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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

के नैदानिक ​​अनुप्रयोग Published: February 1, 2013 doi: 10.3791/50070
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1
1Division of Pediatrics, U.T. MD Anderson Cancer Center, 2Department of Stem Cell Transplantation and Cellular Therapy, U.T. MD Anderson Cancer Center

Summary

टी एक CD19 विशिष्ट chimeric प्रतिजन रिसेप्टर (सीएआर) व्यक्त कोशिकाओं बी सेल malignancies के investigational उपचार के रूप में हमारी पहली में मानव जीन थेरेपी परीक्षण में संचार कर रहे हैं. हम टी कोशिकाओं की आनुवंशिक संशोधन का उपयोग का वर्णन

Protocol

0 दिन या उसके पहले

1. पंजाब और यूसीबी से mononuclear कोशिकाओं का अलगाव (एमएनसी)

  1. बराबर मात्रा के साथ पंजाब, और पीबीएस EDTA के चार संस्करणों के साथ यूसीबी पतला.
  2. 40 मिनट (कोई ब्रेक) Ficoll पर धीरे धीरे परत पतला (25 मिलीग्राम) एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब (ओं) और 30 के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र में रक्त (12 मिलीग्राम).
  3. ले लीजिए और mononuclear सेल (इंटरफ़ेस) अंश एक ताजा 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग कर हस्तांतरण.
  4. पीबीएस EDTA के साथ 50 मिलीलीटर मात्रा लाओ और 10 मिनट के लिए 450 XG पर अपकेंद्रित्र.
  5. Aspirate पूर्ण संस्कृति (सीसीएम) मीडिया और 10 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र के 50 मिलीलीटर में तैरनेवाला, धीरे फिर से सेल को निलंबित गोली (ओं).
  6. धीरे फिर से निलंबित और CCM में सेल छर्रों पूल और एक सेल गिनती Trypan नीले अपवर्जन विधि (Cellometer, PBMC कार्यक्रम) का उपयोग करते हुए प्रदर्शन.
  7. बहुराष्ट्रीय कंपनी अब electroporation (Nucleofection) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या भविष्य में उपयोग के लिए cryopreserved.
शीर्षक "> 2 0 दिवस पर electroporation के लिए टी कोशिकाओं की तैयारी.

  1. यदि cryopreserved बहुराष्ट्रीय कंपनी का उपयोग, जल्दी से एक पूर्ण पैमाने पर (2 x 10 8 खाते centrifugation और 2 घंटा ऊष्मायन के दौरान सेल के झड़ने के लिए ~ 20% जोड़कर) electroporation ° 37 में पानी स्नान सी के लिए पर्याप्त कोशिकाओं पिघलना करने के लिए. यदि हौसले से पृथक बहुराष्ट्रीय कंपनी का उपयोग करने के लिए 2.3 कदम आगे बढ़ना.
  2. धीरे फिर से निलंबित और एक उचित आकार अपकेंद्रित्र (ओं) पूर्व गर्म पूरा Phenol मुक्त RPMI संस्कृति (पीएफ RPMI) मीडिया और 10 (ब्रेक) मिनट, Aspirate तैरनेवाला के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब निहित कोशिकाओं हस्तांतरण.
  3. पीएफ - बहुराष्ट्रीय कंपनी में RPMI पुनः स्थगित करता है, एक सेल गिनती (Cellometer) प्रदर्शन और 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में एक उचित आकार सेल संस्कृति पोत (ओं) कोशिकाओं हस्तांतरण.
  4. एक humidified 37 में सेते ° / सी 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर ± 2 घंटे के लिए 30 मिनट.
  5. बाँझ अपकेंद्रित्र (ओं) ट्यूब, 200 XG पर 5 मिनट (ब्रेक नहीं) के लिए स्पिन करने के लिए बहुराष्ट्रीय कंपनी स्थानांतरण, aspirate तैरनेवाला और धीरे rई निलंबित और पीएफ - RPMI में सेल गोली (एस) गठबंधन.
  6. प्रदर्शन एक सेल गिनती (Cellometer) और सेल (2 x 10 8 बहुराष्ट्रीय कंपनी) की आवश्यकता निलंबन की मात्रा की गणना.
  7. एक बाँझ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और 10 मिनट (कोई ब्रेक नहीं) के लिए 200 XG पर स्पिन की गणना करने के लिए मात्रा स्थानांतरण.
  8. तैरनेवाला Aspirate इतना है कि कोई अवशिष्ट मीडिया में रहता है और धीरे ट्यूब के पक्ष दोहन द्वारा फिर से को निलंबित.

3. बहुराष्ट्रीय कंपनी (पूर्ण पैमाने पर प्रक्रिया का उपयोग कर 10 cuvettes) 0 दिवस पर electroporation (Nucleofection)

  1. 10 एक humidified ° 37 / सी 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में गर्म पीएफ RPMI 4 मिलीलीटर युक्त कुओं के साथ एक बाँझ 12-अच्छी तरह से थाली पूर्व सेते हैं.
  2. तैयार है और पूर्व गर्म LONZA Nucleofector समाधान मानव टी सेल (निर्माता के निर्देशों के अनुसार पुनर्गठन, किट www.lonza.com ) एक जैवसुरक्षा मंत्रिमंडल (बीएससी) में परिवेश के तापमान.
  3. Addin द्वारा Nucleofector समाधान / डीएनए मास्टर मिश्रण तैयारछ पूरक Nucleofector समाधान के 100 μl, transposon की 15 ग्राम (supercoiled प्लास्मिड डीएनए रूप में नामित CD19RCD28/pSBSO) और Transposase की 5 ग्राम प्रति प्रतिक्रिया / क्युवेट (supercoiled प्लास्मिड डीएनए के रूप में नामित pCMV - SB11).
  4. धीरे अपकेंद्रित्र ट्यूब के पक्ष दोहन द्वारा सेल गोली (2.8 कदम से) फैलाने और फिर से Nucleofection मास्टर / समाधान डीएनए मिश्रण (अंतिम सेल एकाग्रता: 2 7 x 10 cells/100 μl) को निलंबित.
  5. ध्यान से दस (10) LONZA Nucleofection cuvettes से प्रत्येक सेल निलंबन (3.4 कदम से) के 100 μl हस्तांतरण, बुलबुले से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है.
  6. क्युवेट एक बार टैप करें, और U-014 कार्यक्रम (unstimulated टी कोशिकाओं के लिए) का उपयोग electroporate.
  7. BSC cuvettes और 12 अच्छी तरह से थाली (3.1 कदम) स्थानांतरण.
  8. एक Amaxa ठीक टिप हस्तांतरण विंदुक का उपयोग अच्छी तरह से इसी से पूर्व गर्म संस्कृति माध्यम के 500 μl जोड़कर 12-Ste में अच्छी तरह से तैयार प्लेट (प्रत्येक क्युवेट से electroporated कोशिकाओं, फसल3.1 पी) और humidified 37 प्लेट वापस ° / सी 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर ± 2 घंटे के लिए 30 मिनट.
  9. ऊष्मायन 2 घंटा फसल, के बाद और सभी कुओं से बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण.
  10. 8 मिनट, परिवेश के तापमान, कोई ब्रेक और aspirate और तैरनेवाला इतना है कि कोई अवशिष्ट मध्यम सेल गोली शामिल त्यागने के लिए 140 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं धो लें.
  11. धीरे अपकेंद्रित्र ट्यूब के पक्ष दोहन द्वारा सेल गोली फैलाने और धीरे CCM में फिर से निलंबित करने के लिए एक एकल कक्ष निलंबन को प्राप्त करने के.
  12. सेल गिनती प्रदर्शन और 10 6 कोशिकाओं / एमएल CCM सेल एकाग्रता समायोजित.
  13. सेल संस्कृति (ओं) इनक्यूबेटर में और फ्लास्क जगह सेल निलंबन रातोंरात स्थानांतरण.
  14. EGFP-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (5 x 10 6 कोशिकाओं / 5 ग्राम के साथ क्युवेट, Amaxa नियंत्रण EGFP प्लाज्मिड supercoiled pmaxGFP): प्रक्रिया कदम 2.1 3.8 नियंत्रण के लिए दोहराया गया.

1 1 दिन सेंट और बाद मेंउत्तेजना साइकिल

4. कार अभिव्यक्ति की फ्लो 1 दिवस पर विश्लेषण

  1. Electroporated कोशिकाओं फसल और एक सेल गिनती Trypan नीले अपवर्जन विधि (Hemocytometer) का उपयोग करते हुए प्रदर्शन.
  2. CD3, CD4, CD8, और मानव Fcγ आईजीजी (कार अभिव्यक्ति की माप के रूप में) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग कोशिकाओं (1 से 2 10 x 6).
  3. FACS Calibur पर कोशिकाओं के अधिग्रहण और FCS एक्सप्रेस सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए कार की अभिव्यक्ति की गणना के डेटा का विश्लेषण.
    1. सूत्र द्वारा संस्कृति में कार + कोशिकाओं की गणना:
      (कुल व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या) x (% कार + कोशिकाओं) = कार की संख्या + कोशिकाओं

5. 1 दिवस पर aAPC की तैयारी (# क्लोन 4). aAPC (# क्लोन 4) सह व्यक्त वांछित टी सेल अणु सह stimulatory K562 कोशिकाओं (अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह से प्राप्त Parental लाइन) से प्राप्त किए गए

  1. पिघलना के 37 में जमे हुए 100 Gy विकिरणित aAPC की एक अशेष भाजक °, सी पानी स्नान.
  2. कोशिकाओं centrifugation द्वारा दो बार धोया जाता है और 400 XG, CCM में 10 मिनट में Cellometer (Trypan नीले अपवर्जन) गिनती का उपयोग.
  3. व्यवहार्य उत्तेजना के लिए आवश्यक aAPC की संख्या की गणना:
    (कार + कोशिकाओं की संख्या) 2 x विकिरणित aAPC = नहीं की आवश्यकता

6. कार की उत्तेजना aAPC की मध्यस्थता + टी कोशिकाओं दिवस पर 1 1 सेंट की शुरुआत और बाद में उत्तेजना साइकिल

  1. CCM में: 1:2 के अनुपात (व्यवहार्य aAPC कार + सेल) में एक बाँझ कंटेनर में मिश्रण electroporated (सीएआर व्यक्त) कोशिकाओं और γ. विकिरणित aAPC (# क्लोन 4).
    1. नोट aAPC अनुपात प्रवाह cytometry electroporation के बाद दिन के आधार पर कार की अभिव्यक्ति के लिए निकाला जाता है.
  2. सेल निलंबन के लिए आईएल 21 (30 एनजी / एमएल) जोड़ें.
  3. में अशेष भाजक टी 75 सेमी 2 (ओं) फ्लास्क और / या 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में Vue जीवन संस्कृति बैग और incubat पर लौटने के लिएया.

3 दिन, 5

7. कार की निरंतर संस्कृति + टी कोशिकाओं

  1. प्रदर्शन एक आधे मीडिया परिवर्तन, आईएल-21 फिर से भरना, और 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में टी कोशिकाओं को बनाए रखने.

7 दिन

8. पहले उत्तेजना aAPC साइकिल की मध्यस्थता की समाप्ति

  1. हार्वेस्ट कोशिकाओं की गिनती, और CD3, CD4, CD8, और Fcγ (सीएआर) के लिए और दाग 10.1 कदम आगे बढ़ना.

9. CD56 + कोशिकाओं (आमतौर पर 7 और 14 के बीच दिनों electroporation के बाद) की कमी

  1. एक CD56 अनुचंबकीय मोती का उपयोग कर रिक्तीकरण प्रदर्शन अगर CD56 + CD3 neg ≥ 10% लिम्फोसाइटों.

उत्तेजना साइकिल # 2, 3 और 4 # 8 दिन → 14 के अनुरूप, 15 दिन → 21, और 22 → 28 दिन

10. AAPC की पुनरावर्ती अलावा चिकित्सकीय पर्याप्त संख्या टी कोशिकाओं का प्रचार

  1. Stimulatio दोहराएँn (4 बार) की प्रक्रिया के रूप में 4.3-8.1 चरणों में वर्णित है.
  2. 7 दिन, 14 और 21 पर शुरुआत और प्रत्येक मीडिया परिवर्तन (सप्ताह में तीन बार, एक समय पर सोमवार, बुधवार, शुक्रवार) में तो संस्कृतियों, IL-2 (50U/ml) जोड़ें.
  3. Cryopreserve (संग्रह) अतिरिक्त टी कोशिकाओं के रूप में की जरूरत है.
    1. टी कोशिकाओं को नियंत्रित दर फ्रीजर का उपयोग कर जमे हुए.

दिन 28

11. अंतिम उत्तेजना aAPC की मध्यस्थता चक्र की समाप्ति हार्वेस्ट टी कोशिकाओं

  1. रिहाई परीक्षण और संचार के लिए टी कोशिकाओं Cryopreserve.

Representative Results

हम रिपोर्ट है कि प्लास्मिड डीएनए और γ विकिरणित aAPC टी कोशिकाओं के प्रसार के विद्युत हस्तांतरण टी मानव अनुप्रयोगों के लिए पंजाब और यूसीबी से ली गई कोशिकाओं की चिकित्सकीय अपील संख्या उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन आनुवंशिक रूप से संशोधित टी कोशिकाओं एक शुरू की कार है कि CD19 TAA, प्रमुख उतक अनुरूपता परिसर के स्वतंत्र पहचानता व्यक्त करते हैं. एस.बी. व्युत्पन्न डीएनए plasmids transposon (i), 2 एन डी पीढ़ी कार (CD19RCD28) कि CD28 और 14 CD3 - ε के माध्यम से संकेत है, और (ii), 15 SB11 Transposase पहले किया गया है 13 में वर्णित है, 16,17 को व्यक्त करने के लिए . वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया plasmids वाणिज्यिक Waisman क्लीनिकल Biomanufacturing सुविधा (मैडिसन, WI) द्वारा तैयार किए गए. (# क्लोन 4) aAPC, K562 (अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह से प्राप्त माता पिता रेखा) कोशिकाओं, सह व्यक्त वांछित टी सेल सह stimulatory अणुओं (aAPC की कोशिका की सतह पर प्रत्येक 3 90% पर शुरू अणु) से व्युत्पन्न,के रूप में पहले 12 में वर्णित है. यहां हम बताते हैं कि CD19 विशेष टी कोशिकाओं mononuclear (एमएनसी), पंजाब या यूसीबी एस.बी. स्थानांतरण का उपयोग करने के लिए कार aAPC के अलावा द्वारा पीछा करने के लिए संख्यानुसार निर्भर कार तरीके में टी कोशिकाओं (1 आंकड़े का विस्तार शुरू से निकाली गई कोशिकाओं से उत्पन्न किया जा सकता है ,) 4 13,18. दस cuvettes (2x10 7 / बहुराष्ट्रीय कंपनी क्युवेट) प्रत्येक 15 ग्राम के डीएनए प्लाज्मिड (CD19RCD28/pSBSO) transposon (सीएआर) के लिए कोडिंग और प्लास्मिड डीएनए के 5 ग्राम (pCMV SB11) Transposase (SB11) के लिए कोडिंग का उपयोग प्राप्तकर्ता के लिए electroporated कर रहे हैं. cuvettes की संख्या अगर बहुराष्ट्रीय कंपनी को सीमित कर रहे हैं या प्रयोगशाला काम के लिए वापस पहुंचा कम किया जा सकता है. electroporation के दिन उत्तेजना चक्र # 1 दिन 0 "के रूप में परिभाषित किया गया है. के रूप में प्रवाह cytometry और संस्कृति शर्तों के लिए नियंत्रण, ऑटोलॉगस टी कोशिकाओं नकली electroporated (प्लास्मिड डीएनए के बिना) और संख्यानुसार γ विकिरणित (# क्लोन 4) aAPC कि गया था OKT3 साथ पूर्व लोड CD3 पार से लिंक करने के लिए टी सेल को बनाए रखने के लिए पर विस्तार प्रसार. हम routinely electrotransfer और electroporation के बाद दिन टी कोशिकाओं (चित्रा 2B) की व्यवहार्यता की क्षमता का आकलन करें. नियंत्रण डीएनए प्लाज्मिड (pmaxGFP नामित) इस प्रारंभिक समय बिंदु पर और कार से EGFP की अभिव्यक्ति एकीकृत और episomal प्लाज्मिड से प्रोटीन की अभिव्यक्ति को दर्शाता है. आमतौर पर, दिन electroporation के बाद हम ~ ~ 40% (2 चित्रा) में 40-50% के बीच टी सेल व्यवहार्यता के साथ 60% और कार अभिव्यक्ति में EGFP अभिव्यक्ति उपाय. घुलनशील पुनः संयोजक मानव आईएल 2 और IL-21 की उपस्थिति में γ विकिरणित aAPC के पुनरावर्ती अतिरिक्त टी कोशिकाओं stably कार (CD19RCD28) व्यक्त निकालते हैं. CD3 neg CD56 + एन.के. कोशिकाओं CD56 विशिष्ट paramagnetic मनकों का उपयोग अगर इन एन.के. कोशिकाओं के प्रतिशत ≥ 10% है और विशेष रूप से अगर टी कोशिकाओं पर व्यक्त की कार का प्रतिशत कम है संस्कृति से समाप्त हो रहे हैं. है जो aAPC की क्षमता के साथ हस्तक्षेप एन.के. कोशिकाओं का तेजी से अतिवृद्धि रिक्तीकरण रोकता proliferatio को बनाए रखनेकार की n + टी कोशिकाओं. इस अवसर पर, कार + टी कोशिकाओं से एन.के. कोशिकाओं की कमी पिछले दो उत्तेजना चक्र के दौरान किया जाता है, लेकिन यह वांछित कोशिकाओं के कुछ कार + टी कोशिकाओं पर सह CD56 की अभिव्यक्ति के कारण हानि का परिचय. टी कोशिकाओं एक कार्यात्मक बंद पिछले 14 दिन Vue जीवन संस्कृति बैग का उपयोग कर प्रणाली में बड़े हो रहे थे. आनुवंशिक रूप से संशोधित और प्रचारित टी कोशिकाओं की एक सबसेट आम तौर पर 14 दिन या aAPC पर 21 दिन (उत्तेजना चक्र के अंत # 2 या 3 #) सह संस्कृति में cryopreserved संग्रहीत सामग्री के भविष्य के विश्लेषण के लिए एक स्रोत के रूप में सेवा करने के लिए और thawed है अगर अप्रत्याशित समस्याओं बाद में निर्माण प्रक्रिया के दौरान होते हैं. टी कोशिकाओं आम तौर पर या संस्कृति के 28 दिन के बारे में (3 चित्रा) काटा जाता है कि नियमित रूप से> 90% कार एक्सप्रेस और> 80% व्यवहार्य (चित्रा -2 सी, डी). हम पहले से पता चला है कि, aAPC सह संस्कृति के चार सप्ताह के बाद औसत CD3 के गुना विस्तार + टी कोशिकाओं 19,800 ± 11,313 सीए के साथ + आर अभिव्यक्ति 90% किया जा रहा है ± 7.5 13. ये टी कोशिकाओं cryopreserved और प्रक्रिया और रिहाई परीक्षण है कि सुरक्षा और विनिर्मित उत्पाद के चिकित्सीय क्षमता पर सूचित से गुजरना. रिलीज परीक्षण अनुपालन में नैदानिक ​​प्रयोगशाला सुधार (CLIA) संशोधनों के विश्लेषण का एक प्रमाण पत्र नैदानिक ​​परीक्षणों पर प्राप्तकर्ताओं में अर्क से पहले उत्पन्न के साथ किया जाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रक्रिया electroporate और कार + पंजाब और यूसीबी से टी कोशिकाओं का प्रचार रूपरेखा कदम. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 2. PB से आनुवंशिक रूप से संशोधित टी कोशिकाओं की विशेषता जीन स्थानांतरण की क्षमता का आकलन करने के लिए 1 उत्तेजना चक्र के 0 दिन में (ए) EGFP की अभिव्यक्ति. CD19 विशेष कार की अभिव्यक्ति (CD19RCD28) के रूप में CD3 पर प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन + CD8 + और ​​सीडी 4 + (बी) electroporation के बाद लगभग 24 घंटे और (ग) 28 दिनों aAPC पर सह संस्कृति के बाद में टी कोशिकाओं. कार की इसी तरह की अभिव्यक्ति यूसीबी व्युत्पन्न टी कोशिकाओं के साथ मनाया गया. (डी) कार अभिव्यक्ति की कैनेटीक्स. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. पीबी व्युत्पन्न कार के प्रचार+ टी कोशिकाओं CD3 + और ​​कार + टी γ-विकिरणित संयोजक मानव IL-2 घुलनशील और IL-21 की उपस्थिति में aAPC पर दोहराया सह संस्कृति PB से ली गई कोशिकाओं के संख्यात्मक विस्तार की दर. ऊपर की ओर तीर γ विकिरणित aAPC के अतिरिक्त है कि प्रत्येक उत्तेजना चक्र की शुरुआत के निशान से संकेत मिलता है. यूसीबी व्युत्पन्न + कार टी कोशिकाओं संख्यात्मक विस्तार की समान दर दिखा रहे हैं.

चित्रा 4
चित्रा 4. विनिर्माण एस.बी. और aAPC सिस्टम का उपयोग करने के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित करने और कार प्रचार प्रक्रिया के योजनाबद्ध + टी पंजाब और यूसीबी से ली गई कोशिकाओं CD19 विशिष्ट कार + टी कोशिकाओं एस.बी. व्युत्पन्न supercoiled प्लास्मिड डीएनए और बाद सह संस्कृति के विद्युत हस्तांतरण द्वारा उत्पन्न किया गया K562 व्युत्पन्न उपस्थिति ओ में aAPC (# क्लोन 4)च पुनः संयोजक मानव घुलनशील आईएल 2 और IL-21. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

टी सेल के स्रोत Transposon * Transposase टी सेल जलसेक आईआरबी # NIH-OBA # इंडस्ट्रीज़ #
ऑटोलॉगस (मरीज व्युत्पन्न) CD19RCD28 SB11 ऑटोलॉगस hematopoietic स्टेम सेल प्रत्यारोपण के बाद 2007-0635 0804-922 14193
Allogeneic (दाता व्युत्पन्न) CD19RCD28 SB11 Allogeneic hematopoietic स्टेम सेल प्रत्यारोपण के बाद 2009-0525 0910-1003
Allogeneic (दाता व्युत्पन्न) CD19RCD28 SB11 Allogeneic गर्भनाल रक्त प्रत्यारोपण के बाद 2010-0835 1001-1022 14739

* तालिका 1. एफडीए की MDACC पर तत्वावधान में क्लीनिकल परीक्षणों CD19 विशेष कार को बढ़ावा + टी कोशिकाओं aAPC पर प्रचारित किया गया. टी कोशिकाओं CD19 के लिए विशिष्ट एस.बी. transposon एक 2 एन डी पीढ़ी कार के लिए कोडिंग के लागू अभिव्यक्ति, CD19RCD28 नामित, CD28 और CD3 ε के माध्यम से संकेतों कि के माध्यम से गाया जाता है. ** परीक्षण संदर्भ 5 में वर्णित है.

Discussion

जीन थेरेपी के लिए Transposon और piggyBac 12,19 और एस.बी. 18,20-22 से जैसे Transposase प्रणाली, गैर वायरल दृष्टिकोण है कि नैदानिक ​​ग्रेड कार के पारगमन वायरल मध्यस्थता + टी कोशिकाओं को एक वैकल्पिक रहे हैं. एस.बी. जीन स्थानांतरण मानव जीन 1,6,23 चिकित्सा के लिए अपनी क्षमता पर आधारित प्रणाली के रूप में चुना गया था. हम एस.बी. (एक कार पेश करने के लिए) स्थानांतरण और γ विकिरणित aAPC के पुनरावर्ती (आनुवंशिक रूप से संशोधित टी कोशिकाओं को प्राप्त stably एक कार व्यक्त) के अनुपालन में TAA विशेष टी कोशिकाओं के निर्माण में प्रौद्योगिकी मंच के रूप में सेवा की दोहरी प्रौद्योगिकी विकसित चरण मैं / द्वितीय परीक्षणों के लिए cGMP (चित्रा 4) के साथ. सह संस्कृति के 28 (चार 7 दिन उत्तेजना चक्र) γ विकिरणित aAPC दिनों के बाद, हम आम तौर पर कम से कम 10 10 आनुवंशिक रूप से संशोधित टी कोशिकाओं मानव अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त उत्पन्न करने में सक्षम हैं. के रूप में की जरूरत है, अतिरिक्त उत्तेजना चक्र किया जा सकता हैओ आनुवंशिक रूप से संशोधित टी कोशिकाओं की बड़ी संख्या उत्पन्न करते हैं. इसके अलावा, अगर कम + कार टी कोशिकाओं की जरूरत है, electroporation और प्रसार करने के लिए दृष्टिकोण बढ़ाया जा वापस कम cuvettes रोजगार और आगे प्रत्येक की शुरुआत में सिर्फ संख्यानुसार aAPC पर प्रसार के बाद के दौर के लिए का विस्तार टी कोशिकाओं की एक उप सेट ले जाने के कर सकते हैं उत्तेजना चक्र. के बहुमत electroporated और टी कोशिकाओं stably कार व्यक्त जलसेक के लिए काटा प्रचारित. CD4 के परिणाम + और ​​CD8 + टी हमारे 2 एन डी पीढ़ी कार व्यक्त कोशिकाओं एक phenotype / स्मृति अनुभवहीन के साथ कोशिकाओं में शामिल हैं और प्रदर्शन पुनः निर्देशित विशिष्टता की तीन पहचान. सबसे पहले, आनुवंशिक रूप से संशोधित टी कोशिकाओं को विशेष रूप से CD19 + लक्ष्य lyse, दूसरी बात, CD19 + उत्तेजक औधधि कोशिकाओं के जवाब में IFN-γ उत्पादन और तीसरे, CD19 के लिए प्रतिक्रिया में पैदा + फीडर कोशिकाओं, एक कार निर्भर 13,18 तरीके में. हमारे integr के लिए दृष्टिकोणविद्युत एस.बी. प्रणाली से गैर वायरल डीएनए plasmids के हस्तांतरण से एक कार transgene खाया मौन प्राथमिक टी पंजाब और यूसीबी से ली गई कोशिकाओं में किया जा सकता है. हम और दूसरों आनुवंशिक K562 कोशिकाओं को संशोधित किया है सेवा के रूप में aAPC कुशलतापूर्वक जलसेक 24,25 के लिए टी कोशिकाओं की चिकित्सकीय पर्याप्त संख्या का प्रचार. aAPC और टिशू कल्चर वातावरण (आईएल-21 के अलावा जैसे) किया गया है उत्पन्न करने के लिए किया गया है संशोधित रोगी और CD19 विशिष्ट जलसेक के लिए hematopoietic स्टेम सेल प्रत्यारोपण के बाद टी कोशिकाओं (1 टेबल) 13,18 दाता व्युत्पन्न. हम कार का उत्पादन PB से टी कोशिकाओं + बस venipuncture द्वारा प्राप्त कर सकते हैं जो लागत, बेचैनी, और PB से apheresis द्वारा बहुराष्ट्रीय कंपनी प्राप्त करने की असुविधा से बचा जाता है. कार की एक बड़ी संख्या + बहुराष्ट्रीय कंपनी की छोटी संख्या से टी कोशिकाओं प्राप्त करने की क्षमता विशेष रूप से प्रत्यारोपण allogeneic यूसीबी के बाद टी कोशिकाओं infusing के लिए अपील कर रही है. छोटे आकार और नवजात दाता के नाम न छापने फिर precludesएक बाद में समय बिंदु तक पहुंचने में इस व्यक्ति और harvested बहुराष्ट्रीय कंपनी के केवल सीमित संख्या टी सेल के निर्माण के लिए सामग्री शुरू hematopoiesis साथ हस्तक्षेप से बचने के रूप में उपलब्ध हैं. विनिर्माण प्रक्रिया के लिए इसके अलावा अग्रिम वर्तमान में कर रहे हैं एक उच्च throughput electroporation से निपटने के लिए कम से कम एक पूरी तरह से बंद लहर bioreactor साथ मिलकर डिवाइस शामिल करने के लिए चल रहा है. कुल मिलाकर, एस.बी. और aAPC प्लेटफार्मों CD19 विशिष्ट कार + टी कोशिकाओं है कि आनुवंशिक रूप से संशोधित टी कोशिकाओं है कि cGMP साथ अनुपालन में वैकल्पिक सेल सतह TAAs पहचान कर सकते हैं की बड़ी संख्या उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है उत्पन्न करने के लिए अपील कर रहे हैं.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DNA plasmid expressing GFP (pmaxGFP) Lonza VPA-1002 (kit)
PBS Sigma D8537
CliniMACS PBS-EDTA Miltenyi Biotec 70026
HyQ RPMI-1640 Thermo Scientific SH30096.01
Phenol Free RPMI-1640 Thermo Scientific SH30605.01
Hyclone Fetal Bovine Serum Thermo Scientific SH3007003HI
GlutaMAX (100x) Gibco 3505-061
Ficoll-Paque GE Healthcare Biosciences 17-1440-02
Recombinant human IL-21 PeproTech AF-200-21
Recombinant human IL-2 (Proleukin) Novartis NDC 65483-116-07
Human T cell Kit (Nucleofector Solution) Lonza VPA-1002
CliniMACS CD56 Reagent Miltenyi 70206
FITC-conjugated to mouse mAb specific for human CD3 BD Biosciences 349201
APC-conjugated to mouse mAb specific for human CD4 BD Biosciences 340443
PerCPCy5.5-conjugated to mouse mAb specific for human CD8 BD Biosciences 341051
PE-conjugated to F(ab')2 fragment of goat antibody specific for human Fcγ Invitrogen H10104
Sodium Azide Sigma S2002
Disposables
12-well plate Corning 3513
T-75 cm2 flask Corning 430641
Culture bags Vue Life 290C; 750C
50 ml centrifuge tube BD Biosciences 352098
Equipment
Amaxa Nuceleofector II Lonza AAB-1001
Cellometer Nexcelom Bioscience Cellometer Vision
Sorvall Legend RT Centrifuge Sorvall 75004377
BD FACS Calibur BD Biosciences 342975
Controlled rate freezer Planer Kryo 750
Irradiator CIS bio International IBL-437 C#09433
Expression of Molecules (Endogenous and Introduced)
Cell Line Common Name Cell Type Molecules Expressed
CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 Clone 4 K562 CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP co-expressed with membrane bound IL-15

Complete Culture Media (CCM) (stored at 4 °C for up to 30 days)
HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640
10% FBS
1% GlutaMAX

Flow Cytometry Buffer (stored at 4 °C for up to 30 days)
PBS
2% FBS
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के नैदानिक ​​अनुप्रयोग<em&gt; स्लीपिंग ब्यूटी</em&gt; और कृत्रिम कोशिकाओं को पेश करने के लिए आनुवंशिक रूप से परिधीय और गर्भनाल रक्त से टी कोशिकाओं को संशोधित एंटीजन
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Huls, M. H., Figliola, M. J.,… More

Huls, M. H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., Olivares, S., Kebriaei, P., Shpall, E. J., Champlin, R. E., Singh, H., Cooper, L. J. N. Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood. J. Vis. Exp. (72), e50070, doi:10.3791/50070 (2013).

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