle.

Solucan ve odorant damla agar emilir edildikten sonra, kapakları yerine ve plakalar ters.

60 dakika sonra, 4 ° C inkübatör solucanlar yerleştirin. Bu sayılabilir yalnızca inkübatör bir tabak çıkarın. Oda sıcaklığında solucanlar bırakarak onları tekrar harekete izin verebilir.

Tamamen iç Ortam geçti her kadranda solucan sayısını kaydedinle.

Test ve kontrol kadran hem de kontrol çözeltisi kullanılarak adımları 3,2-3,6 tekrarlayın. Bu kontrol plaka olarak görev yapacak. Üç tür plakalar yapılmış ve uygun bir kontrol olarak hizmet çalıştırılmalıdır.

4. Skorlar Sözlü / Kemotaksis Endeks belirlenmesi

1. Denklem 1 kullanarak kemotaksis indeksi hesaplayın. Bu -1.0 ve +1.0 arasında bir kemotaktik indeksi verecektir.

(1)

Kemotaksis İndeksi = (Test bölgeleri Her iki içerisinde Worms - Her iki kontrol bölgeleri içerisinde Worms) / (Attı Worms # Toplam)

Bir +1.0 puan hedefe doğru maksimum çekim gösterir ve kimyasal hedef içeren kadran gelen solucanlar% 100 temsil eder. -1.0 Bir dizin maksimum itme kanıtıdır. Benzer test yöntemleri zaten ³ (Tablo 1) istihdam edilmiştir.

2. Ortalama Kemotaksi rapors Endeksi (CI) ve standart hata (SEM) anlamına gelir. Öğrenci T-testi test ve kontrol plakaları verileri karşılaştırarak yapın.

Representative Results

Yabani tip (N2) C Karşılaştırılması ODR-10 (KY10) mutant için elegans.

Biz, bilinen bir C diasetil el elegans kemoatraktan, diasetil ^1,12 için reseptör olmayan bir mutantı olduğu için vahşi tip solucanlar karşılaştırma. Doğal tipte (N2) solucanlar için kemotaktik indeksi etanol ve 0,839-0,100 ± 0.066 idi ± 0,031-0,5% diasetil. Beklendiği gibi, diasetil yabani tip solucanlar (p <0.003) anlamlı bir chemoattractive tepkisi açığa çıkartır. Buna karşılık diasetil reseptörleri yoksun ODR-10 (KY10) mutantlar kontrol (Şekil 3) önemli ölçüde farklı olmayan bir diasetil CI vardı.

Yazar	# Solucanlar / plaka	Süresi (dakika)	1 saat çıktı (max # solucanlar)	Artıları	Eksileri
Ward 5	3	15	12	• parça hareket Açık gözlem tarafından hareketsiz solucanlar için • hesap	araştırmacı katılımı @ kısa zaman aralıklarında (15 dakika) bağlıdır
Bargmann & Horvitz 2	1	60	1		• Düşük verimlilik 12-24 saat • Cezbedici yayılır
Bargmann, Hartwieg, Horvitz 1	20-50	60	50	• az araştırmacı katılımı (NaN 3 kullanılır) • orta # solucanlar	• Hiçbir gizli hareketsiz skorlama yöntemi • Hareketlerinizi izlemek değil
Lee Jee, McIntire 3	100-200	60	200	• az araştırmacı katılımı (NaN 3 kullanılır) # • Yüksekkurt
Pierce-Shimomura, Morse, Lockery 9	1	20 (veya plaka solucan hit kadar kenar)	3	• parça hareket Açık gözlem tarafından hareketsiz solucanlar için • hesap Solucan hareket • detaylı, kalıcı bir kayıt	gelişmiş bilgisayar izleme sistemi gerektirir
Margie, Palmer, Chin-Sang (bu yöntem)	50-250	60	250	• az araştırmacı katılımı (NaN 3 kullanılır) Hareketsiz solucanlar için • Yüksek # solucanlar • hesapları	• Hareketlerinizi izlemek değil

Tablo 1. Deney yöntemleri karşılaştırılması tarif.

Şekil 1. 5 santimetrelik bir petri tabağına dört çeyrek, Test ("T") ve kontrol ("C") olarak ya da alan belirlenen her ayrılmıştır. Iç daire hareketi attı olmayan bir alan çizer. Bu veri kıvrılıyor gelen hareketsiz solucanlar engeller. Kadran Testi bir alternatif desen oluşturmak ve solucanlar ilk yerleştirme oluşabilecek herhangi bir önyargı önlemek için kontrol edin.

Şekil 2. Tahlil bir şematik Lee ve ark. (2009) 'den alınmıştır. Plakalar kadran iki test (A ve B) ve iki kontrol (C ve D) ayrılır. Sodyum azid da solucanlar felç için Test ve Kontrol noktalar bulunur. Worms plaka ortasına yerleştirilir ve 60 dakika sonra solucanlar her Quadra dikkate alınırnt. Iç daire çapraz yoktu Bireyler attı değildir. Nötr ve çekici şematik örnekleri gösterilir. Kemotaktik Endeksi (CI) hesaplanması aşağıda gösterilmiştir.

Şekil 3,. Bir test çekici ya da etanol (kontrol plakaları) olarak ya diasetil kullanılarak yabani tip (wt) ve ODR-10 (KY10) solucan ile yapılan tahliller üretilen kemotaktik endeksleri. Değerleri, en az 3 bağımsız deney (n> 200 solucanlar) ikinci ortalamalarıdır her bir durum için. Hata çubukları ortalama, standart hata yansıtan (SEM) * = p <0.003 Student T-testi.

Discussion

Kemotaksis, nöronal ve hücresel mekanizmalar karmaşık bir dizi tarafından kontrol edilen, ancak kolay ve objektif kemotaksi deneyleri kullanılarak belirlenebilir. Testleri en iyi sonuçları elde etmek için, bazı kritik adımlar alınmalıdır. İlk olarak, solucanlar evreleme tutarlı deneysel sonuçlar veren esastır. Farklı yaşam aşamalarında Worms farklı ¹³ davranırlar, bu yüzden karışık aşamada solucanlar olabilir çarpık deneysel sonuçlar. İkinci olarak, tüm E. sağlanması artık bakteri tetkiki ile etkileşime olabilir coli solucanlar yıkanır, çok önemlidir. Anestezi, 0.5-1 M-sodyum azid, yerleştirdi nerede bir 1 cm yarıçap içinde solucanlar tutuklama unutmayın da önemlidir. Bu göz önüne alındığında, bu azid kökenli en az 2 cm yerleştirilmesini çok önemlidir. Azid kökeni 1,5 cm veya daha az fark edilir ise, solucanlar iç daire içinde felç olacak ve Asist atılır. Daha azid içine, daha yerleştirilirkadran solucanlar taşıyabilirsiniz. Tabaklar da çalışmalar arasında tutarlılığı sağlamak ve sonuçları yerçekimi önyargıları tarafından şaşırmış değil emin olmak için seviyede tutulmalıdır. Buna ek olarak, en fazla 250 den solucanlar deneyde kullanılmalıdır. Kalabalık bir dizi nedenlerle solucan hareketi engelleyebilir. Biz kümelenmiş solucanlar bir kadran seyahat lehine, birlikte kalma eğilimi bulundu. Son olarak, 60 dakika sonra, 4 ° C'de tahlil plakaları yerleştirmenin sayılabilir mümkün kadar araştırmacı plakanın durumunu korumak için izin hareket solucanlar tutar. Plakalar 4 ° C'de saklanır ve sonuçları etkilemeden birkaç gün sonra attı olabilir.

Birkaç usul değişiklik daha bu protokolün yarar artırabilirsiniz. Olduğu gibi, bu protokol ayrı deneylerde fenotipleri çeşitli test edilmesi için bir yöntem olarak hizmet edebilir. İdeal olarak, mutant denemelerin sonuçları da aynı şartlar altında karşılaştırılmalıdır. Suşları kullanarak bu ifade fluorescBu GFP veya RFP gibi ent proteinler yeterli olacaktır. Bu değişiklik aynı tahlil plaka ve bir tabak puanlama yerine testi karşı kontrolü plakaları puanlama yararına üzerinde çeşitli suşları koyarak araştırmacı büyük deneysel tutarlılık verecek.

Kemotaksi deneyleri, aynı zamanda genetik olarak yuvarlak solucan kemotaktik davranışını karakterize etmek için kullanılabilir. Bu, test edilecek diğer türlerden alınan reseptör bağlanma afinitesi sağlar. Bu reseptörler uyumlu bir şekilde solucanın kemoatraktan veya chemorepulsive nöronlarda ifade ise, beklenen kemotaktik sonuçları ⁸ dikkat edilmelidir.

Bu protokol, hem de daha fazla diğer ihtiyaçları karşılamak için adapte edilebilir. Şu anda, bu yöntem araştırmacı solucanlar hareketini izlemek için izin vermez. 5 cm tabak Bu tahliller için kabul edilebilir olduğundan, bir stereo bağlı bir video kamera hareketleri etkin bir şekilde olabilir filmmotorlu bir sahne ve solucan izleme yazılımı kullanmadan testinin bir çeyrek daireye doğru solucanlar. Kemo-atraktanlar öncelikle protokolünde test bileşikleri olarak anılacaktır, ancak sonunda, chemorepellents de kullanılabilir. Bu protokol, olduğu gibi veya değiştirilmiş, basit ve verimli ve C kemotaktik davranış ölçülmesi için etkin bir araç olarak hizmet edebilir elegans, veya lise veya lisans düzeyinde öğrencilere davranışlar sergilemek için.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave
PicoFuge	Stratagene	400552
Microscopes	Leica
Dissecting	Leica
P1000 Pipette	Gilson
P10 Pipette	Gilson
0.5 M Sodium Azide
Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Ethanol/Distilled Water
Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)
Agar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0.25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531