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Immunology and Infection

Staphylococcus aureus crescita con emoglobina umana come fonte di ferro

doi: 10.3791/50072 Published: February 7, 2013

Summary

Qui si descrive un saggio di crescita per

Abstract

S. aureus è un batterio patogeno che richiede ferro a svolgere funzioni vitali metaboliche e causare la malattia. Il serbatoio più abbondante di ferro all'interno dell'ospite umano è eme, che è il cofattore di emoglobina. Per acquisire ferro da emoglobina, S. aureus utilizza un complesso sistema noto come il ferro regolato determinante superficie (Isd) sistema 1. Componenti della Isd emoglobina legano primo sistema host, quindi estrarre e importare eme, e infine liberare ferro eme nel citoplasma batterico 2,3. Questo percorso è stato sezionato attraverso numerosi studi in vitro 4-9. Inoltre, il contributo del sistema Isd di infezione è stato ripetutamente dimostrato in modelli murini 8,10-14. Stabilire il contributo del sistema Isd all'emoglobina derivato acquisizione di ferro e la crescita ha dimostrato di essere più impegnativo. Saggi di crescita che utilizzano l'emoglobina come fonte unica di ferro sono complicate by dell'instabilità dell'emoglobina commercialmente disponibile, contaminando ferro libero nel terreno di crescita, e la tossicità associata con chelanti del ferro. Qui vi presentiamo un metodo che supera queste limitazioni. Emoglobina alta qualità è preparato da sangue fresco e conservate in azoto liquido. Emoglobina purificata è integrato in ferro riducono medio mimando il ferro-poveri ambiente incontrate dagli agenti patogeni all'interno del ospite vertebrato. Di fame S. aureus di ferro libero e integrando con una forma minimamente manipolato dell'emoglobina ci indurre la crescita in un modo che è interamente dipendente dalla capacità di legare l'emoglobina, estrarre eme, eme passare attraverso la busta cellula batterica e degradare eme nel citoplasma. Questo test sarà utile per i ricercatori che cercano di chiarire i meccanismi di acquisizione ferro hemoglobin-/heme-derived in S. aureus ed eventualmente di altri batteri patogeni.

Protocol

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1. Purificazione di emoglobina da sangue fresco

  1. Acquisire fresco sangue umano integrato con un anticoagulante. Mantenere il sangue sul ghiaccio oppure a 4 ° C per tutta la purificazione.
  2. Centrifugare il sangue per 20 min a 1500 x g. I globuli rossi (RBC) sarà al fondo della provetta. Aspirare accuratamente il supernatante e risospendere il pellet delicatamente in gelata soluzione 0,9% (w / v) NaCl. Ripetere la centrifugazione e lavare 3 volte.
  3. Risospendere il pellet in 1 volume di ghiaccio freddo 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Ciò induce lisi dei globuli rossi a causa della pressione osmotica. Aggiungi toluene a ~ 20% del volume finale.
  4. Incubare a 4 ° C durante la notte su un girarrosto.
  5. Centrifugare il lisato a 20.000 xg per 1 ora. Raccogliere la frazione centrale emolisato lasciando intatto il toluene (galleggiante in alto) e pellet. Utilizzare un lungo collo pipetta per raccogliere la frazione centrale.
  6. Attraversare 0,44 micron filtro siringa. Se la soluzione contiene particellemateria e non può essere passato attraverso il filtro, ripetere il punto 1.5.
  7. Purificare l'emoglobina (Hb) con una ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC), colonna a scambio anionico (Varian, PL-SAX 1000 al 8 pm, 150 mm × 4,6 mm). La fase mobile A è 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) e la fase mobile B è 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. A 0% -100% di pendenza solvente B è gestito oltre 2 min a 2,0 ml / min di portata. L'eluizione viene controllata sulla base di assorbimento (λ: 410 nm e 280 nm). Raccogliere solo la frazione caratterizzato da un colore rosso brillante e un picco di assorbimento di primo piano (Figura 1).
  8. Dializza l'eluizione contro tampone fosfato salino (PBS) per una notte e poi per qualche ora ancora. Sterilizzare passando attraverso un filtro 0,22 micron siringa.
  9. Per misurare la concentrazione di Hb, preparare soluzioni standard di Hb di concentrazioni note in PBS. Determinare la concentrazione di Hb nel campione mescolando le soluzioni standard (vedere la tabella con reagenti noied) o la soluzione campione con il reagente di 2x Drabkin (preparato da polvere) con un rapporto 1:1. Per esempio, miscelare 100 ul di soluzione Hb con 100 pl di reagente 2x Drabkin in piastre da 96 pozzetti. Incubare per 15 min e l'assorbanza misura a 540 nm. Tracciare una curva standard e determinare la concentrazione di emoglobina nel campione. Da cinque a quindici mg / ml rendimenti sono tipici.
  10. Eseguire 15-20 ug dell'emoglobina purificata su un 15% SDS-PAGE in duplicato. Macchia uno dei gel, trasferire le proteine ​​di un'altra gel su una membrana di nitrocellulosa e immunoblot per l'emoglobina (Figura 2).
  11. Congelare e conservare aliquote da 1 ml di emoglobina in azoto liquido.

2. Preparazione di ferro riducono la crescita media

  1. Preparare Roswell Park Memorial Institute (RPMI) brodo sciogliendo la polvere RPMI in acqua, aggiungere bicarbonato di sodio come raccomandato dal produttore e 1% di acidi cassamino (CA) (w / v). Sterilizzare passando attraverso un filtro 0,2 micron e conservare frigoriferorato.
  2. Preparare metallo depleto RPMI (NRPMI) aggiungendo 7% (w / v) Chelex 100 e miscelazione notte su una piastra di agitazione. Rimuovere Chelex 100 passando attraverso un filtro 0,2 micron e conservare in frigorifero. Integrare mezzi essenziali con metalli non ferrosi: 25 ZnCl 2 pM, 25 pM MnCl 2, 100 mM CaCl 2 e 1 mM MgCl 2 preparati in anticipo come soluzione sterile 1000 x. Utilizzare contenitori di plastica usa e getta per questo passo per evitare la contaminazione da ferro riutilizzabili forniture.

3. Staphylococcus aureus Crescita emoglobina utilizzando come fonte di ferro Sole

  1. Streak S. aureus per l'isolamento in Tryptic Soy Agar (TSA) da uno stock congelato. Incubare a 37 ° C per 20-24 ore.
  2. Risospendere etilendiammina-N, N'-bis (2-hydroxyphenylacetic acid) (EDDHA) in etanolo anidro a 100 mM. EDDHA non va in soluzione, ma è sterilizzato da etanolo.
  3. Aggiungi EDDHA per RPMI ad una concentrazione finale di 0,5 mM. ConsentireEDDHA per dissolvere per almeno 30 minuti prima di procedere alla fase successiva. Causa lotto a lotto variazione, concentrazione finale EDDHA può essere necessario abbassare a 0,25 mm per consentire la crescita batterica.
  4. Seminare singole colonie di S. aureus in 5 ml di RPMI contenente EDDHA in 15 ml con tappo a vite tubi conici. Incubare a 37 ° C con agitazione a 180 giri al minuto (rpm) per 16-20 ore.
  5. Centrifugare le culture di notte per 5 min a 7500 xg e risospendere il pellet in NRPMI contenente 0,5 mM EDDHA. Normalizza OD 600 a ~ 3.
  6. Preparare NRPMI contenente 2,5 microgrammi per ml Hb e EDDHA 0,1-1,0 mM. A causa delle variazioni tra i lotti, la concentrazione necessaria per EDDHA chelare ferro libero in NRPMI possono variare.
  7. Subculture 10 ml di sospensione batterica dal punto 3,5 in 1 ml NRPMI EDDHA + + Hb in un ml 15 con tappo a vite tubo conico.
  8. Incubare le colture a 37 ° C per 48 ore con agitazione a 180 rpm o su un tamburo di laminazione.
  9. 600 letture rimuovendo 50 microlitri della cultura e mescolandolo con 150 microlitri di PBS in piastre da 96 pozzetti.

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Representative Results

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Abbiamo purificato emoglobina umana da emolisato con HPLC (Protocollo passo 1.7). Figura 1 mostra registrato assorbanza dell'eluato a 280 e 410 nm lunghezza d'onda. Frazione 5 è stato raccolto e altre frazioni sono state scartate. I rendimenti di 5-15 milligrammi di emoglobina per millilitro di eluato sono in genere acquisiti. Emoglobina purificato è stato analizzato mediante SDS-PAGE in duplicato ed i gel sono stati colorati o per proteine ​​o trasferiti su nitrocellulosa e incubate (Protocollo passo 1,10, Figura 2).

Abbiamo valutato la capacità di purificato emoglobina umana per sostenere la crescita di tipo selvatico S. aureus e S. aureus che manca la componente ISDB del sistema Isd (Δ ISDB). ISDB è un recettore emoglobina che è necessario per l'emoglobina derivata acquisizione ferro 12. Wild type e Δ ISDB sono state coltivate in ferro impoverito media integrato con hemog umana Lobin (EDDHA NRPMI + + Hb), come descritto nella sezione 3 del protocollo. Quando coltivate in NRPMI EDDHA + + Hb, tipo selvatico ma non Δ ISDB è in grado di proliferare come indicato da un aumento della densità ottica delle colture nel tempo (Figura 3A). Al contrario, la capacità di utilizzare integrato libera ferro (+ FeCl 3) è uguale tipo selvatico e Δ ISDB (Figura 3B). Né tipo selvatico né Δ ISDB proliferano in assenza di una fonte di ferro (Figura 3B).

Abbiamo confrontato la crescita di S. aureus in NRPMI + EDDHA supplementato con emoglobina purificate dal sangue fresco o emoglobina liofilizzata. Figura 4 illustra che, mentre l'emoglobina purificato da sangue ISDB necessario per la crescita, l'emoglobina liofilizzata consente proliferazione di Δ ISDB.

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Figura 1. Assorbimento delle frazioni di eluizione durante la purificazione emoglobina. Assorbimento a 410 nm (specifico per eme proteine ​​leganti) e 280 nm (caratteristica di tutte le proteine) è stato monitorato durante la eluizione. Frazione numero cinque contenute emoglobina ed è stato raccolto.

Figura 2
Figura 2. Purificato emoglobina umana Venti microgrammi di emoglobina purificato è stato separato mediante denaturazione 15% SDS-PAGE. A. Gel colorati per proteine ​​con Bio-Rad reagente colorante dosaggio proteine. Membrana di nitrocellulosa B. incubate per l'emoglobina. L'intensa banda inferiore è un monomero emoglobina, mentre le fasce più deboli superiori sono dimeri emoglobina e tertramers, che non hanno ricevuto completamente denaturato.

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Figura 3. Uso di emoglobina umana come fonte di ferro da S. aureus A. Crescita di wild type (WT) o isogenico emoglobina recettore ISDB mutante (Δ ISDB) in NRPMI integrato con ferro chelante EDDHA emoglobina umana è statisticamente diverso come determinato dal Student a due code test t, p <0,05. Crescita B. NRPMI integrato con 10 mM cloruro di ferro (+ FeCl 3) o EDDHA (FeCl-3) non è diverso tra peso e Δ ISDB. Grafici raffigurano i dati di un esperimento rappresentativo, che comprendeva tre repliche biologiche. Le barre di errore indicano la deviazione standard dei valori di densità ottica a tempi indicati tra i replicati.

Figura 4
Figura 4. Crescita di wild type (WT) o isogenico m recettore emoglobinautant (Δ ISDB) in mezzo supplementato con emoglobina purificate da sangue fresco o emoglobina liofilizzato. Il grafico mostra i dati di un esperimento rappresentativo, che comprendeva tre biologica replicati. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dei valori di densità ottica a tempi indicati tra i replicati. Asterischi indicano valori che sono statisticamente differenti come determinato da Student a due code test t, p <0,05.

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Discussion

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Il ferro è un nutriente essenziale necessario da parte di organismi di tutti i regni della vita 15. Nei vertebrati, ferro viene sequestrato per evitare la tossicità causata da questo elemento. Questo sequestro nasconde anche ferro da microbi invasori in un processo noto come immunità nutrizionale 16. In risposta, gli agenti patogeni hanno sviluppato strategie che eludono l'immunità nutrizionale. Un tale meccanismo si basa su emoglobina, che è la fonte più abbondante di ferro all'interno dell'ospite 17. Emoglobina è contenuta all'interno dei globuli rossi. L'emoglobina rilasciata dal danneggiato globuli rossi è vincolato da aptoglobina ospitante, che segnala la rapida eliminazione di aptoglobina-emoglobina complessi da parte dei macrofagi 18. Al fine di ottenere l'accesso alla emoglobina, S. aureus esprime emolisine che lisare i globuli rossi 19. Aptoglobina indotta rimozione emoglobina viene neutralizzata dal legame ad alta affinità dell'emoglobina dai recettori della superficie cellulare espressi da 20.

Numerosi studi hanno dimostrato il contributo del sistema Isd all'infezione 8,10-14. Inoltre, studi biochimici sono state assegnate le funzioni dei suoi singoli componenti dei livelli di emoglobina-derivato acquisizione ferro 4-9. Qui si descrive un metodo che controlla la crescita di S. aureus con l'emoglobina come l'unica fonte di ferro disponibile. A questo proposito, occorre sottolineare certe condizioni che sono cruciali per il successo dell'esperimento.

La qualità e il tipo di reagenti utilizzati in emoglobina derivati ​​saggi di acquisizione di ferro crescita possono influire notevolmente sul risultato ottenunita in questi saggi. In contrasto con l'emoglobina ottenuti da sangue fresco, emoglobina che è memorizzato in forma liofilizzata permette la crescita batterica indipendente dei componenti del sistema Isd (Figura 4) 21. Ciò è probabilmente dovuto alle variazioni nella struttura di emoglobina che sono indotti dalla lyophylization. Specificamente, emoglobina liofilizzata contiene tetrameri, dimeri e monomeri di emoglobina, nonché eme nella sua forma libera 22. Purificazione di emoglobina da sangue fresco e la sua conservazione in azoto liquido garantire l'integrità della proteina 22. Vasta ricerca su emoglobina ha facilitato lo sviluppo di protocolli per la purificazione di alta qualità emoglobina da sangue fresco o in forma ricombinante, che può essere utilizzato nel saggio 23-25.

La scelta del chelante del ferro può influenzare il saggio di crescita. Per esempio, 2,2-dipiridile, che viene spesso utilizzato come un chelante del ferro, è tossicodi cellule batteriche 26. Questi due effetti rendono difficile distinguere se l'inibizione della crescita batterica da 2,2-dipiridile è dovuto alla chelazione di ferro o di tossicità. Inoltre, 2,2-dipiridile è probabilmente membrana permeabile, e quindi penetra nella cellula batterica e chelati di ferro intracellulare 27. Abbiamo trovato che l'inibizione della crescita da EDDHA è invertito da supplementazione di una sorgente di ferro, rendendo EDDHA un chelante del ferro più adatto per saggi di crescita batterica. Tuttavia, la concentrazione di EDDHA che deve essere aggiunto al mezzo di crescita può variare. Ciò è dovuto sia alla variazione della potenza EDDHA crescita medio contenuto di ferro da lotto a lotto. L'attività di ferro chelante può essere normalizzato tra lotti di EDDHA chimicamente rimuovendo residui di ferro 28. Tuttavia, a causa della variazione tra lotti di RPMI, abbiamo trovato che la concentrazione finale EDDHA può ancora bisogno di essere regolata per consentire la crescita in presenza di una sorgente di ferro. Abbiamo trovato thalla concentrazione massima di EDDHA permissiva per la crescita di tipo selvatico S. aureus in presenza di emoglobina è ottimale per questo esperimento.

Le modifiche possono essere apportate al protocollo in vigore per assomigliare più da vicino l'ambiente incontrate dai batteri durante l'infezione. Ad esempio, all'interno dell'ospite, eme che viene rilasciato da emoglobina è rapidamente vincolato emopessina. Emopessina non può essere utilizzata come fonte di ferro da S. aureus, pertanto la sua aggiunta impedirebbe acquisizione di eme rilasciato dall'emoglobina durante l'incubazione con S. aureus 12.

Riteniamo che questo saggio può essere utilizzato per la ricerca di acquisizione di metallo da una varietà di batteri patogeni. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per misurare acquisizione ferro da non emoglobina fonti di ferro che sono presenti all'interno dell'ospite.

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Disclosures

Non abbiamo nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta da borse di sanità pubblica e di servizio degli Stati Uniti AI69233 AI073843 dell'Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive. EPS è un Fellow Burroughs Wellcome nella patogenesi delle malattie infettive. KPH è stato finanziato dal Cellulare e Molecolare Microbiologia Formazione concessione Programma 5 T32 A107611-10.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC anion exchange column Varian PL1551-3802
Drabkin's reagent Sigma D5941-6VL
Hemoglobin standard Pointe Scientific H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 sodium form Sigma C7901
EDDHA LGC Standards GmbH ANC 001
Hemoglobin a antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc SC-21005
Tryptic soy agar BD 236920

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References

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