Summary
العزلة وثقافة myofibers هو معيار الذهب
Abstract
يتم تنفيذ تجديد العضلات في البالغين من الخلايا الجذعية المقيمين تسمى الخلايا الأقمار الصناعية. وتعرف الخلايا الأقمار الصناعية من خلال موقفهم الصفيحة القاعدية بين وغمد الليف العضلي كل ليف عضلي. المعرفة الحالية من سلوكهم يعتمد بشكل كبير على استخدام بروتوكول ليف عضلي العزلة واحد. في عام 1985، وصف بيشوف بروتوكول لعزل الألياف الحية واحدة من العضلة القابضة لأصابع القصيرة (FDB) من الفئران الكبار بهدف إنشاء نظام في المختبر حيث يتم الحفاظ على الرابطة الفعلية بين ليف عضلي والخلايا الجذعية لها 1. في عام 1995، Rosenblattmodified بروتوكول بيشوف يتم التقاطها منفردة بحيث myofibers والتعامل معها بشكل منفصل بعد الهضم كولاجيناز بدلا من العزلة بالترسيب الجاذبية 2، 3. منذ ذلك الحين روزنبلات أو بروتوكول بيشوف تكييفها لمختلف العضلات أو السن أو الظروف 3-6. ليف عضلي واحد من العزلة التقنية لا غنى عنهبسبب مزاياه الفريدة الأداة. الأولى، في واحدة بروتوكول ليف عضلي، يتم الاحتفاظ الخلايا الأقمار الصناعية الصفيحة القاعدية تحت. هذه هي ميزة فريدة من البروتوكول وغيرها من التقنيات مثل الإسفار خلية المنشط يتطلب الفرز الكيميائية والميكانيكية الأنسجة التفكك 7. على الرغم من أن نظام الاستزراع ليف عضلي يمكن أن يكون بديلا للفي الدراسات المجراة، فإنه لا توفر منصة ممتازة لمعالجة الخصائص البيولوجية ذات الصلة للخلايا الجذعية العضلية. يمكن تربيتها في ظروف واحدة myofibers الطلاء القياسية أو في ظروف متغيرة. تتعرض الخلايا الفضائية على myofibers عائمة للنفوذ تكاد تنعدم أخرى من البيئة ليف عضلي. وقد ثبت صلابة الركيزة وتلبيس للتأثير على قدرة الخلايا الأقمار الصناعية "لتجديد العضلات 8 و 9 حتى تكون قادرة على السيطرة على كل هذه العوامل بشكل مستقل يتيح التمييز بين مكانة التي تعتمد على ومستقلة الردود. تركيزات مختلفة من المصل لديككما تبين أن يكون لها تأثير على عملية الانتقال من السكون إلى تفعيل. للحفاظ على الدولة سكون من الخلايا التابعة لها يرتبط بها، ينبغي أن تبقى ألياف منخفضة في المتوسط المصل 1-3. هذا هو مفيدة بشكل خاص عند دراسة الجينات المسؤولة في الدولة السكون. في المتوسط الغنية المصل والخلايا الأقمار الصناعية تفعيل بسرعة، تتكاثر، والهجرة التفريق، ومحاكاة وبالتالي في عملية التجدد فيفو 1-3. ويمكن استخدام هذا النظام لأداء مجموعة متنوعة من المقايسات مثل اختبار مثبطات الكيميائية؛ التعبير عن الجينات خارج الرحم عن طريق التسليم الفيروس؛ الجينات مقرها قليل النوكليوتيد تدق إلى أسفل أو التصوير الحي. هذا المقال يصف الفيديو البروتوكول المستخدم حاليا في مختبرنا لعزل myofibers واحد من أصابع الطويلة الباسطة (EDL) العضلات من الفئران البالغة (6-8 أسابيع من العمر).
Protocol
وقد تم التعامل مع جميع التجارب وفقا لجامعة أوتاوا لوائح لرعاية الحيوانات والتعامل معها.
أنظر الجدول 1 لمحة عامة عن البروتوكول.
1. قبل البدء في العزل
- إعداد الحلول التالية:
0.2٪ كولاجيناز نوع I في DMEM (Dulbecco لتعديل النسر المتوسط؛ ارتفاع نسبة الجلوكوز، الجلوتامين L-مع 110 ملغ / مل البيروفات الصوديوم). لمدة العضلات EDL إعداد 2 مل من 0.2٪ في Collagenease DMEM. تصفية حل من خلال فلتر ميكرون 0.22. 10 دقيقة قبل العزلة، prewarm في 37 ° C في حمام مائي. يمكن تجميد مأخوذة من كولاجيناز إضافية غير مخفف في -20 ° C لاستخدامها لاحقا.
ملاحظة: استخدام DMEM مع البيروفات الصوديوم في جميع الإجراءات. الألياف لا البقاء على قيد الحياة في المتوسط البيروفات خالية الصوديوم.- غسل وسائل الإعلام (استخدامها لتنفيذ كافة يغسل). تكملة DMEM مع 1٪ البنسلين / الستربتوميسين. تصفية من خلال 00.22 ميكرون التصفية قبل الاستخدام.
- ليف عضلي وسائل الإعلام الثقافة. تكملة DMEM FBS مع 20٪، 1٪ الدجاج استخراج الأجنة و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين. تصفية تصفية من خلال 0،22 ميكرون قبل الاستخدام.
- Matrigel الأطباق المغلفة. لألياف الثقافة لفترة طويلة من الزمن، ونحن نوصي باستخدام Matrigel والركيزة الطلاء. لإعداد أطباق المغلفة Matrigel، ذوبان الجليد وقسامة من Matrigel بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. في اليوم التالي، تمييع Matrigel 1:10 في DMEM. إبقاء Matrigel عند 4 في جميع الأوقات C ° وتجنب التغيرات في درجات الحرارة المفاجئ حيث سيؤدي ذلك إلى خلق بلورات مجهرية داخل حل Matrigel مما أدى إلى طلاء متفاوتة. تطلى أطباق مكان على الجليد. أطباق معطف مع حجم ما يكفي لتغطية السطح. السماح لها الجلوس لمدة 1 دقيقة. إزالة تماما Matrigel متبقية. اسمحوا الجافة في الأطباق C ° 37 لمدة لا تقل عن 3 ساعة قبل استخدامها أو بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يمكن مأخوذة من Matrigel المخفف إعادة استخدامها عدة مرات لغرض طلاء إذا تم تخزينة في 4 و ديز؛ C. - وأخيرا، تأكد من تنظيف محطة المجهر وأدوات تشريح مع الايثانول 70٪.
- العزلة لمدة EDL (واحد الماوس) إعداد خمس أطباق بتري بلاستيكية (60 * خفض 15mm) على النحو التالي:
- أربعة أطباق لعزل (1 التفكك العضلات ل، 3 ليغسل المسلسل). يجب أن تطلى جميع الأطباق مع مصل الحصان (HS) لمنع myofibers من الالتصاق البلاستيك. لمعطف، ماصة 3 مل من مصل الحصان في كل دوامة، صحن للسماح طلاء حتى إزالة مصل الحصان، والسماح للطبق جاف لمدة لا تقل 30 دقيقة. إضافة 4 مل من DMEM إلى كل طبق. الحفاظ على الأطباق في C ° 37 في حاضنة 5٪ CO 2 قبل استخدامها.
ملاحظة: يمكن مصل الحصان إعادة استخدامها عدة مرات، إذا ما واصلت العقيمة. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام محلول HS 10٪ في DMEM إلى أطباق معطف. استخدام أطباق HS المغلفة في جميع أنحاء بروتوكول كله و. myofibers زراعة على الظروف عندما العائمة- وسيتم استخدام صحن واحد لmyofibers الثقافة بعد العزلة. ALTويمكن استخدام أحجام طبق ernative أو صيغ لثقافة النهائية للmyofibers اعتمادا على تطبيقات المصب. ومع ذلك، فإننا لا توحي أحجام الطبق أكبر من 60 * 15mm مم. يمكن أن تظل في Myofibers التعليق لمدة لا تزيد 96 ساعة قبل الانكماش المفرط يحدث. لأوقات أطول الثقافة، نوصي باستخدام الأطباق المغلفة أو لوحات Matrigel.
- لعزل الألياف 1 (2 EDL)، وإعداد 2 العقيمة ماصات باستور: واحدة كبيرة تحمل ماصة لمعالجة العضلات واحد ماصة صغيرة تحمل للتلاعب ليف عضلي. استخدام قلم الماس لقطع الزجاج ماصة كل إلى الطول المطلوب والبولندية لضمان سلاسة حواف الحرارة ماصة لل. باستخدام اللهب، منحنى غيض من ماصة تتحمل الصغيرة. وهذا سوف يساعد التعامل مع الألياف واحد. الشعلة لتعقيم. معطف كل ماصة مع HS قبل الاستخدام.
2. تشريح العضلات والهضم
- لغرض هذه التجارب، 8 الاسبوع القديمة SV129، Pax7 CreER Cklr؛ Rosa26TdTomato (واستخدمت Rosa26YFP؛ Pax7Cre-TdTomato) وMyf5 لجنة المساواة العرقية.
- رش الأطراف الخلفية مع الايثانول 70٪. دبوس الحيوان (حتى الوجه) إلى لوحة الدعم لديهم فهم أفضل للطرف هند أثناء العملية.
- مع مساعدة من مقص، وقطع طريق على طول الطرف وفضح العضلات الأساسية. إزالة الجلد وكذلك الشعر أو الفراء أي (الشكل 1A).
- مع مقص غرامة، قطع طريق لفافة رقيقة دون الإضرار العضلات الأساسية. بصريا توطين EDL. تم العثور على مؤسسة كهرباء لبنان في المقصورة الأمامية من طرف هند فقط تحت العضلات الظنبوبي (TA) الأمامي.
- مع بمساعدة اثنين من ملقط، تعرض الأوتار البعيدة.
- قطع الأوتار البعيدة (TA من كل من مؤسسة كهرباء لبنان و) مع مقص حاد الربيع Cohann-Vannas.
- مع مساعدة من ملقط عقد كل من مؤسسة كهرباء لبنان والعضلات TA بواسطة الأوتار والعضلات سحب بدقة تصل في نهاية القريبة. عند هذه النقطة يجب أن تكون قادرا على رؤية واضحةالعضلة EDL فقط تحت العضلات TA. الآن، فصل EDL من العضلات عن طريق سحب TA الأوتار اثنين في اتجاهين متعاكسين (1B الشكل). تجنب تمتد عضلة EDL أثناء تنفيذ هذه العملية لأن ذلك سيضر myofibers.
- كشف وتر EDL. لتحسين رؤية وتر القريبة فإنه قد تساعد في هذه المرحلة لإزالة العضلات TA. فإنه قد يساعد أيضا على قطع بعض النسيج الضام حول الركبة (الشكل 1C).
- قطع وتر القريبة وإزالة بلطف EDL (1D الشكل).
- من خلال عقد العضلات من خلال الأوتار لها، نقله إلى 2 مل من محلول كولاجيناز أعدت مسبقا. احتضان في C ° 37 في حمام مائي.
ملاحظة: لعزل الألياف ناجحة، من المهم لعزل EDL من وتر إلى وتر بحيث يتم المحافظة على سلامة ليف عضلي. لا يمكن أن يؤديها الخطوات 2،3 حتي 2،9 تشريح تحت المجهر. بدلا من ذلك، استخدام magnقد ifying الزجاج تساعد أيضا في الحصول على رؤية أفضل للعضلات. - كرر الخطوات 2،3 حتي 2،9 لعزل EDL الثاني. نقل EDL الثاني في نفس الأنبوب. لتجنب الهضم متفاوتة، ينبغي استكمال عزل EDL الثانية لا أكثر من 5 دقائق بعد الأول.
ملاحظة 1: فترة حضانة قد تحتاج إلى تعديل اعتمادا على النشاط كولاجيناز. قد تكون مطلوبة حضانة أطول أو أقصر حسب عمر وحجم و/ أو حالة العضلات (عضلات تليفي مثل الهضم تحتاج لوقت أطول).
ملاحظة 2: إذا فحص الخلايا الأقمار الصناعية السلوك في ظروف السكون، والإثارة خلال فترة الهضم العضلات قد تنشيط خلايا الأقمار الصناعية 10. - خلال فترة الهضم، والتحقق بانتظام العضلات لتجنب الإفراط في الهضم. وقف عملية الهضم عند بدء العضلات لتخفيف قيود وmyofibers مرئية. لوقف عملية الهضم، ونقل كل من العضلات بعناية إلى طبق بتري prewarmed مع 4 مل من DMEM (dissociatiعلى طبق). استخدام ماصة كبيرة الحجم تحمل لتنفيذ هذه العملية.
ملاحظة: تجنب overdigestion العضلات وهذا يؤدي حتما إلى عزلة شديدة myofibers التعاقد.
3. ليف عضلي واحد التفكك والثقافة
- إطلاق سراح myofibers، استخدم ماصة الزجاج كبيرة تحمل لطرد العضلات مع المتوسط الدافئ حتى ألياف طبيعية تبدأ إطلاق سراحهم. لا يسحن على العضلات وهذا سوف يؤدي حتما إلى الألياف الضارة. وتنفيذ هذه الخطوات التالية تحت المجهر تشريح.
- تواصل الإفراج عن myofibers حتى يتم الوصول إلى الرقم المطلوب. إذا كان المطلوب طبق في درجة حرارة الغرفة لأكثر من 10 دقيقة سماح دقيقة 5 (الحد الأدنى) الحضانة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 إلى إعادة تتوازن المتوسط.
ملاحظة: إذا المتوسطة تصل إلى درجة حرارة أقل من الفسيولوجية (37 ° C) لفترة طويلة myofibers سوف يموت. - باستخدام ماصة صغر حجم تجويف، حوالةص يعيش myofibers واحد لطبق prewarmed الجديدة (أول ثلاثة يغسل التوالي). التعامل مع كل ليف عضلي بشكل فردي بدلا من نقل الجزء الأكبر من myofibers في كل مرة. إذا لزم الأمر، احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 ل10-15 دقيقة لإعادة تتوازن المتوسط.
- كرر الخطوة 3.3 من 2 أكثر الأوقات أو حتى يتم إزالة جميع myofibers القتلى والحطام. نوصي لا يقل عن ثلاثة متتالية ليغسل السليم تنظيف.
ملاحظة: myofibers الأموات تظهر القصير وفرط التعاقد تحت ضوء المجهر. - احتضان myofibers واحد في 37 ° C، CO 5٪ 2 في طبق الغسيل مشاركة (DMEM فقط) لساعة واحدة على الأقل قبل التحول إلى ثقافة المتوسط. هذا يسمح myofibers للتكيف مع ظروف المختبر في في غياب المصل. وجدنا أن ثقافة الفوري لmyofibers في المتوسط الغنية المصل يزيد تقلص الألياف.
- بعد واحد ساعة، ونقل إلى طبق myofibers prewarmed جديدة أو إلى تنسيق ثقافة المناسبةبالاعتماد على التطبيق المصب. الألياف الثقافة في مصل المتوسطة العالية للسماح تنشيط الخلايا الأقمار الصناعية. وبدلا من ذلك، يمكن أيضا تركيزات مختلفة من المصل أو الدجاج استخراج الجنين يمكن استخدامها. تغيير المتوسطة كل يوم.
4. تطبيقات المصب
- المناعية. يمكن ان تكون ثابتة myofibers الحية وملطخة في أي لحظة وقت خلال العزلة. لا يمكن أن يؤديها المناعي على حد سواء myofibers العائمة والركيزة المرفقة. إذا تلطيخ myofibers العائمة، استخدم ماصة الزجاج صغيرة تحمل لنقل myofibers من حل واحد إلى آخر. بدلا من ذلك، فمن الممكن للحفاظ على myofibers في البئر طوال نفس الإجراء كافة وإضافة / إزالة الحلول باستخدام ماصة الزجاج. تجنب التطلع لأن هذا المعيار سيؤدي إلى إزالة myofibers أيضا. لفترة وجيزة، إزالة ثقافة المتوسط؛ myofibers الإصلاح في prewarmed بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) لمدة 5 دقائق. غسل نطاق واسع في العديد من الأوقات PBS. Incubaالشركة المصرية للاتصالات في myofibers جليكاين 1٪ في برنامج تلفزيوني أو غيرها من حلول التبريد القياسية لتقليل PFA تلطيخ الخلفية. إذا لزم الأمر، permeabilize myofibers مع 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة ثم يغسل في برنامج تلفزيوني 5 دقائق. احتضان الألياف في منع الحل (10٪ من مصل الحصان، 0.1٪ تريتون X-100، نان 1٪) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في C. يفضل ° 4 يمكن استخدام حلول بديلة تسد، اعتمادا على الضد من الاهتمام. يغسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. احتضان الضد الأولية مع المناسبة مخففة في حل حظر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في C. ° 4 غسل الألياف 3 مرات في 5 دقائق يغسل في برنامج تلفزيوني في لإزالة أي جسم مضاد غير منضم. احتضان الضد الثانوية مع مناسبة مرور 45 دقيقة إلى 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يغسل 3 مرات في 5 دقائق يغسل في برنامج تلفزيوني في. ملون مباين نوى مع 1 ملغ / مل دابي. إذا تلطيخ الألياف العائمة، ونقل كل الألياف إلى شريحة زجاجية مناسبة للفحص المجهري. إزالة أي فائض في PBS أو المتوسط. تطبيق تصاعد ميديام ثم قم بإضافة ساترة. انتقل إلى تصور myofibers تحت المجهر مضان. انظر الشكل 4 لممثل المناعي على myofibers EDL. ويرد وصف الإجراءات البديلة تلطيخ باستخدام مثبتات أقوى في فيرما، M. وآخرون 11 و Wosniak، AC وآخرون 12.
- قليل النوكليوتيد أو ترنسفكأيشن عابرة البلازميد. يمكن تقاس myofibers حية مع سيرنا البلازميد أو لجين معين / ثانية في المصالح. عند استخدام سيرنا، يوصى ترنسفكأيشن ضربة قاضية مزدوجة لجين كفاءة. نقترح إجراء ترنسفكأيشن الأولى بعد 8 ساعات من العزلة. ستة ساعة بعد ترنسفكأيشن، مع استبدال المتوسطة الطازجة. لترنسفكأيشن سيرنا، فإننا نقترح البدء باستخدام تركيز النهائي من 50 نانومتر. ويمكن تحليل الجينات ضربة قاضية التعبير استخراج الحمض النووي الريبي أو يفضل أن يكون ذلك المناعية.
- الفيروسية العدوى. إصابة myofibers الحية من الممكن على الرغم من وقوع خليةقد يكون الموت أعلى من ترنسفكأيشن مع وبنسبة ضئيلة كفاءة العدوى تكون متغيرة تبعا للظروف العضلات والسن. على سبيل المثال، myofibers سليمة العضلات الكبار غير خاصة استجابة لعدوى فيروسية بسبب وجود الصفيحة القاعدية وهو ما ثبت لتوفير حاجز وقائي ضد الإصابة المضيف 13 و 14. ويفضل أكثر من ناقلات lentiviral ناقلات فيروسات الرجعية لأنها يمكن أن تصيب خلايا هامدة (الإنقسامية غير). لعدوى فيروسية، فإنه من المستحسن أن الألياف الثقافة على طبق المغلفة Matrigel أو لوحة والسماح myofibers التكيف مع الظروف وسائل الإعلام للساعة 24 الأولى.
- يعيش التصوير. يعيش تصوير myofibers هو مضيعة للوقت وخاصة يتطلب المجهر مجهزة C ° 37، 5٪ CO 2 غرفة. ومن المفيد عند تقييم سلوك الخلايا قمر واحد. وكان العمل يتم ذلك باستخدام هذه التقنية مفيدة لاكتشاف عدم التجانس الخلية الأقمار الصناعية ودراسة beha بهمvior على ألياف (15 و 16).
Representative Results
نحن هنا وصف عزلة myofibers واحدة من العضلات EDL من الفئران البالغة. myofibers ناجحة تسفر تعتمد على عدة عوامل، مثل نشاط العضلات كولاجيناز أو شروط أو العمر. الأهم من ذلك، بمعزل عن العضلات من وتر إلى نتائج وتر في myofibers طويلة من العضلات سليمة EDL. ويظهر الشكل 1 خطوة خطوة عن طريق التمثيل رسومية من "وتر لوتر" العزلة. مرة واحدة يتم هضمها بشكل كامل في العضلات، ويتم الإفراج myofibers عن طريق الضغط لطيف إلى العضلات. 2A يوضح الشكل صورة ممثل تجربة العزلة ليف عضلي بعد غسل الأولى. تعاقدت فرط في هذه المرحلة ثقافة يحتوي على خليط من حزم من myofibers واحدة التي تبدو وكأنها هياكل أنبوبية طويلة ومشرقة، myofibers التي هي مظلمة وقصيرة والحطام من عملية الهضم. بحلول نهاية عام لا يقل عن ثلاثة يغسل متتالية، يجب أن يعيش واحد فقط myofibers البقاء في ديSH للثقافة أو تحليل المصب (الشكل 2B). الشكل 2C يظهر طويلة، والألياف الحية بالمقارنة مع الألياف فرط التعاقد (C '). في ذلك الوقت من العزلة، والخلايا الأقمار الصناعية تظهر نتوءات صغيرة على سطح ليف عضلي (الشكل 3A). إذا حافظت في المتوسط الغنية المصل والخلايا الأقمار الصناعية تفعيل، تتكاثر، والهجرة تلتحم في نهاية المطاف إلى myotubes (B). بعد 15 يوما في الثقافة، وكلها تعبر عن myotubes Myf5 YFP مراسل (C) مما يدل على أن يتم تنفيذ تجديد العضلات في البالغين من الخلايا التي في مرحلة ما خلال تنميتها والتعبير عن عامل حاسم عضلي Myf5. كل الخلايا الأقمار الصناعية تعبر عن النسخ مربع إقران عامل Pax7 17. ويمكن استخدام خط الماوس مراسل Pax7Cre-TdTomato لتعقب الخلايا الأقمار الصناعية عن طريق التعبير للإشارة TdTomato الفلورسنت (أرقام 3D وE). ويبين الشكل 4 أ اللقاحات ممثلnofluorescence من ضعف Pax7 + / الخلايا الأقمار الصناعية Myod. كلاسيكي مزدوجة Pax7 + / + Myod تعتبر خلايا العضلات الأقمار الصناعية التكاثري الأسلاف التي ارتكبت سيكمل البرنامج إما من خلال تنظيم تمايز أسفل Pax7 مع الحفاظ على التعبير Myod أو العودة إلى الهدوء من خلال تنظيم والحفاظ عليها Myod Pax7 التعبير 18
الشكل 1. EDL العزلة العضلات من hindlimb الماوس. A Hindlimb. من الماوس الأسبوع 8 الكبار القديمة. الأسهم تشير إلى القاصي (الركبة) والقريبة وتر وتر (القدم). B. الوضعية التشريحية للعضلات الظنبوبي (TA) الأمامي وأصابع إبهام اليد الباسطة (EDL) العضلات. C. من خلال عقد EDL من خلال وتر القريبة، يتم سحبها العضلات نحو الركبة لفضح وتر البعيدة. D. وتر البعيدة هوقطع ويتم تحرير EDL.
الشكل 2. ممثل نتائج تجربة العزلة ليف عضلي واحد. A. صور مشرقة من حقل تجربة العزلة ليف عضلي في خطوة الغسيل الأول. السهم الأحمر يشير myofibers الحية، يشير السهم الأبيض myofibers المتعاقد فرط السهم الأصفر يشير إلى والخلايا، ليف عضلي أو الحطام ECM. B. بعد يغسل متتالية في DMEM، myofibers فقط حية لا تزال قائمة. وC C '. صورة تمثل طويلة سليمة حية ليف عضلي (C) وفرط قصيرة التعاقد ليف عضلي (C '). شريط 10 ميكرومتر. أخذت الصور مع المجهر محوري زايس Z1 المراقب مجهزة HR AxioCam.
الارقام .. ه 3. ممثل نتائج تجربة ليف عضلي ثقافة واحدة. A. صور حقل برايت لليف عضلي واحد يعيش مع الخلية المرتبطة التابعة لها (السهم) مباشرة بعد العزلة (توقيت 0). B. كانت مطلية myofibers واحد على Matrigel ومثقف في المتوسط الغنية المصل لمدة 15 يوما. يشير السهم الأبيض myotubes متباينة بالمقارنة مع خلايا مفردة (السهم الأصفر) C. myofibers واحدة من Myf5Cre، وتم تربيتها RosaYFP الماوس كما في B. سهم يشير Myf5 myotubes مشتقة. وD E. تم عزل TdTomato وثابتة مباشرة بعد؛ myofibers واحدة من Pax7Cre. تشير الأسهم Pax7 إيجابية الخلايا الأقمار الصناعية هادئة (E، أحمر). كانت counterstained النوى مع دابي (D). شريط: 50 ميكرومتر. أخذت الصور مع المجهر محوري زايس Z1 المراقب مجهزة HR AxioCam.
الشكل 4. تم عزل سبيل المثال من تلطيخ المناعي للخلايا الفضائية على myofibers. myofibers واحدة ومثقف لمدة 72 ساعة في ظروف متغيرة. كانت ملطخة الخلايا الفضائية على القمر الصناعي myofibers لPax7 الخلية علامة معينة (B، أحمر) وعامل عضلي Myod التنظيمية (C، أخضر). كانت counterstained النوى مع دابي (A). أشرطة: 50 ميكرومتر. أخذت الصور مع المجهر محوري زايس Z1 المراقب مجهزة HR AxioCam.
| تشريح العضلات (5 دقائق كل العضلات) |
|
| الهضم العضلات (30-45 دقيقة) |
|
| الألياف العزلة |
|
| الثقافة الألياف (تصل إلى أسابيع 3-4) |
|
الجدول 1. نظرة عامة على بروتوكول العزلة ليف عضلي، كما تضمن البروتوكول العزلة ليف عضلي يتكون من 4 خطوات رئيسية. لكل خطوة، وتناقش الوقت التقريبي والنقاط الحرجة الرئيسية. لمناقشة تفصيلية لكل خطوة من الخطوات، راجع النص البروتوكول.
Discussion
عزلة وثقافة واحدة من العضلات myofibers سليمة توفر ممتازة في نموذج المختبر لدراسة عملية تجديد العضلات. ومن المزايا الفريدة لهذا النظام هو الحفاظ على خلايا القمر الصناعي في بيئتهم الفسيولوجية الصفيحة القاعدية تحت. والأهم من ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية للتحقيق في تصرفات الخلايا الجذعية العضلية في كل من السكون والدول المنشط. على مدى السنوات ال 20 الماضية، قدمت منظومة الثقافة ليف عضلي رؤى هادفة في علم الأحياء من السكان الخلية الفضائية فيما يتعلق بكل من المحددات الجوهرية وخارجي. من myofibers الفردية زراعة، وقد عولجت الخلايا الأقمار الصناعية التجانس فيما يتعلق ليف عضلي، ونوع العضلات أو المحتملة التجدد 15. وضع الدراسات باستخدام التصوير الحية من الألياف مثقف واحد يسمح لاكتساب المعلومات الفضائية على خلية نمط الهجرة 16. الحصول على البيانات الكمية هيممكن يسوتو. على الرغم من أن تستغرق وقتا طويلا، فإنه يوفر معلومات مهمة بشأن توزيع وقوع أحداث معينة (الخلايا الجذعية غير المتماثلة شعبة، والانتشار والتمايز النسبة، وما إلى ذلك). جنبا إلى جنب مع التطبيقات التي سبق وصفها، أو استخراج البروتين RNA واحد من الألياف الممكن أيضا، على الرغم من عزلة السكان نقية من خلايا الأقمار الصناعية من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية أو وسائل أخرى يمكن أن توفر أفضل منصة للتحقيق التغييرات التعبير الجيني البروتين أو على المستوى الجزيئي. في تجربتنا، فإن الخطوة الأكثر أهمية بالنسبة لنجاح العزلة الألياف هو "وتر لوتر" العزلة (الخطوات 2،5 حتي 2،9 في النص البروتوكول). هذا يضمن أنه بعد الهضم العضلات، يتم إطلاق الألياف من مؤسسة كهرباء لبنان بأقل ضرر أو لا وبالتالي زيادة أدائهم في الخطوات التالية.
Disclosures
لا المصالح المتنافسة.
Acknowledgments
نود أن نشكر سارة ديك لتوفير القراءة النقدية والتعليقات. MAR يحمل كرسي أبحاث كندا في علم الوراثة الجزيئية والباحث هو البحث الدولية للمعهد هوارد هيوز الطبي. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة إلى MAR من المعاهد الوطنية للصحة، ومعهد هوارد هيوز الطبي، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة، ورابطة الضمور العضلي وكرسي أبحاث برنامج كندا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130-1g | Prepare fresh all times for optimal results. Additional aliquots of undiluted collagenase can be stored at -20 °C. |
| DMEM High Glucose + NaPyr | Invitrogen | 11995073 | Addition of Pen/Strep is necessary to minimize air contaminations |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | Lot #KUJ35152 |
| Horse Serum | Hyclone | SH300.74.03 | Lot #AVJ82494 |
| Chicken Embryo Extract | Accurate Chemical | CE-650-T, Batch B7035010 | Avoid freezing-thawing cycles. |
| Matrigel | BD | Store aliquots at -20 °C. Avoid freezing-thawing cycles. Store diluted aliquots at 4 °C. | |
| Equipment | |||
| Cohann-Vannas Spring Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Extra Thin Iris Scissors- 10.5cm | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Moria-Iris Forceps Curved | Fine Science Tools | 11373-12 | |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | 14672-200 |
| Diamond Pen | VWR | 52865-005 | |
| 60*15mm Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
| Acrodisc 0.22 μm Filter | VWR | CA28-145-477 | |
| Dissecting Microscope StemiV6 | Zeiss | An additional light source may be required to have a better focus view | |
References
- Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Dev. Biol. 115 (1), 129-139 (1986).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 31 (10), 773-779 (1995).
- Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Misunoya, W. Single muscle fiber isolation and culture for cellular molecular, pharmacological, and evolutionary studies. Methods Mol. Biol. 798, 85-102 (2012).
- Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods Mol. Biol. 290, 281-304 (2005).
- White, R. B., Biérinx, A. S., Gnocchi, V. F., Zammit, P. S. Dynamics of muscle fibre growth during postnatal mouse development. BMC Developmental Biology. 10 (21), 1-11 (2010).
- Siegel, A. L., Kuhlmann, P. K., Cornelison, D. D. Muscle satellite cell proliferation and association: new insights from myofiber time-lapse imaging. Skeletal Muscle. 2 (1), 1-7 (2011).
- Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods Mol. Biol. 798, 53-64 (2012).
- Engler, A. D., Griffin, M. A., Sen, S., Bonnemann, C. G., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: pathological implications for soft or stiff microenvironments. J. Cell. Biol. 166 (4), 877-887 (2004).
- Boonen, K. J., Post, M. J. The muscle stem cell niche: regulation of satellite cells during regeneration. Tissue Eng. Part B Rev. 14 (4), 419-431 (2008).
- Wozniak, A. C., Anderson, J. E. Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence. Biochem. Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).
- Verma, M., Asukura, A. Efficient Single Muscle Fiber Isolation from Alcohol-Fixed Adult Muscle following β-Galactosidase Staining for Satellite Cell Detection. J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 60-67 (2001).
- Wosniak, A. C., Pilipowics, O., et al. C-Met expression and mechanical activation of satellite cells on cultured muscle fibers. J. Histochem. Cytochem. 51 (11), 1437-1445 (2003).
- Huard, J., Feero, W. G., Watkin, S. C., Hoffman, E. P., Rosenblatt, J. D., Glorioso, J. C. The basal lamina is a physical barrier to herpes simplex virus-mediated gene delivery to mature muscle fibers. J. Virol. 70 (11), 8117-8123 (1996).
- Feero, W. G., Rosenblatt, J. D., et al. Viral gene delivery to skeletal muscle: insights on maturation-dependent loss of fiber infectivity for adenovirus and herpes simplex type 1 viral vectors. Hum. Gene Ther. 8 (4), 371-380 (1997).
- Kuang, S., Kuroda, K., grand, F. L. e, Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129 (5), 999-1010 (2007).
- Siegel, A. L., Atchison, K., Fisher, K. E., Davis, G. E., Cornelison, D. D. 3D timelapse analysis of muscle satellite cell motility. Stem Cells. 27 (10), 2527-2538 (2009).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Zammit, P., Golding, J. P., Nagata, Y., Hudon, V., Partridge, T. A., Beauchamp, J. R. Muscle satellite cells adopt divergent fates: a mechanism for self-renewal. J. Cell Biol. 166 (3), 347-357 (2004).
