Summary
Isolatie en cultuur van myovezels is de gouden standaard
Abstract
Regeneratie van de spieren in de volwassen wordt uitgevoerd door ingezeten stamcellen genoemd satelliet cellen. Satelliet-cellen worden gedefinieerd door hun positie tussen de basale lamina en de sarcolemma van elk myofiber. De huidige kennis van hun gedrag is sterk afhankelijk van het gebruik van de interne myofiber isolatie protocol. In 1985, beschreef een Bischoff protocol enkele levende vezels van de m. flexor digitorum brevis (FDB) van volwassen ratten isoleren met het doel om een in vitro systeem waarbij de fysische associatie tussen de myofiber en stamcellen wordt bewaard maken 1. In 1995, Rosenblattmodified de Bischoff protocol zodanig dat myovezels worden afzonderlijk geplukt en de hantering gescheiden na collagenase digestie plaats van geïsoleerd door zwaartekracht sedimentatie 2, 3. De Rosenblatt of Bischoff-protocol is inmiddels aangepast aan de verschillende spieren, leeftijd of omstandigheden 3-6. De single myofiber isolatietechniek is een onmisbaargereedschap door de unieke voordelen. Ten eerste, in de interne myofiber protocol, worden satelliet cellen gehandhaafd onder de basale lamina. Dit is een unieke eigenschap van het protocol als andere technieken, zoals fluorescentie-geactiveerde celsortering vereisen chemische en mechanische weefsel dissociatie 7. Hoewel het myofiber cultuur systeem kan geen vervanging zijn voor in vivo studies, biedt het een uitstekend platform om relevante biologische eigenschappen van de spier stamcellen aan te pakken. Single myovezels kunnen worden gekweekt in standaard galvaniseer omstandigheden of zwevend omstandigheden. Satellietcellen op drijvende myovezels onderworpen aan vrijwel geen andere invloed dan de myofiber milieu. Substraat stijfheid en coating is aangetoond satellietcellen vermogen om de spieren 8, 9 regenereren beïnvloeden dus kunnen elk van deze factoren onafhankelijk regelen maakt onderscheid tussen niche-afhankelijke en-onafhankelijke reacties. Verschillende concentraties serum hebbenOok is aangetoond dat een effect op de overgang van rust tot activering. Om de rust toestand van de bijbehorende satelliet cellen te behouden, moeten vezels worden bewaard in lage serum medium 1-3. Dit is vooral handig bij het bestuderen van genen die betrokken zijn bij de rust staat. In serum rijk medium, satelliet-cellen snel te activeren,, vermenigvuldigen, migreren en differentiëren, waardoor het nabootsen van de in vivo regeneratieve proces 1-3. Het systeem kan worden gebruikt om een verscheidenheid van assays zoals het testen van chemische remmers voeren, ectopische expressie van genen door virus productietijd; oligonucleotide gebaseerde gen knock-down of live imaging. Dit artikel beschrijft de video protocol momenteel in ons laboratorium om enkele myovezels isoleren van de extensor digitorum longus (EDL) spier van volwassen muizen (6-8 weken oud).
Protocol
Alle experimenten werden behandeld volgens de Universiteit van Ottawa voorschriften voor dierlijke zorg en behandeling.
Zie tabel 1 voor een overzicht van het protocol.
1. Voordat u begint de Isolatie
- Bereid de volgende oplossingen:
0,2% collagenase type I in DMEM (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's, hoge glucose, L-glutamine met 110 mg / ml natriumpyruvaat). Twee EDL spieren bereiden van 2 ml 0,2% Collagenease in DMEM. Filtreer de oplossing door 0,22 urn filter. 10 min voor de isolatie voorverwarmen bij 37 ° C in een waterbad. Extra aliquots van onverdunde collagenase kan worden ingevroren bij -20 ° C voor later gebruik.
Opmerking: gebruik DMEM met natriumpyruvaat door heel de procedure. Vezels niet overleven in natriumpyruvaat-vrij medium.- Wasmedia (gebruiken om alle wasbeurten uit te voeren). Supplement DMEM met 1% penicilline / streptomycine. Filtreer door 00,22 um filter voor gebruik.
- Myofiber cultuur media. Supplement DMEM met 20% FBS, 1% kippenembryo extract en 1% penicilline / streptomycine. Filtreer door 0,22 urn filter vóór gebruik.
- Matrigel coating gerechten. Om cultuur vezels voor langere tijd, raden we u aan Matrigel als coating substraat. Om Matrigel beklede schalen bereiden ontdooien een hoeveelheid Matrigel bij 4 ° C overnacht. De dag na, verdunnen Matrigel 1:10 in DMEM. Matrigel houden bij 4 ° C te allen tijde voorkomen abrupte temperatuurschommelingen, aangezien dit microscopische kristallen maken in de Matrigel oplossing resulteert in ongelijke coating. Plaats gerechten te bekleden op het ijs. Coat gerechten met net genoeg volume om het oppervlak te bedekken. Laat het zitten voor 1 minuut. Volledig verwijderen van de overgebleven Matrigel. Laat schotels droog bij 37 ° C gedurende ten minste 3 uur vóór gebruik of overnacht.
Opmerking: aliquots van verdunde Matrigel kan worden hergebruikt meerdere keren coating doel indien bewaard bij 4 & deg; C. - Ten slotte moet u de microscoop station en ontleden van gereedschappen schoon met 70% ethanol.
- Voor twee EDL isolatie (een muis) bereiden vijf plastic petrischalen (60 x 15mm) als volgt:
- Vier gerechten voor de isolatie (1 voor spier dissociatie, 3 voor seriële wasbeurten). Alle gerechten moeten worden bekleed met paardenserum (GS) om myovezels voorkomen die verbonden zijn aan plastic. Te bekleden, pipet 3 ml paardenserum in elke schaal, swirl zelfs coating toe, verwijder de paardenserum en laat de schotel drogen gedurende ten minste 30 minuten. Voeg 4 ml DMEM aan elke schaal. Houden schotels bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor gebruik.
Opmerking: Horse serum kan worden hergebruikt meerdere malen, indien bewaard steriel. Als alternatief kan een oplossing van 10% HS in DMEM worden gebruikt voor het coaten gerechten. Gebruik HS gecoat gerechten gedurende de hele protocol en wanneer kweken myovezels op drijvende omstandigheden.- Een schotel worden gebruikt om de cultuur myovezels na isolatie. Alternative gerecht maten of formaten kunnen worden gebruikt voor de uiteindelijke cultuur van myovezels afhankelijk van afgeleide toepassingen. Dat doen we echter niet suggereren gerecht die groter zijn dan 60 * 15mm. Myovezels kan worden gehouden in suspensie niet langer dan 96 uur vóór hyper contractie optreedt. Voor langere cultuur keren, raden we u aan Matrigel gecoate borden of schalen.
- Voor een vezel isolatie (2 EDL), voor te bereiden twee steriele Pasteurpipetten: een grote boring pipet voor spier handling en een kleine boring pipet voor myofiber manipulatie. Gebruik een diamant pen aan elke glazen pipet snijden op de gewenste lengte en warmte polish om pipet de randen glad te strijken. Door de vlam curve de punt van de pipet kleine boring. Dit zal helpen het manipuleren van enkelvoudige vezels. Flame te steriliseren. Coat elke pipet met HS voor gebruik.
2. Spier Dissection en Spijsvertering
- Voor de toepassing van deze experimenten, 8 weken oude SV129, Pax7 creer Cklr; Rosa26TdTomato (Pax7Cre-TdTomato) en Myf5-Cre; Rosa26YFP gebruikt.
- Spuit achterste ledematen met 70% ethanol. Speld het dier (naar boven) op een steun boord om een beter begrip van het achterste lidmaat tijdens de procedure.
- Met behulp van een schaar, dwars door de gehele lengte van het been en bloot de onderliggende spier. Verwijder de huid en alle haar of bont (Figuur 1A).
- Met een fijne schaar, dwars door de dunne fascia zonder beschadiging van de onderliggende spieren. Visueel lokaliseren van de EDL. De EDL wordt gevonden in het voorste compartiment van de achterste ledematen net onder de tibialis anterior (TA) spier.
- Met de hulp van twee tangen, bloot de distale pezen.
- Snijd de distale pezen (van zowel de TA en EDL) met scherpe Cohann-Vannas lente schaar.
- Met de hulp van een tang houd beide TA en EDL spieren door hun pezen en delicaat trek de spieren omhoog naar het proximale uiteinde. Op dit punt moet je in staat om duidelijk te ziende EDL spier net onder de TA spier. Nu scheiden EDL van de TA spier door aan de twee pezen in tegengestelde richtingen (figuur 1B). Vermijd uitrekken van de EDL spier tijdens het uitvoeren van deze operatie, omdat dit tot beschadiging van de myovezels.
- Maak de EDL pees. Om beter te visualiseren de proximale pees kan het helpen op dit punt aan de TA spier te verwijderen. Het kan ook helpen om een afgesneden het bindweefsel rond de knie (figuur 1C).
- Snijd de proximale pees los en verwijder voorzichtig de EDL (figuur 1D).
- Door vast te houden de spier door middel van haar pezen, overbrengen naar 2 ml vooraf bereide collagenase oplossing. Incubeer bij 37 ° C in een waterbad.
Opmerking: voor succesvolle isolatie vezel, is het belangrijk om de EDL zodat isoleren van pees aan pees die de myofiber integriteit gehandhaafd. Stappen 2,3 tot 2,9 kan onder een dissectiemicroscoop. Als alternatief, het gebruik van een magnzenden, glas kan ook helpen om een beter beeld van de spieren te hebben. - Herhaal de stappen 2,3 tot 2,9 op de tweede EDL te isoleren. Breng de tweede EDL in dezelfde buis. Een ongelijkmatige spijsvertering voorkomen moet isolatie van de tweede EDL vullen niet meer dan 5 minuten na de eerste.
Noot 1: incubatietijd kan nodig worden aangepast afhankelijk van collagenase activiteit. Langere of kortere incubatie nodig kan zijn afhankelijk van de grootte, leeftijd en / of spier aandoening (bijvoorbeeld fibrotische spieren nodig langere digestietijd).
Opmerking 2: Als het onderzoek van satelliet cellen gedrag onder omstandigheden rust, opwinding tijdens spier spijsvertering tijd kan activeren satelliet cellen 10. - Tijdens de spijsvertering tijd, regelmatig de spier om over-vergisting te voorkomen. Stop de spijsvertering als de spieren beginnen te los te komen en myovezels zichtbaar zijn. De spijsvertering stoppen, voorzichtig overbrengen beide spieren een voorverwarmde petrischaal met 4 ml DMEM (dissociatiop schotel). Gebruik de grote boring pipet om deze bewerking uit te voeren.
Opmerking: vermijd spier overdigestion, omdat dit onvermijdelijk leidt tot het isolement van hyper gecontracteerd myovezels.
3. Single myofiber Dissociatie en cultuur
- Om myovezels vrij te geven, gebruikt u de grote boring glazen pipet om de spier te spoelen met warm medium tot vezels natuurlijk beginnen wordt vrijgegeven. Niet Vermaal de spier, omdat dit zal onvermijdelijk leiden tot schadelijke vezels. Voer deze en de volgende stappen onder een dissectie microscoop.
- Ga door het vrijgeven van myovezels totdat het gewenste aantal bereikt is. Als de schotel moet bij kamertemperatuur gedurende meer dan 10 min kan een 5 min (minimum) incubatie bij 37 ° C, 5% CO2 opnieuw equilibreren het medium.
Opmerking: Als product tot temperaturen onder fysiologische (37 ° C) gedurende langere tijd myovezels sterven. - Met behulp van de kleine boring pipet, transfer leven enkele myovezels een nieuwe voorverwarmde schotel (eerste van drie opeenvolgende wasbeurten). Handvat elk afzonderlijk myofiber plaats van overdracht van bulk myovezels tegelijk. Indien nodig incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 10-15 min opnieuw equilibreren het medium.
- Herhaal stap 3.3 voor nog 2 keer of totdat alle dode myovezels en vuil worden verwijderd. We raden ten minste drie opeenvolgende wasbeurten voor een goede clean-up.
Opmerking: dead myovezels zal verschijnen zo kort en hyper aangegaan onder de microscoop licht. - Incubeer enkele myovezels bij 37 ° C, 5% CO2 in de laatste wassing schotel (DMEM only) voor ten minste een uur vóór schakelen naar kweekmedium. Hiermee myovezels naar de passen in vitro omstandigheden in afwezigheid van serum. Wij vonden dat onmiddellijke cultuur van myovezels in serum rijk medium verhoogt vezels krimpen.
- Na een uur, over te dragen myovezels om een nieuw voorverwarmde schaal of naar de juiste cultuur-formaatAfhankelijk van de stroomafwaartse toepassing. Cultuur vezels in hoge serum middellange tot satelliet-cel activatie mogelijk te maken. Als alternatief kunnen verschillende concentraties serum of chicken embryo extract worden gebruikt. Wijzig medium om de andere dag.
4. Downstream Toepassingen
- Immunokleuring. Live myovezels worden gefixeerd en gekleurd op elk tijdstip tijdens de isolatie. Immunofluorescentie kunnen worden uitgevoerd op zowel drijvende als substraat aangesloten myovezels. Als vlekken drijvende myovezels, met een kleine boring glazen pipet om myovezels van de ene oplossing naar de andere. Als alternatief is het mogelijk om myovezels houden in hetzelfde putje gedurende de gehele procedure en / toevoegen verwijderen oplossingen met een glazen pipet. Vermijd standaard aspiratie omdat dit resulteert in de verwijdering van de myovezels ook. In het kort volledig verwijderen kweekmedium; fix myovezels in voorverwarmde 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 5 minuten. Uitgebreid wassen in PBS meerdere malen. Incubatiete myovezels in 1% glycine in PBS of andere standaard quenching oplossingen PFA achtergrondkleuring minimaliseren. Eventueel doorlaatbaar myovezels met 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten gevolgd door een 5 minuten wassen in PBS. Incubeer vezels in blokkeeroplossing (10% paardenserum, 0,1% Triton X-100, 1% NaN) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij voorkeur 4 ° C. Alternatieve blokkerende oplossingen worden gebruikt, afhankelijk van het antilichaam van belang. Was eenmaal in PBS gedurende 5 minuten. Incubeer de juiste primaire antilichaam verdund in blokkeringsoplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. Wassen vezels 3 keer 5 min per wasbeurt in PBS om alle ongebonden antilichaam te verwijderen. Incuberen met het geschikte secundaire antilichaam gedurende 45 min tot 1 uur bij kamertemperatuur. Was drie keer met 5 min per wasbeurt in PBS. Tegenkleuring kernen met 1 mg / ml DAPI. Als vlekken zwevende vezels, breng elke vezel aan een glasplaatje geschikt voor microscopie. Verwijder overtollig PBS of medium. Breng montage medium en voeg vervolgens dekglaasje aan. Ga door naar myovezels visualiseren onder een fluorescentie microscoop. Zie afbeelding 4 voor representatieve immunofluorescentie op EDL myovezels. Alternatieve kleuringen met sterkere fixeermiddelen zijn beschreven in Verma, M. et al.. 11 en Wosniak, AC et al.. 12.
- Oligonucleotide of plasmide transiënte transfectie. Live myovezels worden getransfecteerd met plasmide of siRNA specifieke gen / s plaats. Bij het gebruik van siRNA, is dubbel transfectie aanbevolen voor een efficiënte gen knockdown. We raden uitvoeren van de eerste transfectie na 8 uur uit het isolement. Zes uur na de transfectie vervangen door vers medium. Voor siRNA transfectie raden wij beginnen met een eindconcentratie van 50 nM. Genexpressie knockdown kunnen worden geanalyseerd door RNA extractie of bij voorkeur door immunokleuring.
- Virale infectie. Infectie van live myovezels is mogelijk, hoewel de incidentie van de celdood hoger dan bij oligo transfectie en de efficiëntie van infectie kan variëren naargelang van spieraandoeningen en leeftijd. Bijvoorbeeld intact volwassen spier myovezels bijzonder niet reageren op virale infectie door de aanwezigheid van de basale lamina die is aangetoond dat een beschermende barrière tegen infectie gastheer 13, 14 voorzien. Lentivirale vectoren de voorkeur boven retrovirale vectoren, omdat ze infecteren rust (niet mitotische) cellen. Voor virusinfecties, is het raadzaam om cultuur vezels op een Matrigel gecoate schaal of plaat en laat myovezels passen aan media voorwaarden voor de eerste 24 uur.
- Leef Imaging. Leven beeldvorming van myovezels is bijzonder tijdrovend en noodzaakt een microscoop uitgerust met een 37 ° C, 5% CO2 kamer. Het is nuttig bij de beoordeling van het gedrag van enkele satelliet cellen. Werk gedaan met behulp van deze techniek is behulpzaam geweest voor de ontdekking van satelliet-cel heterogeniteit en hun beha te bestuderenVior van vezels (15 en 16).
Representative Results
Hier beschrijven we de isolatie van enkele myovezels van de EDL spier van volwassen muizen. Succesvolle myovezels rendement is afhankelijk van verschillende factoren, zoals collagenase activiteit of spieraandoeningen of leeftijd. Belangrijker, de isolatie van de spier van pees pees resulteert in lange, intact myovezels van EDL spier. Figuur 1 toont een stapsgewijze grafische weergave van de "pees tendon" isolatie. Zodra de spier volledig verteerd worden myovezels model door toepassing lichte druk de spier. Figuur 2A toont een representatief beeld van een myofiber isolatie-experiment na de eerste wasbeurt. Op dit punt de cultuur een mengsel van bundels van enkele myovezels die verschijnen als lange en glanzende buisvormige structuren bevat, hyper gecontracteerd myovezels die zijn donker en kort en puin van het verteringsproces. Tegen het einde van ten minste drie opeenvolgende wasbeurten alleen enkele levende myovezels blijven in de dish voor cultuur of downstream analyse (Figuur 2B). Figuur 2C toont een lang levende vezels vergeleken met een hyper afgesloten vezel (C). Ten tijde van de isolatie, satellietcellen als kleine uitsteeksels op de myofiber (figuur 3A). Indien hij wordt onderhouden in serum rijk medium, satelliet-cellen te activeren,, vermenigvuldigen, migreren en uiteindelijk versmelten tot myotubes (B). Na 15 dagen in cultuur, alle myotubes drukken de Myf5 verslaggever YFP (C) suggereert dat regeneratie van de spieren in de volwassen wordt uitgevoerd door cellen die op een bepaald punt in hun ontwikkeling had geuit de myogene bepalende factor Myf5. Alle satelliet cellen brengen het gekoppelde box transcriptiefactor Pax7 17. De reporter muizenlijn Pax7Cre-TdTomato kan worden gebruikt om sporen via satelliet cellen de expressie van het TdTomato fluorescentiesignaal (figuren 3D en E). Figuur 4 toont een representatieve immunofluorescence van dubbele Pax7 + / MyoD satelliet cellen. Klassiek dubbel Pax7 + / MyoD + satelliet cellen worden beschouwd als proliferatieve toegewijde spier voorlopercellen waarin de differentiatie programma zal ofwel door naar beneden reguleren Pax7 met behoud MyoD expressie of terugkeer naar de rust door naar beneden reguleren MyoD en onderhouden van Pax7 expressie 18
Figuur 1. EDL spier isolatie van muis achterpoot. Een. Achterbeen van een 8 weken oude volwassen muis. Pijlen geeft de distale (knie) pees en het proximale (voet) pees. B. Anatomische positie van de tibialis anterior (TA) spier en de extensor digitorum longus (EDL) spier. C. Door vast te houden de EDL door de proximale pees, wordt de spier getrokken in de richting van de knie naar de distale pees bloot te leggen. D. De distale peesgesneden en de EDL wordt losgelaten.
Figuur 2. Representatieve resultaten van een enkel myofiber isolatie-experiment. Een. Helderveld foto van een myofiber isolatie-experiment bij de eerste wasstap. Rode pijl geeft aan live-myovezels, witte pijl geeft aan hyper gecontracteerde myovezels en gele pijl geeft aan cellen, myofiber of ECM puin. B. Na opeenvolgende wasbeurten in DMEM alleen levende myovezels blijven. C en C '. Beeld vertegenwoordigt een lange intact levend myofiber (C) en een korte hyper gesloten myofiber (C '). Bar 10 urn. Foto's zijn gemaakt met een Zeiss Axio Observer Z1 microscoop uitgerust met Axiocam HR.
Figur e 3. Representatieve resultaten van een enkel myofiber cultuur experiment. Een. Helderveld beeld van een enkele, live myofiber met de bijbehorende satelliet cel (pijl) direct na de isolatie (Time 0). B. Single myovezels werden uitgeplaat op Matrigel en gekweekt in serum rijk medium gedurende 15 dagen. Witte pijl geeft gedifferentieerd myotubes in vergelijking met enkele cellen (gele pijl) C. Single myovezels van een Myf5Cre; RosaYFP muis werden gekweekt zoals in B. Pijl geeft Myf5 afgeleide myotubes. D en E. Single myovezels van Pax7Cre; TdTomato werden geïsoleerd en gefixeerd direct na. Pijlen geven Pax7 positief rust satelliet cel (E, rood). Kernen werden tegengekleurd met DAPI (D). Bar: 50 urn. Foto's zijn gemaakt met een Zeiss Axio Observer Z1 microscoop uitgerust met Axiocam HR.
Figuur 4. Voorbeeld immunofluorescentiekleuring van satelliet cellen op myovezels. Single myovezels werden geïsoleerd en gekweekt gedurende 72 uur in zwevende omstandigheden. Satelliet cellen op myovezels werden gekleurd voor de satelliet cel specifieke marker Pax7 (B, rood) en de myogene regulerende factor MyoD (C, groen). Kernen werden tegengekleurd met DAPI (A). Bars: 50 pm. Foto's zijn gemaakt met een Zeiss Axio Observer Z1 microscoop uitgerust met Axiocam HR.
| Muscle Dissection (5 min elke spier) |
|
| Muscle Spijsvertering (30-45 min) |
|
| Fiber isolatie |
|
| Fiber Cultuur (tot 3-4 weken) |
|
Tabel 1. Overzicht van de myofiber isolatie-protocol. De myofiber isolatie protocol bestaat uit 4 grote stappen. Voor elke stap worden de geschatte tijd en de belangrijkste kritische punten besproken. Voor gedetailleerde bespreking van elke stap, zie het protocol tekst.
Discussion
De isolatie en cultuur van enkele myovezels uit intacte spieren biedt een uitstekende in vitro model om het proces van spierregeneratie bestuderen. Een uniek kenmerk van dit systeem is het behoud van satelliet cellen in de fysiologische omgeving onder de basale lamina. Vooral kan de techniek worden gebruikt om spieren stamcellen gedrag in zowel rust en geactiveerde toestanden onderzoeken. In de afgelopen 20 jaar heeft de myofiber cultuur stelsel van zinvolle inzichten in de biologie van de satelliet cel populatie met betrekking tot zowel intrinsiek als extrinsiek determinanten. Door het kweken van de individuele myovezels, heeft een satelliet-cel heterogeniteit met betrekking tot myofiber, spier-type of regeneratief potentieel aangepakt 15. Uitgebreide studies met behulp van live beeldvorming van enkele gekweekte vezels toegestaan voor het verkrijgen informatie op satelliet cel migratiepatroon 16. De overname van kwantitatieve gegevens is eenlso mogelijk. Hoewel tijdrovend, biedt belangrijke informatie over de verspreiding en optreden van specifieke voorvallen (stamcellen asymmetrische deling, proliferatie en differentiatie ratio, etc.). Samen met eerder beschreven toepassingen, eiwit of RNA-extractie uit enkelvoudige vezels is ook mogelijk, hoewel isolatie van zuivere populatie van cellen door FACS satelliet of andere middelen kan een beter platform om eiwit of genexpressie verandert onderzoeken op moleculair niveau. In onze ervaring, de meest kritische stap voor een succesvolle vezel isolatie is de "pees pees" isolatie (stappen 2,5 tot 2,9 in het protocol tekst). Dit garandeert dat na spier spijsvertering, vezels vrijkomen uit de EDL met minimale of geen schade waardoor hun prestaties in de volgende stappen.
Disclosures
Geen tegenstrijdige belangen.
Acknowledgments
Wij willen Sarah Dick bedanken voor het verstrekken van kritisch lezen en opmerkingen. MAR houdt de Canada Research Chair in Moleculaire Genetica en is een International Research Scholar van het Howard Hughes Medical Institute. Dit werk werd ondersteund door subsidies in stand MAR van de National Institutes of Health, de Howard Hughes Medical Institute, de Canadese Institutes of Health Research, de Muscular Dystrophy Association en de Canada Research Chair Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130-1g | Prepare fresh all times for optimal results. Additional aliquots of undiluted collagenase can be stored at -20 °C. |
| DMEM High Glucose + NaPyr | Invitrogen | 11995073 | Addition of Pen/Strep is necessary to minimize air contaminations |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | Lot #KUJ35152 |
| Horse Serum | Hyclone | SH300.74.03 | Lot #AVJ82494 |
| Chicken Embryo Extract | Accurate Chemical | CE-650-T, Batch B7035010 | Avoid freezing-thawing cycles. |
| Matrigel | BD | Store aliquots at -20 °C. Avoid freezing-thawing cycles. Store diluted aliquots at 4 °C. | |
| Equipment | |||
| Cohann-Vannas Spring Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Extra Thin Iris Scissors- 10.5cm | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Moria-Iris Forceps Curved | Fine Science Tools | 11373-12 | |
| Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | 14672-200 |
| Diamond Pen | VWR | 52865-005 | |
| 60*15mm Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
| Acrodisc 0.22 μm Filter | VWR | CA28-145-477 | |
| Dissecting Microscope StemiV6 | Zeiss | An additional light source may be required to have a better focus view | |
References
- Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Dev. Biol. 115 (1), 129-139 (1986).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 31 (10), 773-779 (1995).
- Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Misunoya, W. Single muscle fiber isolation and culture for cellular molecular, pharmacological, and evolutionary studies. Methods Mol. Biol. 798, 85-102 (2012).
- Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods Mol. Biol. 290, 281-304 (2005).
- White, R. B., Biérinx, A. S., Gnocchi, V. F., Zammit, P. S. Dynamics of muscle fibre growth during postnatal mouse development. BMC Developmental Biology. 10 (21), 1-11 (2010).
- Siegel, A. L., Kuhlmann, P. K., Cornelison, D. D. Muscle satellite cell proliferation and association: new insights from myofiber time-lapse imaging. Skeletal Muscle. 2 (1), 1-7 (2011).
- Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods Mol. Biol. 798, 53-64 (2012).
- Engler, A. D., Griffin, M. A., Sen, S., Bonnemann, C. G., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: pathological implications for soft or stiff microenvironments. J. Cell. Biol. 166 (4), 877-887 (2004).
- Boonen, K. J., Post, M. J. The muscle stem cell niche: regulation of satellite cells during regeneration. Tissue Eng. Part B Rev. 14 (4), 419-431 (2008).
- Wozniak, A. C., Anderson, J. E. Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence. Biochem. Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).
- Verma, M., Asukura, A. Efficient Single Muscle Fiber Isolation from Alcohol-Fixed Adult Muscle following β-Galactosidase Staining for Satellite Cell Detection. J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 60-67 (2001).
- Wosniak, A. C., Pilipowics, O., et al. C-Met expression and mechanical activation of satellite cells on cultured muscle fibers. J. Histochem. Cytochem. 51 (11), 1437-1445 (2003).
- Huard, J., Feero, W. G., Watkin, S. C., Hoffman, E. P., Rosenblatt, J. D., Glorioso, J. C. The basal lamina is a physical barrier to herpes simplex virus-mediated gene delivery to mature muscle fibers. J. Virol. 70 (11), 8117-8123 (1996).
- Feero, W. G., Rosenblatt, J. D., et al. Viral gene delivery to skeletal muscle: insights on maturation-dependent loss of fiber infectivity for adenovirus and herpes simplex type 1 viral vectors. Hum. Gene Ther. 8 (4), 371-380 (1997).
- Kuang, S., Kuroda, K., grand, F. L. e, Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129 (5), 999-1010 (2007).
- Siegel, A. L., Atchison, K., Fisher, K. E., Davis, G. E., Cornelison, D. D. 3D timelapse analysis of muscle satellite cell motility. Stem Cells. 27 (10), 2527-2538 (2009).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Zammit, P., Golding, J. P., Nagata, Y., Hudon, V., Partridge, T. A., Beauchamp, J. R. Muscle satellite cells adopt divergent fates: a mechanism for self-renewal. J. Cell Biol. 166 (3), 347-357 (2004).
