Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

المكورات العنقودية الذهبية النمو باستخدام الهيموجلوبين الإنسان باعتبارها المصدر الحديد

doi: 10.3791/50072 Published: February 7, 2013

Summary

نحن هنا وصف لفحص النمو

Abstract

S. المذهبة هي نوع من البكتيريا المسببة للأمراض التي تتطلب الحديد لتنفيذ وظائف الأيض الحيوية وتسبب المرض. الخزان الأكثر وفرة من الحديد داخل الإنسان هو المضيف الهيم، والذي هو العامل المساعد من الهيموغلوبين. للحصول على الحديد من الهيموجلوبين، S. المكورات يستخدم نظام محكم المعروفة باسم المحدد سطح الحديد التنظيم (ISD) نظام 1. مكونات أول نظام ISD ربط الهيموغلوبين المضيف، ثم استخراج واستيراد الهيم، وأخيرا تحرير الحديد من الهيم في السيتوبلازم البكتيري 2،3. وقد تم تشريح هذا المسار من خلال العديد من الدراسات في المختبر 4-9. علاوة على ذلك، كانت مساهمة نظام ISD للإصابة أظهرت مرارا وتكرارا في نماذج الماوس 8،10-14. إنشاء مساهمة منظومة ISD إلى الهيموغلوبين المستمدة من اقتناء الحديد والنمو وقد ثبت أن تكون أكثر تحديا. معقدة المقايسات النمو باستخدام الهيموجلوبين كمصدر وحيد الحديد بY عدم استقرار الهيموجلوبين المتاحة تجاريا، وتلوث الحديد حرة في المتوسط ​​النمو، وسمية المرتبطة chelators الحديد. هنا نقدم طريقة التي يتغلب هذه القيود. مستعدة عالية الجودة من الهيموغلوبين في الدم الطازجة ويتم تخزينها في النيتروجين السائل. وتستكمل الهيموغلوبين في تنقية الحديد تستنفد المتوسطة محاكاة البيئة الحديد للفقراء التي تواجهها مسببات الأمراض داخل المضيف الفقاريات. عن طريق تجويع S. المكورات من الحديد حرة والمكمل مع نموذج التلاعب الحد الأدنى من الهيموغلوبين نحن لحث على النمو بطريقة تعتمد اعتمادا كليا على القدرة على ربط الهيموغلوبين، واستخراج الهيم، من خلال تمرير الهيم المغلف الخلية البكتيرية وتتحلل الهيم في السيتوبلازم. وسوف يكون هذا الاختبار مفيدا للباحثين تسعى إلى إلقاء الضوء على آليات اكتساب الحديد في hemoglobin-/heme-derived S. المكورات وربما غيرها من مسببات الأمراض البكتيرية.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. تنقية الهيموجلوبين من الدم الطازج

  1. الحصول على الدم البشري الطازج تستكمل مع مضاد للتخثر. إبقاء الدم على الجليد أو عند 4 ° C خلال تنقية.
  2. أجهزة الطرد المركزي في الدم لمدة 20 دقيقة في ز X 1،500. وخلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) تكون في الجزء السفلي من الأنبوب. نضح بعناية طاف و resuspend بيليه بلطف في الجليد الباردة محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ (W / V). تكرار الطرد المركزي ويغسل 3 مرات.
  3. إعادة تعليق بيليه في 1 حجم الجليد الباردة ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 10 (الرقم الهيدروجيني 8.0). وهذا حمل تحلل كرات الدم الحمراء من المقرر أن الضغط التناضحي. إضافة إلى حجم التولوين ~ النهائي 20٪.
  4. احتضان في C ° 4 على المشواة ليلة وضحاها.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 20000 XG المحللة في ل1 ساعة. جمع الكسر حلالة دموية الأوسط مغادرة يمسها التولوين (العائمة في الأعلى) وبيليه. استخدام ماصة طويلة الرقبة لجمع الكسر الأوسط.
  6. تمر عبر فلتر 0،44 ميكرون حقنة. إذا الحل يحتوي على جسيماتلا يمكن أن تنتقل المسألة وعبر المرشح، كرر الخطوة 1.5.
  7. تنقية الهيموجلوبين (خضاب الدم) مع اللوني السائل عالي الأداء (HPLC) العمود تبادل أنيون (فاريان، PL-1000 SAX A 8 ميكرومتر، 150 مم × 4.6 ملم). الطور المتحرك (أ) هو 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.0) والمتنقلة B المرحلة هو 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.0) + 0.5 M كلوريد الصوديوم. يتم تشغيل A٪ -100 0٪ من الانحدار B المذيبات أكثر من 2 دقيقة بمعدل 2،0 تدفق مل / دقيقة. يتم مراقبة شطف يعتمد على امتصاص (λ: 410 نانومتر نانومتر و280). جمع فقط جزء يتميز بلون أحمر فاتح وذروة امتصاص بارزة (الشكل 1).
  8. Dialyze وشطف ضد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بين عشية وضحاها ومن ثم لبضع ساعات مرة أخرى. تعقيم عن طريق تمرير من خلال مرشح ميكرون حقنة 0.22.
  9. لقياس الهيموغلوبين التركيز، وإعداد الحلول القياسية هب تركيزات معروفة في برنامج تلفزيوني. تحديد تركيز الهيموغلوبين من في العينة عن طريق خلط الحلول القياسية (انظر الجدول مع الكواشف لناإد) أو محلول العينة مع كاشف لل2X Drabkin (المحضرة من مسحوق) بنسبة 1:1. على سبيل المثال، مزيج 100 ميكرولتر حل هب مع 100 ميكرولتر كاشف 2X Drabkin في 96-وحات جيدة. احتضان لمدة 15 دقيقة وقياس الامتصاصية في 540 نيوتن متر. رسم منحنى القياسية وتحديد تركيز الهيموغلوبين في العينة. خمسة إلى خمسة عشر ملغ / مل غلة هي نموذجية.
  10. تشغيل ميكروغرام 15-20 تنقية الهيموجلوبين على صفحة SDS 15٪ من نسختين. وصمة عار واحدة من المواد الهلامية، ونقل البروتينات من الهلام إلى آخر غشاء النيتروسليلوز وطخة مناعية لخضاب الدم (الشكل 2).
  11. تجميد وتخزين مليلتر مأخوذة 1 من الهيموغلوبين في النيتروجين السائل.

2. وسائط النمو إعداد الحديد تستنفد

  1. إعداد معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) مرق عن طريق إذابة مسحوق RPMI في الماء، إضافة بيكربونات الصوديوم على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة و1٪ الأحماض cassamino (CA) (W / V). تعقيم عن طريق تمرير من خلال مرشح ميكرون 0.2 و refrig مخزنمتسارع.
  2. إعداد المعادن المنضب RPMI (NRPMI) وذلك بإضافة 7٪ (W / V) Chelex 100 و خلط بين عشية وضحاها على لوحة ضجة. إزالة Chelex 100 من يمر من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر وتخزين مبردة. تكملة وسائل الاعلام مع المعادن غير الحديدية الأساسية: 25 ميكرومتر ZnCl 2 و 25 ميكرومتر MnCl 100 ملم CaCl 2 و 1 مم MgCl 2 التي أعدت مسبقا ومحلول معقم X 1،000. استخدام الحاويات البلاستيكية لهذه الخطوة لتجنب تلوث الحديد من إعادة استخدامها الإمدادات.

3. النمو المكورات العنقودية الذهبية باستخدام الهيموجلوبين كمصدر وحيد للحديد

  1. خط S. لعزل المكورات على أجار الصويا تريبسيني (TSA) من الأسهم المجمدة. احتضان في C ° 37 للفترة 20-24 ساعة.
  2. إعادة تعليق الإيثيلنديامين-N، N'-مكررا (2-hydroxyphenylacetic حمض) (EDDHA) في الإيثانول اللامائي الى 100 ملم. EDDHA لا يذهب إلى حل ولكن يتم تعقيم بواسطة الايثانول.
  3. إضافة إلى EDDHA RPMI إلى تركيز النهائي من 0.5 مم. السماحEDDHA حل ما لا يقل عن 30 دقيقة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. بسبب دفعة إلى دفعة الاختلاف، قد النهائي EDDHA تحتاج إلى تركيز خفضت إلى 0.25 ملم للسماح نمو البكتيريا.
  4. تطعيم واحدة من المستعمرات S. المكورات في 5 مل من RPMI تحتوي على أنابيب EDDHA في 15 مل المسمار غطاء مخروطي. احتضان في C ° 37 مع اهتزاز عند 180 التناوب في الدقيقة (RPM) ل16-20 ساعة.
  5. أجهزة الطرد المركزي ليلة وضحاها الثقافات لمدة 5 دقائق في 7500 XG و resuspend بيليه في NRPMI المحتوي على 0.5 ملي EDDHA. تطبيع OD 600 إلى ~ 3.
  6. إعداد NRPMI تحتوي على 2.5 ميكروغرام لكل مل الهيموغلوبين و0،1-1،0 ملم EDDHA. بسبب الاختلاف بين دفعات، قد EDDHA تركيز الحديد المطلوب لكلاب الحرة في NRPMI تختلف.
  7. ثقافة فرعية 10 ميكرولتر من التعليق البكتيرية من الخطوة 3.5 في 1 مل + هب + NRPMI EDDHA في أنبوب 15 مل المسمار غطاء مخروطي.
  8. احتضان الثقافات في C ° 37 لمدة تصل إلى 48 ساعة مع اهتزاز عند 180 دورة في الدقيقة أو على طبلة المتداول.
  9. 600 قراءات عن طريق إزالة 50 ميكرولتر من الثقافة وخلطها مع 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في 96 لوحات جيدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لدينا تنقية الهيموجلوبين الإنسان من حلالة دموية مع HPLC (البروتوكول خطوة 1.7). ويظهر الشكل 1 سجلت الامتصاصية من شطافة في موجات نانومتر 280 و 410. كان جزء 5 جمعها والتخلص منها وكسور أخرى. عادة يتم الحصول على غلة 5-15 ملليغرام من الهيموغلوبين في الملليمتر الواحد من شطافة. تم تحليل الهيموجلوبين تنقيته بواسطة SDS-PAGE في مكررة كانت ملطخة وإما لبروتينات المواد الهلامية أو نقلها إلى النيتروسليلوز وimmunoblotted (البروتوكول خطوة 1.10، الشكل 2).

لقد قمنا بتقييم قدرة الهيموجلوبين تنقية الإنسان لدعم نمو نوع S. البرية والمكورات S. المكورات التي تفتقر إلى عنصر البنك الإسلامي للتنمية للنظام ISD (Δ البنك الإسلامي للتنمية). البنك الإسلامي للتنمية هو مستقبلات الهيموغلوبين ما هو مطلوب لخضاب الدم المستمدة من اكتساب الحديد 12. كانت تزرع نوع البرية والبنك الإسلامي للتنمية في Δ الحديد المنضب المتوسطة تستكمل مع hemog الإنسان lobin (NRPMI + + EDDHA الهيموغلوبين) كما هو موضح في القسم 3 من البروتوكول. عندما نمت في + + هب NRPMI EDDHA، ولكن ليس النوع البري Δ البنك الإسلامي للتنمية قادرة على التكاثر كما يدل على ذلك زيادة في الكثافة الضوئية للالثقافات على مر الزمن (الشكل 3A). في المقابل، فإن القدرة على الاستفادة من الحديد مجانا تستكمل (+ FeCl 3) مطابق في نوع البرية والبنك الإسلامي للتنمية Δ (الشكل 3B). لا النوع البري ولا تتكاثر Δ البنك الإسلامي للتنمية في حالة عدم وجود مصدر الحديد (الشكل 3B).

لقد قارنا نمو S. المكورات في NRPMI + EDDHA تستكمل مع الهيموجلوبين تنقيته من الدم الطازج أو الهيموجلوبين مجفف بالتجميد. الشكل 4 يوضح أنه في حين أن الهيموجلوبين في الدم المنقى من البنك الإسلامي للتنمية يتطلب للنمو، مجفف بالتجميد الهيموغلوبين تمكن انتشار البنك الإسلامي للتنمية Δ.

s/ftp_upload/50072/50072fig1.jpg "/>
الشكل 1. تم رصد استيعاب الكسور شطف خلال تنقية الهيموجلوبين. الامتصاص عند 410 نانومتر (محددة لالهيم ملزم البروتينات) و 280 نانومتر (مميزة لجميع البروتينات) في جميع أنحاء شطف. عدد الخمس الواردة جزء الهيموجلوبين وجمعها و.

الشكل 2
الشكل 2. تنقية الهيموجلوبين الإنسان والعشرون ميكروغرام من الهيموغلوبين تنقية فصلت باستخدام يبدل طبيعة 15٪ SDS-PAGE. A. جل ملطخة للبروتينات مع بيو راد البروتين مقايسة كاشف صباغة. immunoblotted B. غشاء نيتروسيلولوز لالهيموغلوبين. الفرقة أقل كثافة ومونومر الهيموغلوبين، في حين أن العصابات أكثر خافت العليا هي dimers الهيموجلوبين وtertramers، التي لم تحصل على التشويه والتحريف تماما.

/ ftp_upload/50072/50072fig3.jpg "/>
الشكل 3. استخدام الهيموجلوبين الإنسان كمصدر للحديد من قبل S. المكورات A. نمو نوع البرية (WT) أو إسوية الجينات مستقبلات الهيموغلوبين الطافرة البنك الإسلامي للتنميةالبنك الإسلامي للتنمية) في NRPMI تستكمل مع الحديد والهيموجلوبين خالب EDDHA الإنسان يختلف إحصائيا على النحو الذي يحدده اختبار الطالب ر ثنائي الطرف، p <0.05. B. النمو في NRPMI تستكمل مع 10 ميكرومتر كلوريد الحديد (+ FeCl 3) أو EDDHA (-FeCl 3) لا يختلف بين البنك الإسلامي للتنمية ووزن Δ. الرسوم البيانية تصور البيانات من التجربة التمثيلية، التي ضمت ثلاثة البيولوجية مكررات. أشرطة الخطأ دلالة الانحراف المعياري القراءات الكثافة الضوئية عند نقاط الوقت المشار إليه بين مكررات.

الشكل 4
الشكل 4. نمو نوع البرية (WT) أو إسوية الجينات مستقبلات م الهيموغلوبينutant (Δ البنك الإسلامي للتنمية) في وسائل الإعلام تستكمل مع الهيموجلوبين تنقيته من الدم الطازج أو الهيموجلوبين مجفف بالتجميد. يصور الرسم البياني البيانات من التجربة التمثيلية، التي ضمت ثلاثة البيولوجية مكررات. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري القراءات الكثافة الضوئية عند نقاط الوقت المشار إليه بين مكررات. العلامات النجمية تدل القيم التي تختلف إحصائيا على النحو الذي يحدده اختبار الطالب ر ثنائي الطرف، p <0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الحديد من المغذيات الأساسية اللازمة للكائنات من جميع ممالك الحياة 15. في الفقاريات، وعزلها الحديد لتجنب السمية الناجمة عن هذا العنصر. هذا تنحية يخفي أيضا من غزو الميكروبات الحديد في عملية تعرف باسم الحصانة الغذائية 16. وردا على ذلك تطورت مسببات الأمراض الاستراتيجيات التي تحايل على الحصانة الغذائية. إحدى هذه الآليات تعتمد على الهيموجلوبين، والذي هو المصدر الأكثر وفرة من الحديد داخل المضيف 17. ويرد الهيموجلوبين داخل خلايا الدم الحمراء. لا بد من الافراج الهيموجلوبين خلايا الدم الحمراء التالفة من هابتوغلوبين المضيف، مما يشير إلى الإزالة السريعة للهابتوغلوبين-الهيموجلوبين المجمعات من قبل الضامة 18. من أجل الوصول إلى الهيموغلوبين، S. المكورات عن hemolysins أن ليز خلايا الدم الحمراء 19. ويقابل هابتوغلوبين الناجم عن إزالة الهيموغلوبين بواسطة ملزمة تقارب عالية من الهيموغلوبين من قبل مستقبلات سطح الخلية التي أعربت عنها 20.

وقد أظهرت العديد من الدراسات أن مساهمة منظومة ISD للإصابة 8،10-14. علاوة على ذلك، فقد أعطت الدراسات البيوكيميائية وظائف مكوناته الفردية في الهيموغلوبين المستمدة من اقتناء الحديد 4-9. نحن هنا وصف مقايسة التي تراقب نمو S. المكورات مع الهيموجلوبين كمصدر وحيد للحديد المتاحة. في هذا الصدد، ونحن بحاجة إلى الإشارة إلى بعض الشروط التي تقوم بدور محوري لنجاح التجربة.

يمكن نوعية ونوع الكواشف المستخدمة في المقايسات الهيموجلوبين المستمدة من الحديد نمو اكتساب تأثيرا جوهريا في النتائج obtaiNED في هذه المقايسات. وعلى النقيض من الهيموغلوبين جديدة تم الحصول عليها من الهيموغلوبين، والدم التي يتم تخزينها في شكل مجفف بالتجميد يسمح نمو البكتيريا مستقلة عن مكونات نظام ISD (الشكل 4) 21. هذا هو الأرجح بسبب التغييرات في بنية الهيموغلوبين التي يسببها lyophylization. على وجه التحديد، مجفف بالتجميد الهيموغلوبين يحتوي tetramers، dimers، ومونومرات من الهيموجلوبين، وكذلك الهيم في 22 شكلها الحرة. تنقية الهيموجلوبين من الدم الطازج والحفاظ عليها في النيتروجين السائل ضمان سلامة البروتين 22. وقد يسر أبحاثا واسعة حول الهيموغلوبين وضع بروتوكولات لتنقية عالية الجودة من الهيموغلوبين في الدم الطازج أو في شكل المؤتلف، والتي يمكن استخدامها في فحص لدينا 23-25.

قد اختيار خالب الحديد يؤثر على نمو الفحص. على سبيل المثال، 2،2-dipyridyl، والذي يستخدم في كثير من الأحيان على أنها خالب الحديد وسامالخلايا البكتيرية إلى 26. هذه الآثار اثنين تجعل من الصعب أن نجزم إذا كان تثبيط نمو البكتيريا بواسطة dipyridyl-2،2 يرجع إلى عملية إزالة معدن ثقيل من الحديد أو سمية. بالإضافة إلى ذلك، 2،2-dipyridyl من المرجح أن يكون غشاء منفذة، وبالتالي تخترق الخلية البكتيرية ويخلب الحديد داخل خلوي 27. لقد وجدنا أن يتم عكس تثبيط النمو EDDHA من مكملات الحديد من مصدر، مما يجعل EDDHA وخالب الحديد أكثر ملاءمة لنمو البكتيريا المقايسات. ومع ذلك، قد تركز EDDHA التي تحتاج إلى أن تضاف إلى متوسطة النمو تختلف. هذا ومن المقرر أن اختلاف قوة EDDHA ومحتوى الحديد المتوسطة النمو من دفعة لدفعة واحدة. يمكن تطبيع النشاط شيلاتينغ الحديد بين EDDHA دفعات من خلال إزالة الحديد كيميائيا المتبقية 28. ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى التباين بين دفعات من RPMI، وجدنا أن تركيز EDDHA النهائي قد لا تزال بحاجة إلى تعديل للسماح النمو في وجود مصدر الحديد. وجدنا العلى أعلى تركيز EDDHA هذا هو متساهل للنمو من نوع S. البرية المكورات في وجود الهيموجلوبين هو الأمثل لهذه التجربة.

ويمكن إجراء تعديلات على بروتوكول الحالي إلى أكثر شبها البيئة التي تواجهها البكتيريا خلال العدوى. على سبيل المثال، في المضيف، لا بد بسرعة الهيم التي يتم تحريرها من قبل هيموبيكسين الهيموغلوبين. لا يمكن أن تستخدم هيموبيكسين كمصدر الحديد بنسبة S. المكورات، وبالتالي منع إضافته اقتناء الهيم أفرج عنه من خلال الهيموجلوبين الحضانة مع S. المكورات 12.

نشعر التي يمكن أن تستخدم هذا الاختبار للبحث في اقتناء المعدن من جانب مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض البكتيرية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لقياس اكتساب الحديد من الهيموجلوبين غير مصادر الحديد الموجودة داخل المضيف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث من قبل الولايات المتحدة المنح العامة للخدمات الصحية وAI69233 AI073843 من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية. EPS هو زميل ويلكوم بوروز في التسبب في الأمراض المعدية. وقد تم تمويل KPH من قبل الأحياء الدقيقة الجزيئية الخلوية والتدريب منحة البرنامج 5 T32 A107611-10.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC anion exchange column Varian PL1551-3802
Drabkin's reagent Sigma D5941-6VL
Hemoglobin standard Pointe Scientific H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 sodium form Sigma C7901
EDDHA LGC Standards GmbH ANC 001
Hemoglobin a antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc SC-21005
Tryptic soy agar BD 236920

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
  2. Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
  3. Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
  4. Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
  5. Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
  6. Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
  7. Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
  8. Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
  9. Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
  10. Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
  11. Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
  12. Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
  13. Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
  14. Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
  15. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  16. Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
  17. Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
  18. Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
  19. Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
  20. Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. (2011).
  21. Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
  22. Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).
  23. Williams, R. C. Jr, Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
  24. Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
  25. Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
  26. Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
  27. Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
  28. Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).
<em>المكورات العنقودية الذهبية</em> النمو باستخدام الهيموجلوبين الإنسان باعتبارها المصدر الحديد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pishchany, G., Haley, K. P., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source. J. Vis. Exp. (72), e50072, doi:10.3791/50072 (2013).More

Pishchany, G., Haley, K. P., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source. J. Vis. Exp. (72), e50072, doi:10.3791/50072 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter