Summary
정량의 화학 주성 반응을 평가하는 방법
Abstract
많은 생물 화성은 음식 근원을 추구 유해 물질을 피하고, 짝을 찾기 위해 사용합니다. Caenorhabditis의 엘레 인상적 화성 동작이 있습니다.
악취 물질에 웜의 반응을 테스트 뒤에 전제는 지역에 배치하고 악취 물질에 대한 응답으로 유발의 움직임을 관찰하는 것입니다. 도 사용할 수있는 많은 분석과 함께, 중요한 샘플 크기를 유지하면서 서로 웜의 상호 작용을 최소화하면서, 제어 및 시험 영역 모두에 상대적인 시작 위치 웜 최적화가 진행 1-10 작업 남아있다. 여기에 설명 된 방법은 Bargmann 등 1.에 의해 개발 된 분석을 수정하여 이러한 문제를 해결하는 것을 목표로하고있다. 페트리 접시는 네 개의 사분면으로 나누어 져 있습니다, "테스트"두 표시된 두 개의 반대 사분면은 "컨트롤"을 지정합니다. 마취는 모든 테스트 및 제어 장소에 배치됩니다. 웜 circl와 접시의 중앙에 배치됩니다E는 비 운동성이 웜은 무시 될 수 있도록하기 위해 원점을 표시했다. 4 - 쿼드런트 시스템을 활용하여보다 한 2 개의 1에 관계없이 시작 원산지 어느 쪽의, 그들은 테스트 및 컨트롤 샘플에서 등거리로 웜의 움직임에 편견을 제거합니다. 이 웜을 지연 시키거나 그들의 의도 된 경로의 잘못된 해석을 항복, 더 우회 길을하도록 할 수 있습니다 악취 물질에 응답하기 위해 다른 웜의 클러스터를 통해 여행 강제 웜의 문제를 우회. 또한이 방법은 큰 샘플 크기를 가지고 있으며 연구원 무인 분석을 실행하고 할당 된 시간이 만료되면 웜 점수를함으로써 실질적인 이점을 보여줍니다.
Introduction
워드는 첫 번째 1973 5 화성 분석을 개발하고, 그 이후 지금까지 도달하는 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 신경 생물학은 화성 분석의 다양한 사용의 혜택을있는 하나의 필드입니다. 후각 적응, 학습과 기억의 간단한 형태는 C로 입증되었습니다 화성 분석하기 6을 사용 엘레 간스. 그들은 또한 표시하는 데 사용되었는지 C. 엘레 에탄올 벌레의 행동 가소성을 보여줍니다뿐만 아니라 허용 오차 결과를 개발할 수 있지만, 또한 벌레가 인간 3 알코올 의존의 연구에 매우 유용 할 수 있음을 보여줍니다. 분석 심지어 C의 능력을 입증하기 위해 개발되었습니다 엘레은 협회가 chemoattractants과 음식 (OP50) 7 사이의 웜에 의해 만들어진 것을 보여 단기 및 장기 기억 저장합니다. 또한 C.에 대한 현재 사용 가능한 광범위한 정보를 제공 elegans의 게놈 chemotaxiC. s의 동작 엘레은 돌연변이에게 1,8를 유도하여 여러 번 변경되었습니다. 여기에는 C의 개발과 같은 많은 흥미로운 기술의 가능성에 대한 수 생물학적 도구로 엘레 간스. 따라서, 1973 년 화성 분석의 초기 개발 이후, 그것은 자주 변경하고 다양한 분야의 신비를 해명하는 데 사용되었습니다.
일부 분석은 목표를 향해 웜에 의해 수행되는 특정 경로를 발견하는 것을 목표. 이런 종류의 원형 분석은 구청 5에 의해 개발되었다. 세 가지 웜은 15 분 동안 녹인 한천에 배치했다. 그들의 움직임들은 판의 중앙에 유인에 그라데이션까지 접시의 주변에서 여행으로 그들이 떠난 인장으로 추적했다. 접시에 모든 벌레는 각 재판의 끝에서 클로로포름을 사용하여 체포되었다. 이 방법의 한 자손은 유인하고 컨트롤과 접시의 중간에 하나 벌레를 배치기원 2에서 t 같고 반대 거리.
피어스 - 시모무라 하였다. 화성 9에 관련된 운동의 정확한 특성을 관찰하는 분석을 개발했다. 개별 웜은 유인의 소스에 culminating, 9cm 페트리 접시 유인 또는 방사형 모양의 그라데이션의 균일 한 농도를 포함하는 하나에 배치되었다. 벌레를 인식하는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램은 관찰 된 행동을 기록하는 데 사용되었다. 현미경에 부착 된 비디오 카메라는 분석이 웜이 시야에 남아 보장하기 위해 실행 자동으로 페트리 접시를 조정하는 단계와 함께했다. 이것으로부터,보다 자세한 정보는 C.에 의해 표시되는 피 루엣의 원인에 관한 발견 엘레 간스.
여기에 설명 된 하나 이상의 유사한 다른 분석은 시험 물질에 웜의 큰 인구의 응답을 테스트했습니다. 두 사분면 화성 분석 실험했습니다다양한 신경, 수용체 및 신호 전달 분자가 때 C를 연주하는 역할을 탐구하는 데 사용 엘레은 다양한 화합물의 1에 노출되었다. 20-50 사이의 세척 웜 마취, 나트륨 아 지드 (NaN의 3)과 함께 극 끝에서 유인 및 제어 플레이트의 중앙 근처에 배치되었다. 60 분 후, -1.0에서 +1.0 사이의 값을 가진 화성 인덱스 유인 나 컨트롤에 부착 된 얼마나 많은 벌레의 차이에 따라 생성되었습니다. 이전의 분석은 엄격하게 비 운동성이 웜을 평가하는 데 실패하더라도 유사한 화학 주성 인덱스는이 문서에서보고 된 분석에 사용되었다. 이 분석은 다음 추가 화성에 신경 절제의 효과를 시험에 적용되었다.
100-200 벌레는 네 개의 사분면 3를 포함하는 접시의 중앙에 배치 된 위치를 앞서 언급 한 분석의 또 다른 변형이 수행되었다. 인접 사분면은 하나 또는 시험을 포함물질을 제어 할 수 있습니다. 이전 분석에서와 같이, 웜 득점되기 전에 지드 화 나트륨의 작용에 의해 고정되었다. 유사한 방법은 C.의 반응을 평가하는 방법으로 여기에 설명되어 있습니다 다양한 화합물 엘레 간스. 그러나 아래의 방법은 움직 웜 휴대 분리 임계 거리를 통과 한 웜을 평가 이점이 있습니다.
다른 분석은 움직 벌레를 무시 유사 지침을 통합했다. Frøkjær-젠슨 하였다. 휘발성과 물을 모두 수용성 화합물이 10을 테스트하는 데 사용할 수있는 다양한 분석을 개발했다. 페트리 접시는 네 개의 사분면으로 분할되었다. 상단과 하단 사분면 용제를 포함하지 않았다. 왼쪽 사분면 물을 포함하고, 오른쪽 유인이 포함되어 있습니다. 수용성 화합물은 AGA에 직접 배치 된 반면, 휘발성 악취를 테스트 할 때, 분석이 적절한 사분면을 통해, 접시의 뚜껑에 배치 된R.
C.의 화학 주성 반응을 평가하기위한 현재 존재 방법 엘레은 지속적으로 사용, 효율성 및 정확성의 용이성을 최적화하기 위해 세련되고있다. 여기에 설명 된 분석이 웜의 가장 큰 수 (. 최대 처리량 : 250 웜 / 판 시간당, Lee 등 3에 의해 입증 처리량보다 약간 큰) 평가의 기능을 가지고있는 동안 따라서,이 방법의 진짜 힘은 이전 분석 (표 1)의 여러 속성의 간결한 절정.
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Protocol
1. 벌레를 준비 / 세척
- 젊은 성인 11 벌레를 동기화 할 수 있습니다.
- 의 5 센티미터 주 화성의 접시에 S의 기초의 피펫 2 ㎖은 OP50 E.의 잔디를 취소 한 벌레를 개최 대장균. 웜이 버퍼에 플레이트 표면 세척하기 위해 필요한 접시를 기울이십시오.
- microcentrifuge 관에 벌레-S 기초 솔루션의 피펫 1 ML.
- 10 초는 6,600 rpm에서 PicoFuge를 사용하는 원심 분리기.
- 그대로 벌레의 펠렛을 남겨 S의 기초를 대기음.
- 벌레를 씻어 몇 번 반전, microcentrifuge 관에 1 ML S 기초 솔루션을 추가합니다.
- 단계 1.4-1.6 다른 세 번 반복합니다.
- 10 초 다섯 번째, 캘리포니아의 최종 볼륨에 상층 액을 흡입이 시간을 원심 분리기. 100 μL.
- 각 2 μL 샘플 50 ~ 250 벌레가 보장 NGM 접시에 벌레의 피펫 2 μL. 조정S의 기초의 작은 또는 더 큰 볼륨 벌레를 현탁하여 필요에 따라 S의 기초에있는 벌레의 농도.
- 즉시 1 시간에 대한 웜 세척 후 분석에 웜을 사용합니다.
2. 테스트 플레이트를 준비
- 5cm 플레이트의 아래쪽에 표시 4 같은 사분면에 요리를 나눕니다. 화성 한천 또는 NGM를 사용할 수 있습니다. 3 시험의 최소 시험되는 유전자 변형 당 필요합니다.
- 원점을 반경 0.5 cm (그림 1)의 원을 표시합니다.
- "테스트"또는 사이트 기원과 서로 등거리 있는지 확인하는 "C" "컨트롤"에 대한 하나 "T"각 사분면에있는 점을 표시합니다. 포인트 cm 이상 떨어져 원점에서해야합니다. 테스트 사분면과 오른쪽 상단 컨트롤 등 왼쪽 아래 사분면 (그림 1)과 같이 왼쪽 상단과 오른쪽 하단 사분면을 표시합니다.
3. 분석을 실행
4. 점수 해석 / 주 화성 지수를 결정
- 식 1을 사용하여 화성 인덱스를 계산합니다. 이 -1.0과 +1.0 사이의 화학 주성 인덱스를 얻을 것입니다.
(1)
화성 지수 = (테스트 사분면 둘 중 웜 - 모두 제어 사분면에있는 # 웜) / (득점 웜 # 총)
+1.0 점수는 대상을 향해 최대한의 매력을 나타내며 화학 대상을 포함하는 사분면에 도착 웜의 100 %를 나타냅니다. -1.0의 인덱스는 최대 반발의 증거입니다. 유사한 분석 방법은 이미 3 (표 1)을 채택하고 있습니다.
- 평균 Chemotaxi 신고의 지수 (CI)와 표준 오차 (SEM) 의미합니다. 학생의 T-테스트는 테스트 및 컨트롤 플레이트에서 데이터를 비교 수행합니다.
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Representative Results
야생형 (N2) C. 비교 ODR-10 (KY10) 돌연변이로 엘레 간스.
우리는 알려진 C를 디 아세틸 사용 엘레은 화학 주성, 디 아세틸 1,12에 대한 수용체를 부족 돌연변이의에 야생형 벌레를 비교. 야생형 (N2) 웜에 대한 화학 주성 지수는 에탄올 및 0.839-0.100 ± 0.066이었다 ± 0.031-0.5 % 디 아세틸. 예상대로, 디 아세틸은 야생 형 웜 (P <0.003)에서 유의 한 chemoattractive 반응을 이끌어. 반면에 디 아세틸 수용체를 부족 ODR-10 (KY10) 돌연변이 컨트롤 (그림 3)에서 유의 한 차이를 보이지 않았다 아세틸 CI를했다.
| 저자 | # 웜 / 판 | 시간 (분) | 1 시간 처리량 (최대 # 웜) | 프로 | 단점 |
| 구청 5 | 3 | 15 | 12 | • 트랙 이동 분명히 관찰 움직 웜 • 계정 | 연구원 참여 @ 짧은 시간 간격 (15 분)에 따라 |
| Bargmann & Horvitz 2 | 1 | 60 | 1 | • 낮은 처리량 12-24 시간 동안 • 유인 확산 | |
| Bargmann, Hartwieg, Horvitz 1 | 20-50 | 60 | 50 | • 최소한의 연구원 참여 비수 (NaN 3 사용) • 보통 # 웜 | • 더 신중 움직 채점 방법이 없습니다 • 움직임을 추적하지 않습니다 |
| 리 말씀은, McIntire 3 | 100-200 | 60 | 200 | • 최소한의 연구원 참여 비수 (NaN 3 사용) # • 높은벌레 | |
| 피어스 - 시모무라, 모스, Lockery 9 | 1 | 20 (또는 플레이트 웜 히트까지 가장자리) | 3 | • 트랙 이동 분명히 관찰 움직 웜 • 계정 웜의 움직임 • 상세한 영구 기록 | 고급 컴퓨터 추적 시스템이 필요합니다 |
| 마지, 파머, 친 - 상 (이 방법) | 50-250 | 60 | 250 | • 최소한의 연구원 참여 비수 (NaN 3 사용) 부동 웜 • 고 # 웜 • 계정 | • 움직임을 추적하지 않습니다 |
표 1. 분석 방법의 비교 설명했다.
그림 1. 5cm 페트리 접시는 네 개의 사분면, 시험 ( "T") 또는 제어 ( "C") 지역으로도 지정된 각으로 나누어 져 있습니다. 내부 원은 움직임이 득점하지 않는 영역을 묘사한다.이 데이터를 왜곡에서 움직 벌레를 방지 할 수 있습니다. 사분면 시험 교대 패턴을 생성하고 웜의 초기 위치에서 발생할 수있는 편견을 방지하기 위해 제어합니다.
그림 2. 분석의 도식은 Lee 등. (2009)에서 적응. 플레이트는 상한 두 개의 테스트 (A & B) 및 두 개의 컨트롤 (C & D)로 구분됩니다. 나트륨 아 지드는 벌레를 마비하는 테스트 및 제어 장소에 포함되어 있습니다. 웜은 접시의 중앙에 배치하고 60 분 웜은 각 쿼드에 계산됩니다NT. 내부 원을 통과하지 않은 개인은 채점되지 않습니다. 중립 유인의 개략적 인 예제가 표시됩니다. 화성 지수 (CI) 계산은 다음과 같습니다.
그림 3. 테스트 유인 나 에탄올 (제어 판)으로도 디 아세틸을 사용하여 야생형 (중량)와 ODR-10 (KY10) 웜으로 수행 분석에서 발생하는 화학 주성 지수. 값은 최소 3 독립적 인 실험 (n> 200 웜)의 평균입니다 각 조건. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 반영 (SEM) * = P <0.003 학생의 T - 테스트.
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Discussion
화성은 신경 및 세포 메커니즘의 복잡한 집합에 의해 제어하지만, 쉽게 객관적으로 화성 분석을 사용하여 정량화 할 수있다. 분석에서 최상의 결과를 얻으려면, 중요한 특정 단계를 수행해야합니다. 첫째, 벌레를 준비하는 것은 일관성있는 실험 결과를 산출 필수적이다. 서로 다른 삶의 단계에서 웜 다르게 13 동작, 그래서 혼합 단계 웜 왜곡 될 실험 결과. 둘째, 모든 E. 보장 잔류 세균이 분석을 방해 할 수 있으므로 대장균이 벌레를 세척하는 것은 매우 중요합니다. 마취, 0.5 M 나트륨 아 지드는이 배치 된 곳의 1 센티미터 반경 벌레를 체포 할 것을주의하는 것도 중요하다. 이 감안할 때, 그것은 지드가 원점에서 최소한 2 센티미터 배치하는 것이 가장 중요합니다. 지드는 원점에서 1.5 cm 이하 발견되면 웜은 내부 원 안에 마비되고 아무도 득점되지 않습니다. 더 지드는에, 더 배치사분면 벌레 이동할 수 있습니다. 플레이트는 실험의 일관성을 보장하고, 결과는 중력 편견에 의해 혼동되지 않도록 수준을 유지해야한다. 또한, 더 이상 250 이상의 벌레는 실험에 사용되어야한다. 크롤의 숫자 이유로 웜의 움직임을 방해 할 수 있습니다. 우리는 클러스터 웜 사분면 여행에 찬성 함께 유지하는 경향이 나타났습니다. 마지막으로, 60 분 후 4 ° C에서 분석 번호판을 배치하면이 계산 될 수있을 때까지 연구원 플레이트의 상태를 유지 할 수 있도록, 움직이는 벌레를 유지합니다. 접시는 4 ° C에 저장하고 그 결과에 영향을주지 않고 몇 일 후 득점 할 수 있습니다.
몇 가지 절차 수정은 더 이상이 프로토콜의 유용성을 향상시킬 수 있습니다. 마찬가지로,이 프로토콜은 별도의 실험에서 표현형의 다양성을 테스트하는 방법으로 제공 할 수 있습니다. 이상적으로, 돌연변이 시험의 결과는 동일한 조건에서 비교해야합니다. 균주를 사용하여 표현하는 fluoresc같은 GFP 또는 RFP로 엔트 단백질이 작업을 수행합니다. 이 수정은 동일한 분석 플레이트 한 접시 득점 대신 시험 대비 제어 플레이트 득점의 이익에 다양한 변종을 배치하여 연구자에게 큰 실험의 일관성을 줄 것입니다.
화성 분석은 유전자 조작 선충류 벌레의 화학 주성 동작을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 테스트 할 다른 종에서 가져온 수용체의 결합 친화력을 할 수 있습니다. 이러한 수용체가 호환되는 방식으로 웜의 화학 주성 또는 chemorepulsive 신경 세포에서 발현하는 경우, 예상 화성 결과는 8 준수해야합니다.
이 프로토콜은 또한뿐만 아니라 다른 요구 사항에 맞게 적용 할 수 있습니다. 현재이 방법은 조사 벌레의 움직임을 추적 할 수 없습니다. 5cm 플레이트 이러한 분석에 대한 허용하기 때문에, 실체 현미경에 부착 된 비디오 카메라는 효과적으로 움직임을 촬영하기 수전동 무대와 웜 추적 소프트웨어를 사용하지 않고 분석 한 사분면을 향해 웜. chemoattractants은 주로 프로토콜 테스트 화합물이라고하지만 결국, chemorepellents도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은, 그대로 또는 수정, 간단하고 효율적이며 C의 화학 주성 동작을 정량화하기위한 효과적인 도구로서 역할을 할 수 엘레 또는 고등학교 또는 학부 수준에서 학생들의 동작을 시연합니다.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 생명 과학이 작업에 자금을위한 여왕의 대학에서 예술과 과학의 학부 감사합니다. 뿐만 아니라, 우리는 필요한 시약, 장비 및 기술 지원을 제공하기 위해 턱 상 실험실을 감사드립니다. 우리는 또한 토론에 대한 그의 공헌 그는 특히 토니, QGEM 2011 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave | |||
| PicoFuge | Stratagene | 400552 | |
| Microscopes | Leica | ||
| Dissecting | Leica | ||
| P1000 Pipette | Gilson | ||
| P10 Pipette | Gilson | ||
| 0.5 M Sodium Azide | |||
| Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4] | |||
| Ethanol/Distilled Water | |||
| Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl) | |||
| Agar | Bio-Rad | 166-0600 | |
| NH4Cl | Amresco | CA97062-046 | |
| MOPS | VWR | CA12001-120 | |
| NH4OH | BDH | CABDH8641-2 | |
| 0.25% Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 |
References
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