Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Staphylococcus aureus Vækst med humant hæmoglobin som en jernkilde

doi: 10.3791/50072 Published: February 7, 2013

Summary

Her beskriver vi en vækst assay for

Abstract

S. aureus er en patogen bakterie, der kræver jern for at udføre vitale metaboliske funktioner og forårsage sygdom. Den mest rigelige reservoir af jern inden i den humane vært, er hæm, som er cofaktoren for hæmoglobin. At erhverve jern fra hæmoglobin, S. aureus anvender et omfattende system kendt som jernreguleret overflade determinant (ISD) system 1. Komponenter i Isd system først binder vært hæmoglobin, derefter udtrække og importere hæm, og endelig frigøre jern fra hæm i den bakterielle cytoplasma 2,3. Denne vej er blevet dissekeret gennem talrige in vitro-studier 4-9. Endvidere har bidrag Isd system til infektion gentagne gange blevet påvist i musemodeller 8,10-14. Etablering af bidrag Isd system til hæmoglobin-afledt jern erhvervelse og vækst har vist sig at være mere udfordrende. Vækstassays med hæmoglobin som eneste jernkilde er komplicerede by ustabiliteten af ​​kommercielt tilgængelige hæmoglobin, kontaminerende frit jern i vækstmediet, og toksiciteten forbundet med jernchelatorer. Her præsenterer vi en metode, der overvinder disse begrænsninger. Højkvalitets hæmoglobin fremstilles ud fra frisk blod og lagres i flydende nitrogen. Renset hæmoglobin er suppleret ind i jern-nedbryder medium efterligne jern-fattige miljø stødt af patogener inde i hvirveldyr vært. Ved at udsulte S. aureus af frit jern og udvides med et minimalt manipuleret form for hæmoglobin vi inducere vækst på en måde, der er helt afhængig af evnen til at binde hæmoglobin, ekstrakt hæm, passerer hæm gennem den bakterielle cellekappe og nedbrydes hem i cytoplasmaet. Denne analyse vil være nyttig for forskere, der søger at belyse mekanismerne i hemoglobin-/heme-derived jern opkøb i S. aureus og muligvis andre bakterielle patogener.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Oprensning af hæmoglobin fra frisk blod

  1. Erhverve frisk humant blod tilsat en antikoagulant. Holde blodet på is eller ved 4 ° C under hele oprensningen.
  2. Centrifugeres blodet i 20 min ved 1.500 x g.. De røde blodlegemer (RBC) vil være i bunden af ​​røret. Forsigtigt sug supernatanten og forsigtigt pellet resuspenderes i iskold 0,9% (vægt / volumen) NaCI-opløsning. Der centrifugeres og vaskes 3 gange.
  3. Pellet resuspenderes i 1 volumen iskold 10 mM Tris-HCI (pH 8,0). Dette vil inducere lysis af de røde blodlegemer på grund af osmotisk tryk. Læg toluen til ~ 20% slutvolumen.
  4. Inkuber ved 4 ° C på en roterende natten over.
  5. Centrifuger lysatet ved 20.000 x g i 1 time. Saml den midterste hæmolysat fraktion forlader toluen (flydende på toppen) og pellet uberørt. Brug en lang hals pipette til at indsamle den midterste fraktion.
  6. Passere gennem 0,44 um sprøjte filter. Hvis opløsningen indeholder partiklerstof og ikke kan føres gennem filteret, gentages trin 1.5.
  7. Der renses hæmoglobin (Hb) med en højtydende væskekromatografi (HPLC) anionbyttersøjle (Varian, PL-SAX 1000 A 8 um, 150 mm x 4,6 mm). Den mobile fase A er 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) og mobil fase B er 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. En 0% -100% gradient af opløsningsmiddel B køres løbet af 2 minutter ved 2,0 ml / min strømningshastighed. Elueringen overvåges baseret på absorption (λ: 410 nm og 280 nm). Saml kun den brøkdel kendetegnet ved en klar rød farve og en fremtrædende absorptionstop (Figur 1).
  8. Dialysere eluering mod phosphatpufret saltvand (PBS) natten over og derefter i et par timer igen. Steriliseres ved passage gennem et 0,22 um sprøjtefilter.
  9. For at måle Hb koncentration, forberede standard Hb med kendte koncentrationer i PBS. Bestem koncentrationen af ​​Hb i prøven ved at blande de standardopløsninger (se tabellen med reagenser osed) eller prøveopløsningen med 2x Drabkin reagens (fremstillet ud fra pulver) i forholdet 1:1. For eksempel blande 100 pi Hb-opløsning med 100 pi 2 x Drabkin reagens i plader med 96 brønde. Inkuber i 15 minutter og mål absorbansen ved 540 nm. Plotte en standardkurve og bestemme Hb koncentrationen i prøven. Fem til femten mg / ml udbytter er typiske.
  10. Kør 15 til 20 ug oprenset hæmoglobin på en 15% SDS-PAGE in duplo. Stain en af gelerne, overføre proteinerne fra en anden gel på en nitrocellulosemembran og immunoblot for hæmoglobin (fig. 2).
  11. Nedfrysning og opbevaring 1 ml prøver af hæmoglobin i flydende nitrogen.

2. Fremstilling af jern-nedbryder vækstmedier

  1. Forbered Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium ved at opløse RPMI pulveret i vand, tilsættes natriumhydrogencarbonat som anbefalet af fabrikanten og 1% cassamino syrer (CA) (vægt / volumen). Steriliseres ved passage gennem et 0,2 um filter og opbevar refrigaccelereret.
  2. Fremstille metal-depleteret RPMI (NRPMI) ved tilsætning af 7% (w / v) Chelex 100 og blandes natten over på en omrøringsplade. Fjern Chelex 100 ved passage gennem et 0,2 um filter og opbevares nedkølet. Suppler medier med væsentlige ikke-jernholdige metaller: 25 uM ZnCl 2, 25 pM MnCl 2, 100 mM CaCl 2 og 1 mM MgCl 2 fremstillet i forvejen som en steril 1.000 x løsning. Brug engangs plastbeholdere til dette trin for at undgå jern forurening fra genanvendelige forsyninger.

3. Staphylococcus aureus Vækst ved hjælp Hæmoglobin som eneste jernkilde

  1. Streak S. aureus til isolering på tryptisk soja-agar (TSA) fra en frossen bestand. Inkuber ved 37 ° C i 20-24 timer.
  2. Resuspender ethylendiamin-N, N'-bis (2-hydroxyphenyleddikesyre) (EDDHA) i vandfri ethanol til 100 mM. EDDHA går ikke i opløsning, men steriliseres ved ethanol.
  3. Læg EDDHA til RPMI til en slutkoncentration på 0,5 mM. TilladEDDHA at opløse i mindst 30 minutter før man går videre til det næste trin. På grund af batch-til-batch-variation kan endelig EDDHA koncentration skal sænkes til 0,25 mM for at muliggøre bakteriel vækst.
  4. Inokulere enkelte kolonier af S. aureus i 5 ml RPMI indeholdende EDDHA i 15 ml skruelåg koniske rør. Inkuber ved 37 ° C med rystning ved 180 omdrejninger i minuttet (rpm) i 16-20 timer.
  5. Centrifuger overnatskulturer i 5 minutter ved 7500 x g, og pellet resuspenderes i NRPMI indeholdende 0,5 mM EDDHA. Normalisere OD600 på ~ 3.
  6. Forbered NRPMI indeholdende 2,5 ug per ml Hb og 0,1-1,0 mM EDDHA. På grund af variation mellem partier, kan det EDDHA koncentration, der kræves for at chelatere frit jern i NRPMI variere.
  7. Subkultur 10 pi bakteriesuspension fra trin 3,5 i 1 ml NRPMI + EDDHA + Hb i et 15 ml skruelåg konisk rør.
  8. Inkuberes kulturerne ved 37 ° C i op til 48 timer under omrystning ved 180 rpm eller på en rullende tromle.
  9. 600 aflæsninger ved at fjerne 50 ul af kulturen og blande det med 150 pi PBS i 96-brønds plader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi har renset humant hæmoglobin fra hæmolysat med HPLC (protokol trin 1.7). Figur 1 viser optagede absorbansen af eluatet ved 280 og 410 nm bølgelængder. Fraktion 5 blev opsamlet og andre fraktioner blev bortkastet. Udbytter af 5-15 mg hæmoglobin pr milliliter af eluatet typisk opnået. Oprenset hæmoglobin blev analyseret ved SDS-PAGE in duplo, og gelerne blev enten farvet for proteiner eller overført til nitrocellulose og immunblottet (protokol trin 1,10, figur 2).

Vi har vurderet evnen af oprenset humant hæmoglobin til at understøtte væksten af vildtype S. aureus og S. aureus, der mangler ISDB komponent i Isd systemet (Δ ISDB). ISDB er en hæmoglobin-receptor, der kræves for hæmoglobin-afledt jern købet 12. Vildtype og Δ ISDB blev dyrket i jern-depleteret medium suppleret med human hemog lobin (NRPMI + EDDHA + Hb) som beskrevet i afsnit 3 i protokollen. Når den dyrkes i NRPMI + EDDHA + Hb, vildtype, men ikke Δ ISDB er i stand til at proliferere som indikeret ved en forøgelse i optisk densitet af kulturer over tid (figur 3A). I modsætning hertil er den evne til at udnytte suppleret frit jern (+ FeCl3) identisk med vildtype og Δ ISDB (figur 3B). Hverken vildtype eller Δ ISDB proliferere i fravær af en jernkilde (figur 3B).

Vi har sammenlignet væksten af S. aureus i NRPMI + EDDHA suppleret med hæmoglobin oprenset fra frisk blod eller lyofiliseret hæmoglobin. Figur 4 viser, at mens hæmoglobin oprenset fra blodet kræver ISDB for vækst, lyofiliseret hæmoglobin muliggør proliferation af Δ ISDB.

s/ftp_upload/50072/50072fig1.jpg "/>
Figur 1. Absorption af elueringsfraktionerne under hæmoglobin oprensning. Absorption ved 410 nm (specifikt for hæm-bindende proteiner) og 280 nm (karakteristisk for alle proteiner) blev overvåget under hele elueringen. Fraktion nummer fem indeholdt hæmoglobin og blev opsamlet.

Figur 2
Figur 2. Oprenset humant hæmoglobin Tyve mikrogram oprenset hæmoglobin blev separeret ved hjælp af denaturerende 15% SDS-PAGE. A. gelen farvet for proteiner med Bio-Rad protein assay dye reagens. B. En nitrocellulosemembran immunoblottet for hæmoglobin. Den intense nederste bånd er en hæmoglobin monomer, mens de mere svage øvre bånd er hæmoglobin dimerer og tertramers, som ikke får fuldstændig denatureret.

/ Ftp_upload/50072/50072fig3.jpg "/>
Figur 3. Anvendelse af humant hæmoglobin som en jernkilde af S. aureus A. Vækst af vildtype (wt) eller isogene hæmoglobin receptor ISDB mutant (Δ ISDB) i NRPMI suppleret med jern-chelator EDDHA og humant hæmoglobin er statistisk forskellige som bestemt ved Students two-tailed t test, p <0,05. B. Vækst i NRPMI suppleret med 10 pM jernchlorid (+ FeCl3) eller EDDHA (-FeCl3) er ikke forskellig mellem vægt og Δ ISDB. Grafer afbilder data fra et repræsentativt forsøg, der omfattede tre biologiske replikater. Fejlbjælker angiver standardafvigelsen for optiske densitetsaflæsninger ved angivne tidspunkter mellem replikater.

Figur 4
Figur 4. Vækst af vildtype (wt) eller isogene hæmoglobin receptor mutant (Δ ISDB) i medium suppleret med hæmoglobin oprenset fra frisk blod eller lyofiliseret hæmoglobin. Grafen viser data fra et repræsentativt forsøg, som omfattede tre biologiske replikater. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen af ​​optiske densitetsaflæsninger ved angivne tidspunkter mellem replikater. Asterisker angiver værdier, som er statistisk forskellige som bestemt ved Students two-tailed t test, p <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Jern er et vigtigt næringsstof kræves af organismer fra alle riger af livet 15. I hvirveldyr, er jern sekvestreret at undgå toksicitet forårsaget af dette element. Denne beslaglæggelse også skjuler jern fra invaderende mikrober i en proces kendt som ernæringsmæssig immunitet 16. Som reaktion herpå har patogener udviklet strategier, der omgår ernæringsmæssig immunitet. Én sådan mekanisme er baseret på hæmoglobin, der er den mest rigeligt forekommende kilde til jern i værten 17. Hæmoglobin indeholdt i de røde blodlegemer. Hæmoglobin frigjort fra beskadigede røde blodlegemer er bundet af værten haptoglobin, som signalerer hurtig fjernelse af haptoglobin-hæmoglobin-komplekser af makrofager 18. For at få adgang til hæmoglobin, S. aureus udtrykker hæmolysiner, som lyserer røde blodlegemer 19. Haptoglobin-induceret hæmoglobin fjernelse imødegås ved højaffinitetsbinding af hæmoglobin fra de celleoverfladereceptorer udtrykkes af 20.

Talrige undersøgelser har vist bidrag Isd system til infektion 8,10-14. Endvidere har biokemiske undersøgelser tildelt funktionerne af de enkelte komponenter i hæmoglobin-afledt jern erhvervelse 4-9. Her beskriver vi et assay, der overvåger væksten af S. aureus med hæmoglobin som den eneste kilde til tilgængelig jern. I den forbindelse er vi nødt til at påpege visse betingelser, der er afgørende for en vellykket gennemførelse af forsøget.

Kvaliteten og typen af ​​reagenser anvendt i hæmoglobin-afledte jern erhvervelse vækstassays kan dramatisk påvirke resultaterne obtaineret i disse assays. I modsætning til hæmoglobin opnået fra frisk blod, hæmoglobin, der er lagret i lyofiliseret form giver bakterievækst uafhængigt af komponenterne i Isd systemet (figur 4) 21. Dette skyldes sandsynligvis ændringer i strukturen af ​​hæmoglobin, der er induceret af lyophylization. Specifikt lyofiliseret hæmoglobin indeholder tetramerer, dimerer og monomerer af hæmoglobin, samt hæm i sin frie form 22. Oprensning af hæmoglobin fra frisk blod og dets opbevaring i flydende nitrogen sikre integriteten af proteinet 22. Omfattende forskning på hæmoglobin har lettet udviklingen af protokoller for oprensning af høj kvalitet hæmoglobin fra frisk blod eller i rekombinant form, som kan anvendes i vores assay 23-25.

Valget af jernchelator kan påvirke væksten assay. For eksempel er 2,2-dipyridyl, som ofte anvendes som en jern-chelator, giftigttil bakterieceller 26. Disse to virkninger gør det svært at skelne, om inhibering af bakterievækst ved 2,2-dipyridyl skyldes jernkelations eller toksicitet. Desuden 2,2-dipyridyl sandsynligvis er membran permeabel, og således trænger ind i bakteriecellen og chelater jern intracellulært 27. Det har vist sig, at vækstinhibering af EDDHA reverseres ved tilskud af en jernkilde, hvilket gør EDDHA et mere velegnet jernchelator for bakterielle vækstassays. Imidlertid kan koncentrationen af ​​EDDHA, der skal sættes til vækstmediet kan variere. Dette skyldes variation af både EDDHA styrke og vækstmedium jernindhold fra batch til batch. Den jernchelaterende aktivitet kan normaliseres mellem partier af EDDHA ved kemisk fjernelse af resterende jern 28. På grund af variation mellem partier af RPMI, fandt vi, at den endelige EDDHA koncentrationen stadig kan være nødvendigt at justere at tillade vækst i nærvær af en jernkilde. Vi fandt thved den højeste koncentration af EDDHA, der er permissiv for vækst af vildtype S. aureus i nærvær af hæmoglobin er optimal for dette eksperiment.

Ændringer kan foretages til den nuværende protokol til mere ligner miljøet stødt af bakterier under infektion. For eksempel, i værten er hæm, der er frigivet fra hæmoglobin hurtigt bundet af hæmopexin. Hæmopexin kan ikke bruges som en jernkilde af S. aureus, derfor tilsætning ville forhindre erhvervelse af hæm frigivet fra hæmoglobin under inkubation med S. aureus 12.

Vi mener, at dette assay kan anvendes til forskning i metal erhvervelse af en række bakterielle patogener. Desuden kan denne fremgangsmåde anvendes til at måle jern erhvervelse fra ikke-hæmoglobin kilder til jern, der er til stede i værten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af US Public Health Service tilskud AI69233 og AI073843 fra National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme. EPS er et Burroughs Wellcome Fellow i patogenesen af ​​infektionssygdomme. KPH blev finansieret af den Cellulær og Molekylær Mikrobiologi uddannelsespulje 5 T32 A107611-10.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC anion exchange column Varian PL1551-3802
Drabkin's reagent Sigma D5941-6VL
Hemoglobin standard Pointe Scientific H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 sodium form Sigma C7901
EDDHA LGC Standards GmbH ANC 001
Hemoglobin a antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc SC-21005
Tryptic soy agar BD 236920

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
  2. Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
  3. Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
  4. Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
  5. Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
  6. Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
  7. Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
  8. Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
  9. Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
  10. Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
  11. Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
  12. Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
  13. Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
  14. Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
  15. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  16. Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
  17. Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
  18. Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
  19. Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
  20. Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. (2011).
  21. Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
  22. Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).
  23. Williams, R. C. Jr, Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
  24. Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
  25. Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
  26. Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
  27. Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
  28. Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).
<em>Staphylococcus aureus</em> Vækst med humant hæmoglobin som en jernkilde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pishchany, G., Haley, K. P., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source. J. Vis. Exp. (72), e50072, doi:10.3791/50072 (2013).More

Pishchany, G., Haley, K. P., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source. J. Vis. Exp. (72), e50072, doi:10.3791/50072 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter