C. elegans Kemotaksi Assay

Summary

En fremgangsmåde til kvantitativt at vurdere den kemotaktiske reaktion af

Abstract

Mange organismer bruger chemotaxis at opsøge fødekilder, undgå skadelige stoffer, og finde kammerater. Caenorhabditis elegans har imponerende chemotaxis adfærd.

Udgangspunktet bag teste respons orme til et lugtstof er at placere dem i et område, og observere bevægelsen fremkaldes som reaktion på et lugtstof. Selv med de mange tilgængelige analyser fortsat optimering ormen begynder placering i forhold til både kontrol og test områder samtidig minimere interaktionen af orme med hinanden, og samtidig opretholde en betydelig stikprøvestørrelse et arbejde i gang ^1-10. Den her beskrevne metode har til formål at løse disse problemer ved at ændre analysen er udviklet af Bargmann et al. ^1.. En petriskål er opdelt i fire kvadranter, der to modsatte kvadranter mærket "Test" og to betegnet "Control". Bedøvelsesmiddel er placeret i al test-og kontrolsteder. Ormene er placeret i midten af ​​pladen med en CIRCLe markeret omkring oprindelsen at sikre, at nonmotile orme vil blive ignoreret. Udnytte en fire-kvadrant-system snarere end en 2 eller to 1 eliminerer forspænding i bevægelsen af ​​ormene, da de er lige langt fra test-og kontrolprøver, uanset hvilken side af oprindelsen de begyndte. Dette omgår problemet med orme bliver tvunget til at rejse gennem en klynge af andre orme til at reagere på et lugtstof, hvilket kan forsinke orme eller tvinge dem til at tage en mere omvej, hvilket giver en ukorrekt fortolkning af deres planlagte vej. Denne metode viser også praktiske fordele ved at have en større stikprøve og lade forskeren at køre analysen uden opsyn og score ormene når den tildelte tid er udløbet.

Introduction

Ward først udviklet kemotaksi assay i 1973 ^5, og siden da har haft vidtrækkende applikationer. Neurobiologi er et felt, der har gavn af anvendelse af en række kemotaxi assays. Olfaktoriske tilpasning, en simpel form for indlæring og hukommelse, er blevet påvist i C. elegans bruger chemotaxis assays ^6. De er også blevet anvendt til at vise, at C. elegans kan udvikle ethanol tolerance-et resultat, der ikke kun viser adfærdsmæssige plasticitet af ormene, men som også viser, at ormene kan være meget nyttige i studiet af alkoholafhængighed hos mennesker ^3. Assays er endda blevet udviklet til at demonstrere evnen af C. elegans til at gemme kort og lang sigt hukommelse ved at vise, at foreninger er lavet af ormene mellem kemoattraktanter og fødevarer (OP50) ^7.. Derudover får de omfattende foreliggende oplysninger vedrørende C. elegans genomet, den chemotaxis adfærd C. elegans er blevet ændret talrige gange ved at inducere mutationer ^1,8. Dette giver mulighed for mange spændende tekniske muligheder, såsom udvikling af C. elegans som en bioremediering værktøj. Således, siden den første udvikling af kemotaksi-assay i 1973, er det blevet hyppigt ændret og anvendt til at belyse mysterier i en række forskellige discipliner.

Visse assays til formål at opdage den specifikke rute, som ormene mod et mål. Den prototypiske assay af denne type blev udviklet af Ward ^5.. Tre orme blev placeret på smeltet agar til 15 min. Deres bevægelser blev sporet af aftrykket de efterlades som de rejste fra periferien af ​​pladen op en gradient til et tiltrækkende på midten af ​​pladen. Alle orme på pladen blev anholdt under anvendelse af chloroform ved slutningen af ​​hvert forsøg. En efterkommer af denne metode placeres en enkelt orm i midten af ​​pladen med lokkemidler og kontrol ent lige og modsat afstande fra oprindelsen ^2.

Gennembore-Shimomura et al. udviklet en assay til at observere den nøjagtige karakter af bevægelsen er involveret i chemotaxis ^9.. Individuelle orme blev anbragt i 9 cm petriskåle enten indeholder en ensartet koncentration af lokkemidler eller en radialt formet forløb, der kulminerede i kilden lokkemidler. En computer software program, der anerkendes ormen blev anvendt til at optage den observerede adfærd. Et videokamera fastgjort til et mikroskop sammen med denne fase for at justere petriskålen automatisk assayet løb at sikre ormen forblev i synsfeltet. Fra dette blev mere detaljerede oplysninger opdaget vedrørende årsagen til pirouetter vises ved C. elegans.

Andre analyser, mere ligner den her beskrevne, testede respons af en stor population af orme til testforbindelser. To kvadrant kemotaxi assays har væretbruges til at udforske de roller, de forskellige neuroner, receptorer, og signaltransduktionsmolekyler afspilles, når C. elegans blev udsat for forskellige forbindelser ^1.. Mellem 20-50 vaskede orme blev placeret nær centrum af pladen med et tiltrækkende og en kontrol på polære ender sammen med bedøvelsesmiddel, natriumazid _(NaN3). Efter 60 min blev en chemotaktisk indeks med værdier fra -1.0 til +1.0 genereret på baggrund af forskellen mellem, hvor mange orme blev anbragt på lokkemidler eller kontrollen. En lignende chemotaktisk indeks blev anvendt i analysen rapporteret i denne artikel, selvom den tidligere assay undladt at strengt evaluere nonmotile orme. Dette assay blev derefter yderligere anvendt til at teste virkningerne af neuronal ablation på kemotaxi.

En anden variation af den ovennævnte assay blev udført, hvor 100-200 orme blev placeret i centrum af en plade indeholdende fire kvadranter ^3. Tilstødende kvadranter enten indeholdt testen ellerstyre stof. Som i de foregående assays, blev ormene immobiliseret ved indvirkning af natriumazid før bliver scoret. En lignende fremgangsmåde er beskrevet her som en måde at evaluere reaktion C. elegans til forskellige forbindelser. Men nedenstående metode har den ekstra fordel på kun vurdere orme, der har bestået en tærskel afstanden mellem mobil fra immobile orme.

Andre analyser har indarbejdet lignende retningslinjer for at ignorere immobile orme. Frøkjær-Jensen et al. udviklet en alsidig assay, som kan anvendes til at teste både flygtige og vandopløselige forbindelser ^10. En petriskål blev opdelt i fire kvadranter. Den øverste og nederste kvadranter ikke indeholder opløsningsmidler. Den venstre kvadrant indeholdt vand, og retten indeholdt lokkemidler. Ved testning af flygtige lugtstoffer blev analyt placeret på låget af fadet over den rette kvadrant, mens vandopløselige forbindelser blev placeret direkte på agar..

De metoder, i øjeblikket findes til evaluering kemotaktiske respons C. elegans bliver konstant forfinet til at optimere deres brugervenlighed, effektivitet og nøjagtighed. Så mens assayet beskrevet her, har evnen til at vurdere det største antal orme (maksimal kapacitet:. 250 orme / time pr plade, lidt større end gennemløb demonstreret af Lee et al ^3), den virkelige styrke ved denne metode er den kortfattet kulminationen af mange af de attributter af tidligere assays (tabel 1).

Protocol

1.. Klargøring / vask Worms

1. Synkroniser orme til unge voksne ^11.
2. Afpipetteres 2 ml af S Basal på en 5 cm Chemotaxis plade af iscenesatte orme, der netop har ryddet plænen OP50 E. coli. Vip pladen efter behov for at sikre, at orme er vasket fra pladens overflade i bufferen.
3. 1 ml af ormen-S Basal opløsning i et mikrocentrifugerør.
4. Centrifuger i 10 sekunder ved hjælp af en PicoFuge på 6.600 rpm.
5. Aspirer S Basal, forlader pelleten af ​​orme uforstyrrede.
6. Tilsæt 1 ml S Basal løsning på mikrocentrifugerør, vendes et par gange for at vaske orme.
7. Gentag trin 1,4-1,6 yderligere tre gange.
8. Centrifuger i 10 sekunder en femte gang, denne gang aspirere supernatanten til et slutvolumen på ca. 100 gl.
9. Afpipetteres 2 pi af ormene onto en NGM plade at sikre, at der er mellem 50 og 250 orme i hver 2 pi prøve. Justerkoncentrationen af ​​orme i S Basal efter behov ved at resuspendere orme i et større eller mindre mængde S Basal.
10. Brug orme i assayet umiddelbart efter vask orme i op til 1 time.

2.. Forberedelse af Test Plates

1. Mærkning undersiden af ​​en 5 cm plade, skålen opdele i 4 lige store kvadranter. Kemotaxi agar eller NGM kan anvendes. Et minimum af 3 forsøg kræves per genetisk stamme, der testes.
2. Markér en cirkel med radius 0,5 cm rundt om oprindelse (figur 1).
3. Markér et punkt i hver kvadrant med enten et "T" for "Test" eller "C" for "Control", der sikrer, at de steder er lige langt fra oprindelsen og hinanden. Punkterne skal være mindst 2 cm væk fra oprindelsen. Markér de øverste venstre og nederste højre kvadranter som test kvadranter og øverst til højre og nederst til venstre kvadranter som kontroller (figur 1).

3.. Kørsel af Assay

Bland testopløsningen ved at kombinere lige store mængder af teststoffet og 0,5 M azid (bedøvelse anvendes til standsning ormene efter at have nået en kvadrant). Bland kontrol ved at kombinere det anvendte opløsningsmiddel til at fortynde testforbindelsen med 0,5 M azid.

Afpipetteres 2 ul af ormen opløsning (tilberedt i 1,8) fra pillen på oprindelsen (hvor de to linjer skærer hinanden).

Umiddelbart efter, pipette 2 ul af prøveopløsningen til de to "T" sites. Ligeledes pipette den samme mængde af kontrolopløsningen til de to "C" sites.

Når ormen og lugtstoffer dråber er blevet absorberet i agar, udskifte lågene og vend pladerne.

Efter 60 minutter, placere orme i et 4 ° C inkubator. Kun fjerne en plade fra rugemaskinen, når det kan tælles. Leaving orme ved rumtemperatur kan tillade dem at mobilisere igen.

Registrere antallet af orme i hver kvadrant, som fuldstændigt har passeret den indre circle.

Gentag trin 3,2-3,6 ved hjælp af kontrol løsning i både test-og kontrolsystemer kvadranter. Dette vil tjene som kontrol plade. Tre sådanne plader bør gøres og køre for at tjene som en passende kontrol.

4.. Fortolkning af Scores / Bestemmelse af Kemotaksi Index

1. Beregn kemotaksi indeks brug af ligning 1.. Dette vil give en kemotaktisk indeks mellem -1.0 og +1,0.

(1)

Kemotaksi Index = (# Worms i både test Kvadranter - # orme i både kontrol Kvadranter) / (Total # af scorede Worms)

A +1.0 score angiver maksimal tiltrækning mod målet og repræsenterer 100% af ormene ankommer kvadranterne indeholder kemiske målet. Et indeks på -1.0 er bevis på maksimal frastødning. Lignende assaymetoder er allerede blevet anvendt ³ (tabel 1).

2. Angiv gennemsnittet Chemotaxis Index (CI) og standard fejl betyder (SEM). Udfør en Students t-test sammenligner data fra test og kontrol plader.

Representative Results

Sammenligning vildtype (N2) C. elegans til ODR-10 (KY10) mutanten.

Vi brugte diacetyl, en kendt C. elegans kemoattraktant, at sammenligne vildtype orme som for en mutant, der mangler receptoren for diacetyl ^1,12. For vildtype (N2) orme det kemotaktiske-indekset var 0.100 ± 0.066 til ethanol, og 0,839 ± 0,031 til 0,5% diacetyl. Som forventet, diacetyl fremkalder en betydelig chemoattractive respons fra vildtype orme (P <0,003). I modsætning ODR-10 (KY10) mutanter, der mangler diacetyl receptorer havde en diacetyl CI der var ikke signifikant forskellig fra kontroller (figur 3).

Forfatter	# Orme / plade	Varighed (min)	1 time gennemløb (Max # orme)	Pros	Cons
Ward 5	3	15	12	• track bevægelse • redegøre for immobile orme af klare observation	afhængig forsker involvering @ korte tidsintervaller (15 min)
Bargmann & Horvitz 2	1	60	1		• lave gennemløb • tiltrækkende diffunderer for 12-24 timer
Bargmann, Hartwieg, Horvitz 1	20-50	60	50	• minimal forsker involvering (NaN3 brugt) • moderat # orme	• ingen diskret immobile scoring metode • sporer ikke bevægelse
Lee, Jee, McIntire 3	100-200	60	200	• minimal forsker involvering (NaN3 brugt) • høj #orm
Gennembore-Shimomura, Morse, Lockery 9	1	20 (eller indtil ormen hits kant plade)	3	• track bevægelse • redegøre for immobile orme af klare observation • detaljeret, permanent registrering af orm bevægelse	kræver avanceret computer tracking system
Margie, Palmer, Chin-Sang (denne metode)	50-250	60	250	• minimal forsker involvering (NaN3 brugt) • HIGH # orme • regnskab for immobile orme	• sporer ikke bevægelse

Tabel 1.. Sammenligning af beskrevne analysemetoder.

Figur 1. De 5 cm petriskål er opdelt i fire kvadranter, der hver betegnes enten som Test ("T"), eller Kontrol ("C")-området. Den inderste cirkel afgrænser et område, hvor bevægelse ikke er scoret. Dette forhindrer immobile orme fra skævvridning af data. Kvadranterne skaber et skiftende mønster af Test og kontrol til at forhindre enhver skævhed, der kan opstå fra den indledende placering af orme.

Figur 2. En skematisk af assayet tilpasset fra Lee et al. (2009). Pladerne er opdelt i kvadrater to test (A & B) og to kontroller (C & D). Natriumazid er også inkluderet med test-og Kontrol spots til at lamme orme. Orme er placeret i midten af ​​pladen og efter 60 minutter orme tælles på hver Quadrant. Personer, der ikke krydser inderkredsen ikke scoret. Skematiske eksempler på neutrale og lokkemidler er angivet. Den kemotaktiske indeks (Cl) beregning er vist nedenfor.

Figur 3. Kemotaktiske indekser genereret fra analyser udført med vildtype (wt) og OTB-10 (KY10) orme ved hjælp af enten diacetyl som en test lokkemidler eller ethanol (kontrol plader). Værdier er gennemsnit fra mindst 3 uafhængige forsøg (n> 200 orme) for hver betingelse. Fejlsøjler afspejler standardfejlen af ​​middelværdien (SEM) * = P <0,003 Student T-test.

Discussion

Kemotaxi, selvom styres af et komplekst sæt af neuronale og cellulære mekanismer, kan være let og objektivt kvantificeres ved hjælp af kemotaxi assays. For at opnå de bedste resultater fra de analyser, skal visse kritiske trin skal træffes. For det første iscenesættelse ormene er afgørende i giver ensartede eksperimentelle resultater. Worms på forskellige livsstadier opfører sig anderledes ^13, så blandede fase orme kan skew eksperimentelle resultater. For det andet sikrer alle E. coli vaskes orme er afgørende, da resterende bakterier kan interferere med analysen. Det er også vigtigt at bemærke, at bedøvelsesmidlet, 0,5-1 M-natriumazid, vil standse orme inden for en 1 cm radius, hvor det blev placeret. I betragtning af dette er det altafgørende, at den azid placeres mindst 2 cm fra oprindelsen. Hvis azid er spottet 1,5 cm eller mindre fra oprindelsen ormene vil blive lammet i den inderste cirkel og ingen scores. Jo længere azidet er placeret, jo længere ind ikvadranter orme kan bevæge sig. Pladerne bør også holdes for at sikre sammenhæng på tværs af forsøg, og at resultaterne ikke forvirret af gravitations bias. Desuden bør der ikke mere end 250 orme anvendes i eksperimentet. Fortrængning kan forhindre orm bevægelighed for en række årsager. Vi fandt, at klynge orme har tendens til at blive sammen, til fordel for at rejse til en kvadrant. Endelig placere assaypladerne ved 4 ° C efter 60 minutter holder orme i at bevæge sig, tillader forskeren at bevare tilstand af pladen, indtil den er i stand til at blive talt. Plader kan opbevares ved 4 ° C og scorede flere dage senere uden at påvirke resultaterne.

Et par proceduremæssige ændringer kan yderligere forbedre anvendeligheden af ​​denne protokol. Som det er, kan denne protokol tjene som en fremgangsmåde til at teste en række forskellige fænotyper i separate forsøg. Ideelt set bør resultaterne af mutant forsøg sammenlignes under de samme betingelser. Brug stammer, der udtrykker fluorescerent proteiner såsom GFP eller RFP ville opnå dette. Denne ændring vil give forskeren en større eksperimentel sammenhæng ved at placere forskellige stammer på den samme assaypladen og fordelen ved at lave en plade i stedet for at lave test versus kontrol plader.

Chemotaxis assays kan også anvendes til at karakterisere den kemotaktiske opførsel af gensplejsede nematodeorme. Dette tillader bindingsaffiniteten af ​​receptorer taget fra andre arter, der skal testes. Hvis disse receptorer er udtrykt i de kemotiltrækkende eller chemorepulsive neuroner af ormen i en kompatibel måde, bør forventede kemotaktiske resultater iagttages ^8..

Denne protokol kan yderligere tilpasses andre behov så godt. I øjeblikket virker denne metode ikke tillade investigator at spore flytning af orme. Fordi 5 cm plader er acceptabelt for disse assays kan et videokamera fastgjort til et stereomikroskop effektivt filme bevægelseaf ormene mod en kvadrant af assayet uden brug af en motoriseret trin og orm tracking software. Endelig, selv om kemoattraktanter primært benævnt prøveforbindelserne i protokollen, kan chemorepellents også anvendes. Denne protokol, som det er eller ændret, er enkel og effektiv og kan tjene som et effektivt redskab til at kvantificere det kemotaktiske adfærd C. elegans, eller til at demonstrere adfærd til studerende ved gymnasiet eller bachelor-niveau.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave
PicoFuge	Stratagene	400552
Microscopes	Leica
Dissecting	Leica
P1000 Pipette	Gilson
P10 Pipette	Gilson
0.5 M Sodium Azide
Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Ethanol/Distilled Water
Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)
Agar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0.25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531