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Immunology and Infection

철 소스로 인간 혈색소를 사용하여 황색 포도상 구균 성장

doi: 10.3791/50072 Published: February 7, 2013

Summary

여기에 대한 성장 분석을 설명

Abstract

S. 구균이 중요한 신진 대사 기능과 원인 질환을 수행 할 철 필요로하는 병원성 세균입니다. 인간의 호스트 내부의 철의 가장 풍부한 저수지는 헤모글로빈의 cofactor이다 헴입니다. 헤모글로빈의 철을 취득하려면, S. 구균은 철 - 규제 표면 결정자 (Isd) 시스템 1로 알려진 정교한 시스템을 활용합니다. Isd 시스템 첫째 바인드 호스트 헤모글로빈의 구성 요소는 다음 추출하고 헴을 가져, 그리고 마지막으로 박테리아 세포질 2,3에 헴의 철을 해방. 이 경로는 체외 연구 4-9에서 수많은 통해 해부되었습니다. 또한, 감염 Isd 시스템의 후원금이 반복적으로 마우스 모델 8,10-14에서 입증되었습니다. 헤모글로빈 - 파생 철 수집에 Isd 시스템의 기여를 설립하고 성장은 점점 더 어려워 것으로 증명되었습니다. 단독 철 소스로 헤모글로빈을 사용하여 성장 assays는 B 복잡y는 성장 매체에 무료로 철을 오염 상업적으로 이용 가능한 헤모글로빈의 불안정, 그리고 철 chelators과 관련된 독성. 여기 우리는 이러한 한계를 극복하는 방법을 제시한다. 고품질의 헤모글로빈은 신선한 혈액 준비되어 있으며 액체 질소에 저장됩니다. 정화 헤모글로빈이로 보완되어 매체는 척추 호스트 내부의 병원균에 의해 발생 철 - 가난한 환경을 모방 철 (iron) - 고갈시킵니다. S.를 굶주리고하여 무료 철의 구균과 우리가 헤모글로빈을 묶는 헴를 추출, 세균 세포 봉투를 통해 헴에 합격하고 세포질에서 헴을 저하 할 수있는 능력에 전적으로 의존하는 방식으로 성장을 유도 헤모글로빈의 최소한 조작 양식을 보완. 이 분석은 S.에 hemoglobin-/heme-derived 철 획득의 메커니즘을 명료하게하다하고자하는 연구자에 유용합니다 구균 및 기타 세균 병원체.

Protocol

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1. 신선한 혈액에서 헤모글로빈의 정화

  1. 항응고제로 보충 신선한 인간의 피를 취득. 정화에 걸쳐 얼음이나 4에 혈액 ° C세요.
  2. 1500 X g에서 20 분 피를 원심 분리기. 적혈구은 (적혈구) 튜브의 하단에 있습니다. 조심스럽게 표면에 뜨는을 대기음 부드럽게 얼음처럼 차가운 0.9 % (w / V) NaCl 용액에서 펠렛을 resuspend. 원심 분리를 반복 3 회 씻는다.
  3. 얼음처럼 차가운 10 MM 트리스 - HCL (산도 8.0) 1 볼륨에 펠렛을 Resuspend. 이 삼투압에 의한 적혈구의 용해를 유도합니다. ~ 20 % 최종 볼륨에 톨루엔을 추가합니다.
  4. 밤새 회전 통닭에 4 ° C에서 알을 품다.
  5. 1 시간에 20,000 XG에서 lysate를 원심 분리기. 톨루엔 (상단에 떠있는)와 펠렛 훼손되지 않은 떠나 중간 hemolysate 분수를 수집합니다. 중앙 분수를 수집하는 긴 목 피펫을 사용합니다.
  6. 0.44 μm 주사기 필터를 통해 전달합니다. 솔루션은 미립자가 포함 된 경우물질과는 단계 1.5를 반복 필터를 통과 할 수 없습니다.
  7. 고성능 액체 크로마토 그래피와 헤모글로빈 (HB)를 정화 (HPLC) 음이온 교환 컬럼 (Varian, PL-SAX 1000 8 μm, 150mm × 4.6 mm). 이 모바일 상 MM 트리스 - HCL (산도 8.0) 및 모바일 상 B 10 MM 트리스 - HCL (산도 8.0) + 0.5 M NaCl이다 10. 용매 B의 0 % -100 %의 기울기는 2.0 ML / 분 유량에서 2 분 동안 실행됩니다. (: 410 nm의와 280 nm의 λ) 용출는 흡수를 기반으로 모니터링된다. 밝은 붉은 색과 눈에 잘 띄는 흡수 피크 (그림 1)을 특징으로 만 일부를 수집합니다.
  8. 에 대한 용출을 Dialyze 인산염 버퍼 다시 생리 (PBS) 밤 한 다음 몇 시간 동안. 0.22 μm의 주사기 필터를 통과하여 소독.
  9. HB 농도를 측정하기 위해 PBS에 알려진 농도의 표준 HB 솔루션을 준비합니다. (우리 시약과 표를 참조 표준 솔루션을 혼합하여 샘플에 HB의 농도를 결정에드) 또는 1:1의 비율로 2 배 Drabkin의 시약 (가루로 만든)과 샘플 솔루션입니다. 예를 들어, 96 - 웰 플레이트에 100 μl 배 Drabkin의 시약을 100 μl HB 솔루션을 섞는다. 540 나노 미터에서 15 분 및 측정 흡광도에 품다. 표준 곡선을 그리기 및 샘플에있는 HB 농도를 결정한다. 다섯 데 15 MG / ML 생산량은 전형적인 있습니다.
  10. 복제에 15 % SDS-PAGE에서 헤모글로빈을 정화 15-20 μg을 실행합니다. 젤 중 하나를 청바지, 헤모글로빈의 니트로 셀룰로스 막과 immunoblot (그림 2)에 다른 겔에서 단백질을 전송합니다.
  11. 고정 및 액체 질소에 헤모글로빈의 1 ML의 aliquots를 저장합니다.

2. 의 준비 철 고갈 성장 미디어

  1. 제조업체와 1% cassamino의 산 (CA) (w / V)에서 권장하는대로 나트륨 중탄산염을 추가 물에 RPMI 분말을 용해하여 로즈웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 국물을 준비합니다. 0.2 μm 필터 및 매장 refrig를 통과하여 소독erated.
  2. 7% (w / V) Chelex 100를 추가하고 저어 접시에 하루 아침에 혼합하여 금속 소모 RPMI (NRPMI)를 준비합니다. 0.2 μm 필터 및 매장 냉장를 통과하여 Chelex 100 제거합니다. 25 μM ZnCl 2, 25 μM MnCl 2, 100 MM CaCl 2, 1 ㎜ 무균 1000 X 솔루션으로 사전에 준비 MgCl 2 : 필수 비 철 금속과 미디어를 보완. 재사용 가능한 물품의 철 오염을 방지하기 위해이 단계에 대한 일회용 플라스틱 용기를 사용하십시오.

단독 철 소스로 혈색소를 사용하여 3. 포도상 구균 성장

  1. 연속 S. 냉동 가공에서 tryptic 간장 한천 (TSA)에 절연을위한 구균. 20-24 시간에 37 ° C에서 알을 품다.
  2. Resuspend ethylenediamine-N, 100 mm까지 무수 에탄올에 N'-비스 (2 - hydroxyphenylacetic 산) (EDDHA). EDDHA이 솔루션에 들어갈 것이 아니라 에탄올의 소독을합니다.
  3. 0.5 mm의 최종 농도에 RPMI에 EDDHA을 추가합니다. 허용EDDHA은 다음 단계로 진행하기 전에 최소 30 분 동안 분해합니다. 배치 - 투 - 배치 변화로 인해, 최종 EDDHA 농도는 박테리아 성장을 허용하는 0.25 mm까지 낮아해야 할 수 있습니다.
  4. S.의 한 식민지의 예방 RPMI 15 ML 나사 캡 원추형 튜브에 EDDHA를 포함하는 5 ML에 구균. 16-20 시간에 대한 분 (RPM) 당 180 회전에서 진동으로 37 ° C에서 알을 품다.
  5. 7500 XG에서 5 분의 밤 문화를 원심 분리기와 NRPMI이 0.5 밀리미터 EDDHA을 포함에 펠렛을 resuspend. ~ 3 OD 600 정상화.
  6. NRPMI는 ML HB 당 2.5 μg과 0.1-1.0 밀리미터 EDDHA을 포함하는 준비합니다. 배치 사이의 차이로 인해 NRPMI에서 무료 철을 킬레이트하는 데 필요한 EDDHA 농도가 다를 수 있습니다.
  7. 15 ML 나사 캡 원추형 튜브 1 ML NRPMI + EDDHA + HB로 단계 3.5에서 세균 현탁액의 하위 문화 10 μl.
  8. 180 rpm으로 또는 회전 드럼에 진동을 최대 48 시간까지에 대해 37 ° C에서 문화를 품다.
  9. 600 판독을.

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Representative Results

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우리는 HPLC (프로토콜 단계 1.7)로 hemolysate 인간의 헤모글로빈을 정화하고 있습니다. 그림 1은 쇼 280과 410 나노 미터 파장에서 eluate의 흡광도를 기록. 비율 5 수집 된 및 다른 분수이 삭제되었습니다. eluate의 밀리리터 당 헤모글로빈의 5-15 밀리그램의 생산량은 일반적으로 취득하고 있습니다. 정화 헤모글로빈이 중복으로 SDS-PAGE에 의해 분석되었으며 젤은 어느 단백질에 물들 또는 니트로 셀룰로스에 전송 된 및 (프로토콜 단계 1.10, 그림 2) immunoblotted.

우리는 야생 유형의 성장을 지원하기 위해 인간의 헤모글로빈을 정화하는 능력을 평가 한 S. 구균과 S. Isd 시스템 (Δ isdB)의 IsdB 구성 요소를 결여 구균. IsdB는 헤모글로빈 파생 철 취득 12 필요합니다 헤모글로빈 수용체입니다. 야생 유형과 Δ isdB은 인간 hemog을 보충 철 - 소모 매체에서 재배 된 lobin은 (NRPMI + EDDHA + HB)과 같은 프로토콜의 제 3 항에 설명되어 있습니다. NRPMI + EDDHA + HB, 야생 유형에서 재배하지만, Δ isdB 시간 (그림 3A)를 통해 문화의 광학 밀도의 증가로 표시를 분아 따위에 의해 번식 할 수 없습니다합니다. 반면, 보완 무료 철을 (+ FeCl 3) 활용 할 수있는 능력은 야생 유형과 Δ isdB (그림 3B)에서 동일합니다. 야생의 유형이나 Δ isdB 둘 다 철 소스 (그림 3B)의 부재에서 세포 분열 따위에 의해 번식.

우리는 S.의 성장을 비교 한 NRPMI + EDDHA의 구균은 신선한 혈액 또는 동결 건조 된 헤모글로빈에서 정화 헤모글로빈과 보충. 그림 4는 혈액 정화 헤모글로빈이 성장 IsdB을 필요로하는 동안 동결 건조 된 헤모글로빈은 Δ isdB의 확산을 가능하게하는 보여줍니다.

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1 그림. 헤모글로빈 정화 중에 용출 분수 흡수. 410 나노 미터 (헴 결합 단백질에 해당)와 280 nm의 (모든 단백질에 대한 특성)에 흡수가 용출을 통해 모니터링되었습니다. 분수 5 번째는 헤모글로빈을 포함하고 수집되었습니다.

그림 2
그림 2. 인간의 헤모글로빈에게 정화 헤모글로빈의 20 마이크로 그램을 정화하는 것은 SDS-PAGE 15 %를 denaturing 사용하여 구분되었습니다. A. 젤은 바이오 - 방사선 단백질 검정 염색 시약과 단백질에 얼룩이. B.의 니트로 셀룰로스 막이 헤모글로빈에 immunoblotted. 더 희미한 상단 밴드가 완전히 변성하지 않은 헤모글로빈 dimers과 tertramers,있는 동안 강렬한 낮은 밴드는, 헤모글로빈 모노머입니다.

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그림 3. S.하여 철의 소스로 인간의 헤모글로빈 사용 구균의 A. 학생의 두 꼬리 t 시험, P <0.05의 결정이 철 chelator EDDHA과 인간의 헤모글로빈과 보충 야생 종류 (중량) 또는 NRPMI에 isogenic 헤모글로빈 수용체 isdB 돌연변이 (Δ isdB)의 성장은 통계적으로 차이가 있습니다. NRPMI에서 B. 성장 10 μM 철 염화 (+ FeCl 3) 또는 EDDHA과 보충 (-FeCl 3) 중량과 Δ isdB 차이 없습니다. 그래프는 세 생물은 복제를 포함 담당자 실험에서 데이터를 도시한다. 오류 바 복제 사이의 지정된 시간 지점에서 광학 밀도 판독의 표준 편차를 나타냅니다.

그림 4
4 그림. 야생 유형 (중량) 또는 isogenic 헤모글로빈 수용체 m의 성장신선한 혈액 또는 동결 건조 된 헤모글로빈에서 정화 헤모글로빈과 보충 미디어 utant (Δ isdB가). 그래프는 세 생물 복제를 포함 담당자 실험에서 데이터를 도시한다. 오류 바 복제 사이의 지정된 시간 지점에서 광학 밀도 판독의 표준 편차를 나타냅니다. 별표는 학생의 두 꼬리 t 시험, P <0.05의 결정이 통계적으로 다른 값을 나타냅니다.

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Discussion

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철은 인생 15 모든 왕국에서 생물에 필요한 필수 영양소입니다. vertebrates에서, 철은이 요소로 인한 독성을 피하기 위해 분리되어 있습니다. 이 격리은 영양 면역 16로 알려진 과정에 미생물을 침해에서 철을 은폐합니다. 대응 병원균은 영양 면역을 회피 전략을 발전시켜 왔습니다. 하나의 메커니즘 헤모글로빈에 의존되는데,이 호스트 17에서 철의 가장 풍부한 원천입니다. 헤모글로빈은 적혈구 안에 포함되어 있습니다. 손상된 적혈구에서 출시 혈색소는 대 식세포 18 일 haptoglobin - 헤모글로빈 단지의 급속한 제거 신호를 호스트 haptoglobin에 의해 구속된다. 헤모글로빈에 액세스하기 위해, S. 구균은 적혈구에게 19 lyse hemolysins을 표현한다. Haptoglobin 유도 헤모글로빈 제거는에 의해 표현 세포 표면 수용체에 의해 헤모글로빈의 높은 친 화성 바인딩에 의해 반박된다 (20)에서 그대로 사용됩니다.

다수의 연구는 감염 8,10-14에 Isd 시스템의 기여를 증명하고있다. 또한, 생화학 연구 헤모글로빈 - 파생 철 취득 4-9에서의 개별 구성 요소의 기능을 할당했습니다. 여기 S.의 성장을 모니터링 분석을 설명 사용 가능한 철의 유일한 소스로 헤모글로빈과 구균. 이러한 점에서, 우리는 실험의 성공을 위해 필수적입니다 특정 조건을 지적해야합니다.

헤모글로빈 - 파생 철 수집 성장 assays에 활용 시약의 품질과 종류 극적으로 결과를 obtai에 영향을 미칠 수있다이러한 assays의 네드. 동결 건조 된 형태 박테리아 성장 Isd 시스템 (그림 4) 21의 구성 요소의 독립적 인 수에 저장되어 신선한 혈액 헤모글로빈에서 얻은 헤모글로빈 대조적으로. 이 가능성이 lyophylization에 의해 유도 아르 헤모글로빈의 구조의 변화 때문입니다. 특히, 동결 건조 된 헤모글로빈은 tetramers, dimers 및 헤모글로빈의 단량체뿐만 아니라 자유로운 형태의 22 헴이 포함되어 있습니다. 액체 질소에 신선한 혈액과 보존의 헤모글로빈의 정화는 단백질 22의 무결성을 보장합니다. 헤모글로빈에 대한 광범위한 연구는 신선한 혈액 또는 검정 23-25에서 사용할 수있는 재조합 형태, 높은 수준의 헤모글로빈의 정화를위한 프로토콜의 개발을 촉진하고 있습니다.

철 chelator의 선택은 성장 분석에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 자주 철 chelator로 사용되는 2,2 - dipyridyl는 독성26 박테리아 세포합니다. 이 두 효과는 2,2-dipyridyl하여 세균 성장​​의 억제는 철 chelation이나 독성에 의한 경우 판별하기가 어렵합니다. 또한, 2,2 - dipyridyl은 막 투과 될 가능성이 있으며, 따라서 세균 세포를 침투과 철 intracellularly 27 chelates. 우리는 EDDHA의 성장 억제가 EDDHA 박테리아 성장 assays에 더 적합한 철 chelator하는, 다리미 소스의 보완에 의해 역전이있는 것으로 나타났습니다. 그러나, 성장 매체에 추가해야합니다 EDDHA의 농도가 다를 수 있습니다. 이 EDDHA의 효력 및 배치에서 배치로 성장 중간 철분 모두의 변화 때문입니다. 철 킬레이트 화 활동은 화학적 잔류 철에게 28 제거하여 EDDHA 일괄 사이에 표준화 할 수 있습니다. 그러나, RPMI 일괄 사이의 변화로 인해, 우리는 최종 EDDHA 농도가 여전히 철 소스의 존재의 성장을 허용하도록 조정해야 할 수도있는 것으로 나타났습니다. 우리는 일을 발견야생 유형의 성장에 대한 허용이 EDDHA의 가장 높은 농도에서 S. 헤모글로빈의 존재에 구균이 실험에 대한 최적입니다.

수정은 밀접하게 감염시 세균에 의해 발생 환경과 유사하기 위해 현재의 프로토콜에 대한 변경 될 수 있습니다. 예를 들어, 호스트 내에서 헤모글로빈에서 출시 헴은 빠르게 hemopexin에 의해 구속된다. Hemopexin는 S.하여 철의 소스로 사용할 수 없습니다 구균 따라서는 첨가 S.과 부화하는 동안 헤모글로빈에서 출시 헴 취득을 방지 것 구균 12.

이 분석은 세균 병원균의 다양한 의해 금속 인수에 대한 연구 사용할 수 있습니다 생각합니다. 또한,이 방법은 호스트에서 존재 철의 비 헤모글로빈 소스에서 철 수집을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

우리는 공개 할 아무 것도 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 알레르기 및 전염병 국립 연구소에서 미국 공중 보건 서비스 보조금 AI69233 및 AI073843에 의해 지원되었다. EPS는 전염병의 Pathogenesis에 버로우즈 웰컴 동지이다. KPH는 세포 및 분자 미생물학 교육 보조금 프로그램 5 T32 A107611-10로 운영되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC anion exchange column Varian PL1551-3802
Drabkin's reagent Sigma D5941-6VL
Hemoglobin standard Pointe Scientific H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 sodium form Sigma C7901
EDDHA LGC Standards GmbH ANC 001
Hemoglobin a antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc SC-21005
Tryptic soy agar BD 236920

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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철 소스로 인간 혈색소를 사용하여 <em>황색 포도상 구균 성장</em>
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Pishchany, G., Haley, K. P., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source. J. Vis. Exp. (72), e50072, doi:10.3791/50072 (2013).More

Pishchany, G., Haley, K. P., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source. J. Vis. Exp. (72), e50072, doi:10.3791/50072 (2013).

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