C. Элеганс Анализ хемотаксиса

Summary

Метод количественной оценки хемотаксического ответа

Abstract

Многие организмы используют хемотаксисе искать источники пищи, избегать вредных веществ, а также найти партнеров. Caenorhabditis Элеганс имеет впечатляющие поведения хемотаксиса.

Помещение за тестирование реакции червей одоранта, чтобы разместить их в районе, и наблюдать за движением вызвало в ответ на одоранта. Даже с учетом многих доступных анализов, оптимизация червь местонахождение относительно контрольных и испытательных площадок, при сведении к минимуму взаимодействие червей друг с другом, при сохранении значительных размеров образец остается незавершенное ^1-10. Описанный здесь метод направлен на решение этих вопросов, изменив анализа разработанных Баргман и соавт. ^1. Чашку Петри разделена на четыре квадранта, два противоположных квадрантах с пометкой "Тест" и два обозначены "Контроль". Обезболивающий размещается во всех исследуемых и контрольных сайтов. Черви помещаются в центре пластины с Circlэлектронной отмечены вокруг начала координат, чтобы неподвижные черви будут игнорироваться. Используя четырехквадрантные система, а не один или два 2 +1 исключает предвзятость в движение червей, так как они находятся на одинаковом расстоянии от опытных и контрольных образцов, независимо от того, с какой стороны от происхождения они начали. Это обходит проблему червей вынуждена путешествовать через кластер других червей, чтобы ответить на одоранта, которые могут задержать червей или заставить их принять более кружным путем, что дает неверное толкование их намеченного пути. Этот метод также показывает практические преимущества, имеющие больший размер выборки и позволяет исследователю для запуска анализа без присмотра и забить червей раз за отведенное время истекло.

Introduction

Уорд впервые разработана хемотаксиса в 1973 году ^5, и с тех пор она имела далеко идущие приложений. Нейробиологии одно поле, что выиграл от использованием разнообразных хемотаксиса. Обонятельная адаптация, простой формы обучения и памяти, была продемонстрирована в C. Элеганс использованием хемотаксиса ^6. Они также показано, что C. Элеганс этанола может развиваться толерантность результат, который не только демонстрирует поведенческую пластичность червей, но это также показывает, что черви могут быть очень полезны в изучении алкогольной зависимости у людей ^3. Анализы даже были разработаны, чтобы продемонстрировать способность C. Элеганс для хранения краткосрочной и долгосрочной памяти, показав, что ассоциации сделаны червей между хемоаттрактанты и продукты питания (OP50) ^7. Кроме того, учитывая обширную в настоящее время информация о C. Элеганс генома, chemotaxiс поведением C. Элеганс была изменена много раз путем индукции мутаций ^1,8. Это позволяет много интересных возможностей техники, таких как развитие C. Элеганс как биологическая очистка инструмента. Таким образом, с момента первоначального развития анализа хемотаксиса в 1973 году, она была изменена и часто используется для выяснения тайн в различных дисциплинах.

Некоторые анализы направленные выявить конкретные пути следования червей к цели. Прототипом анализ такого рода был разработан Ward ^5. Три черви были размещены на расплавленный агар в течение 15 мин. Их движения были прослежены отпечаток они оставили на их пути от периферии пластины вверх градиента аттрактанта в центре пластины. Все червей на пластине были задержаны с использованием хлороформа в конце каждого испытания. Один потомок этого метода помещен одного червя в середине пластины с аттрактант и контрольт равными и противоположными расстояние от начала координат ^2.

Pierce-Shimomura соавт. разработали анализ наблюдать точный характер движения, участвующих в хемотаксис ^9. Индивидуальные червей помещали в 9 см чашки Петри, содержащие либо единой концентрации аттрактанта или радиальную форму градиент, что привело к источнику аттрактанта. Компьютерной программы, которая признала червь был использован для записи наблюдаемого поведения. Видеокамера прикреплена к микроскопу работал совместно с этапом для регулировки чашку Петри автоматически анализа управлял обеспечить червь оставались в поле зрения. Исходя из этого, более подробная информация была обнаружена относительно причины пируэты отображается C. Элеганс.

Другие анализы, более похожий на тот, описанный здесь, испытаны реакции большая популяция червей испытуемых соединений. Два квадранта хемотаксиса былииспользуются для изучения роли, которую различные нейроны, рецепторы, и молекулы передачи сигнала, подаваемого при C. Элеганс подвергают воздействию различных соединений ^1. В период 20-50 промытого червей были помещены вблизи центра пластины с аттрактант и контроль на полярных концах вместе с анестетиком, азид натрия (NaN _3). Через 60 мин хемотаксический индекс со значениями от -1,0 до +1,0 был сгенерирован на основе разницы между количеством червей были прикреплены к аттрактант или управления. Аналогичный показатель хемотаксическими был использован в анализе сообщается в этой статье, хотя ранее анализа не удалось строго оценить неподвижные червей. Этот анализ был затем далее применительно к тестирования эффектов нейронов абляции на хемотаксис.

Другой вариант вышеупомянутого Анализ проводили где 100-200 червей были помещены в центр пластины, содержащей четыре квадранта ^3. Квадранта или содержатся в тесте иликонтрольного вещества. Как и в предыдущих анализах, черви не могли двигаться под действием азида натрия, прежде чем забил. Аналогичный способ описан здесь как способ оценки отклика С. Элеганс различных соединений. Тем не менее, ниже метод имеет дополнительное преимущество только оценки червей, которые прошли порог расстояния, отделяющего от мобильного неподвижными червей.

Другие анализы включили аналогичных руководящих принципов для игнорирования неподвижными червей. Frøkjær-Йенсена и др.. разработали универсальный анализа, который может быть использован для тестирования как энергозависимые, так и водорастворимые соединения ^10. Чашку Петри была разделена на четыре квадранта. Верхний и нижний квадранты не содержит растворителей. Левом квадранте содержал воду, а также право содержащихся аттрактанта. При тестировании летучих одорантов, аналит был помещен на крышку чашки, в течение надлежащего квадранте, тогда как водорастворимые соединения помещали непосредственно на агаR.

Методы существующей в настоящее время для оценки хемотаксиса ответ С. Элеганс постоянно совершенствуются для оптимизации их простоты использования, эффективности и точности. Таким образом, в то время как анализ, описанный здесь, имеет возможность оценки наибольшего количества червей (максимальная пропускная способность:. 250 черви / час на тарелку, немного больше, чем пропускная способность продемонстрировано Ли и др. ^3); реальную силу этого метода сжатый кульминацией многих из атрибутов ранее анализа (табл. 1).

Protocol

1. Подготовка / стиральная черви

1. Синхронизация червей молодых взрослых ^11.
2. Пипетки 2 мл базальной S на 5 см Хемотаксис тарелку поставил червей, которые только что очистили газон OP50 Е. палочки. Наклоните пластины мере необходимости для обеспечения червей промывают с поверхности пластины в буфер.
3. Внесите 1 мл червя-S базальной решение в микроцентрифужную трубки.
4. Центрифуга в течение 10 сек использованием PicoFuge при 6600 оборотах в минуту.
5. Аспирируйте базальной S, оставляя осадок червей нетронутыми.
6. Добавьте 1 мл раствора базальной S в микроцентрифужных трубки, инвертировать несколько раз мыть червей.
7. Повторите шаги 1,4 до 1,6 еще три раза.
8. Центрифуга в течение 10 сек пятый раз, на этот раз аспирации супернатант до конечного объема прибл. 100 мкл.
9. Внесите 2 мкл червей на NGM пластины чтобы у пассажиров было от 50 до 250 червей в каждом 2 мкл образца. Регулироватьконцентрация червей в базальных S мере необходимости ресуспендированием червей в меньшем или большем объеме базальной S.
10. Используйте червей в анализе сразу после мытья червей на срок до 1 часа.

2. Подготовка тестовых планшетов

1. Маркировка нижней пластине 5 см, разделите блюдо на 4 равных квадранта. Агар хемотаксиса или NGM могут быть использованы. Минимум 3 испытания требуются в генетическое напряжение проходит испытания.
2. Отметить окружности радиусом 0,5 см вокруг начала координат (рис. 1).
3. Отметьте точки в каждом квадранте либо с "T" для "Test" или "C" на "Управление", гарантируя, что сайты находятся на одинаковом расстоянии от начала координат и друг друга. Точек должно быть не менее 2 см от начала координат. Отметить верхний левый и нижний правый квадранта в качестве тест-квадранта и в верхнем правом и нижнем левом квадрантах в качестве контроля (рис. 1).

3. Проведения анализа

Смешать исследуемого раствора путем объединения равных объемах тестируемого соединения и 0,5 М азид (анестезии, чтобы арестовать червей при достижении квадрант). Смешать контрольного раствора путем объединения растворитель, используемый для разбавления тестируемого соединения с 0,5 М азида.

Пипетка 2 мкл червь раствор (полученный в 1.8) из осадка на происхождение (где пересекаются две линии).

Сразу же после пипетки 2 мкл испытуемого раствора на две "Т" сайтов. Кроме того, пипетки такое же количество контрольного раствора на две "С" сайтов.

Как только червь и одоранта капли были поглощены в агар, заменить крышки и инвертировать пластин.

Через 60 мин поместить червей в 4 ° C инкубатора. Только снимите пластину из инкубатора, когда он может быть подсчитаны. Оставив черви при комнатной температуре может позволить им мобилизовать снова.

Запишите количество червей в каждом квадранте, что полностью пересек внутренний контурLe.

Повторите этапы 3,2 до 3,6 использованием контрольного раствора в обеих испытуемых и контрольных квадрантах. Это будет служить в качестве контрольной пластины. Три таких пластин должны быть сделаны и работают в качестве надлежащего контроля.

4. Интерпретируя результаты / определения индекса хемотаксиса

1. Расчет индекса хемотаксиса с помощью уравнения 1. Это приведет к хемотаксическими индекса от -1,0 до +1,0.

(1)

Индекса хемотаксиса = (# Черви в обоих тестовых Квадранты - # Черви в контрольной Квадранты) / (# Всего Червей забил)

Оценка 1,0 указывает максимальное привлечение к цели и представляет 100% от червей прибывающих в квадрантах содержащие химические цели. Индекс -1,0 свидетельствует о максимальной отталкивания. Подобные методы анализа уже были использованы ³ (Таблица 1).

2. Сообщить о средней Chemotaxiс индекса (CI) и стандартной ошибки среднего (SEM). Выполните Стьюдента тест сравнении данных испытуемых и контрольных пластин.

Representative Results

Сравнение дикого типа (N2) С. Элеганс в УСО-10 (KY10) мутанта.

Мы использовали диацетил, известный C. Элеганс хемоаттрактант, сравнивать дикого типа червей, что и мутант, который не хватает рецепторов Диацетил ^1,12. Для дикого типа (N2) червей хемотаксическими индекс 0,100 ± 0,066 в этаноле и 0,839 ± 0,031 до 0,5% диацетила. Как и ожидалось, диацетил вызывает значительное chemoattractive ответ от дикого типа червей (Р <0,003). В отличие УСО-10 (KY10) мутантов, которые не хватает Диацетил рецепторы были Диацетил CI, который не был значительно отличается от контроля (рис. 3).

Автор	# Червей / пластина	Продолжительность (мин)	1 час пропускная способность (макс # черви)	Плюсы	Минусы
Уорд 5	3	15	12	• Отслеживание движения • счета для неподвижных червей четкие наблюдения	зависит от исследователя участие @ короткие промежутки времени (15 мин)
Баргманом & Хорвица 2	1	60	1		• низкая пропускная • аттрактантом диффундирует в течение 12-24 часов
Баргман, Hartwieg, Хорвица 1	20-50	60	50	• минимальное участие исследователя (NaN 3 используется) • Умеренная # черви	• отсутствие сдержанный неподвижными метод скоринга • не отслеживает движения
Ли, Jee, Макинтайр 3	100-200	60	200	• минимальное участие исследователя (NaN 3 используется) • высокая #глисты
Pierce-Shimomura, Морс, Lockery 9	1	20 (или до червя хитов краю пластины)	3	• Отслеживание движения • счета для неподвижных червей четкие наблюдения • подробные, постоянная запись движения червя	требуется современная система отслеживания компьютера
Марджи, Палмера, Чин-Санг (этот метод)	50-250	60	250	• минимальное участие исследователя (NaN 3 используется) • высокая # червей • счета для неподвижных черви	• не отслеживает движения

Таблица 1. Сравнение анализа методами, описанными.

Рисунок 1. 5 см чашки Петри разделена на четыре квадранта, каждый обозначать либо как тест ("T") или управления ("C") области. Внутренний круг очерчивает область, где движение не забил. Это предотвращает неподвижные черви перекоса данных. Квадранта создать чередуются по испытаниям и контроля для предотвращения любой ошибки, которая может возникнуть в результате первичного размещения червей.

Рисунок 2. Схема анализа адаптированный Lee и соавт. (2009). Пластины разделены на два квадранта теста (& B) и два элемента управления (C & D). Азид натрия также входит в опытной и контрольной места, чтобы парализовать червей. Черви помещаются в центре пластины и через 60 минут черви рассчитывали друг на QuadraNT. Лица, которые не пересекали внутренний круг не забил. Схема примеры нейтральных и аттрактант указаны. Хемотаксические индекса (CI) расчет приведен ниже.

Рисунок 3. Хемотаксические индексов генерируется из тестов, выполненных с дикого типа (WT) и ODR-10 (KY10) червей с использованием либо диацетила в качестве аттрактанта теста или этанолом (контроль пластины). Значения представляют собой средние по меньшей мере три независимых экспериментов (п> 200 черви) Для каждого состояния. Границы ошибок отражают стандартная ошибка средней (SEM) * = Р <0,003 Стьюдента-тест.

Discussion

Хемотаксиса, хотя контролируется комплексом нейронов и клеточные механизмы, может быть легко и объективно количественно с помощью хемотаксиса. Для получения наилучших результатов анализов, некоторые важные шаги должны быть приняты. Во-первых, постановка червей имеет важное значение для получения последовательной экспериментальных результатов. Черви на разных этапах жизни ведут себя иначе, ^13, так смешанных червей этапе может привести к искажению результатов эксперимента. Во-вторых, обеспечение всех E. палочка смывается червей имеет решающее значение, как остаточные бактерии могут влиять на анализе. Важно также отметить, что анестетик, 0,5-1 М-азид натрия, будет задерживать червей в 1 см радиус которой она размещена. Учитывая это, имеет первостепенное значение, что азид быть как минимум 2 см от начала координат. Если азид замечена 1,5 см и менее от начала координат червей будет парализована в рамках внутренней окружности и никто не будет забито. Дальнейшее азид размещен, далее вквадранта червей может двигаться. Плиты должны также иметь уровень Для обеспечения согласованности между испытаниями и для обеспечения результатов не смешаны гравитационными предубеждений. Кроме того, не более 250 червей должен быть использован в эксперименте. Давка червь может препятствовать движению по ряду причин. Мы обнаружили, что кластерные черви, как правило, остаются вместе, в пользу поездки в квадранте. Наконец, размещение аналитические планшеты при 4 ° С после 60 мин держит червей от перемещения, позволяя исследователю сохранить состояние пластины, пока он не может быть подсчитаны. Пластины могут храниться при 4 ° С и забили через несколько дней без влияния на результат.

Несколько процедурных изменений может еще больше повысить полезность этого протокола. Как, этот протокол может служить метод тестирования различных фенотипов в отдельных испытаний. В идеале, результаты испытаний мутант следует сравнивать при тех же условиях. С использованием штаммов, которые выражают fluorescЛОР белков, таких как GFP или RFP бы достичь этого. Эта модификация даст исследователю большую согласованность экспериментальных путем размещения различных штаммов на том же планшете и преимущество забив один пластину вместо забив теста по сравнению с контрольными пластинами.

Хемотаксиса анализы могут быть также использованы для характеристики хемотаксиса поведение генетически модифицированных червей нематод. Это позволяет аффинность связывания рецепторов принятых от других видов, подлежащего испытанию. Если эти рецепторы экспрессированы в хемоаттрактантных или chemorepulsive нейронов червя в совместимом образом, ожидаемые результаты хемотаксический должны быть соблюдены ^8.

Этот протокол может быть дополнительно выполнена под другие нужды, а также. В настоящее время этот метод не позволяет экспертам отследить движение червей. Потому что 5 см пластинах приемлемы для этих анализов, видео камеры, подключенной к стереомикроскоп может эффективно снимать движениечервей в сторону одного квадранта анализа без использования моторизованной стадии и программное обеспечение червь слежения. Наконец, хотя хемоаттрактанты в основном называют тестируемых соединений в протоколе, chemorepellents также могут быть использованы. Этот протокол, как есть или изменить, проста и эффективна и может служить в качестве эффективного инструмента для количественной оценки хемотаксическими поведение C. Элеганс, или демонстрация поведения студентов в средней школе или университетском уровне.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave
PicoFuge	Stratagene	400552
Microscopes	Leica
Dissecting	Leica
P1000 Pipette	Gilson
P10 Pipette	Gilson
0.5 M Sodium Azide
Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Ethanol/Distilled Water
Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)
Agar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0.25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531