Isolamento e cultivo de fibras musculares é o padrão ouro<em> In vitro</em> Sistema para estudar a passagem de células através da activação de satélite quiescência e a diferenciação. É importante notar que o sistema de cultura de células musculares único preserva a associação de células fibromuscular / haste, que é um componente essencial do nicho de células-tronco do músculo.
Regeneração muscular no adulto é realizada por células estaminais residentes chamadas células satélite. Células satélites são definidas pela sua posição entre a lâmina basal e o sarcolema de cada fibra muscular. O conhecimento científico actual do seu comportamento fortemente dependente da utilização do protocolo de isolamento única fibra muscular. Em 1985, Bischoff descrito um protocolo para isolar as fibras individuais em directo da flexor Brevis (FDB) de ratos adultos, com o objectivo de criar um sistema in vitro em que a associação física entre a fibra muscular e as células estaminais são preservados os seus 1. Em 1995, o protocolo Rosenblattmodified Bischoff tal que as miofibras são individualmente colhidos e tratados separadamente, após digestão com colagenase em vez de serem isolados por sedimentação por gravidade 2, 3. O Rosenblatt ou Bischoff protocolo já foi adaptado para diferentes músculos, idade ou condições 3-6. A técnica de isolamento é uma única fibra muscular indispensávelferramenta devido suas vantagens únicas. Em primeiro lugar, no protocolo fibromuscular único, as células satélites são mantidas abaixo da lâmina basal. Esta é uma característica única do protocolo como outras técnicas, como a classificação de fluorescência celular ativado exigem química e mecânica do tecido dissociação 7. Embora o sistema de cultura de fibra muscular não pode substituir para estudos in vivo, ele oferece uma excelente plataforma para abordar relevantes propriedades biológicas de células-tronco musculares. Miofibras individuais podem ser cultivadas em condições normais de revestimento, ou em condições de flutuação. Células satélites em miofibras flutuantes são submetidos a praticamente nenhuma influência diferente do ambiente de fibra muscular. Rigidez do substrato e do revestimento têm sido mostrados para influenciar a capacidade de células satélites "para regenerar músculos 8, 9 de modo a ser capaz de controlar a cada um destes factores de forma independente permite a discriminação entre nicho-dependentes e independentes de respostas. Diferentes concentrações de soro têmTambém foi mostrado para ter um efeito sobre a transição da quiescência da activação. Para preservar o estado de quiescência das suas células satélites associados, as fibras devem ser mantidas em meio de soro baixo 1-3. Isto é particularmente útil quando se estuda os genes envolvidos no estado de repouso. Em meio rico soro, as células satélites ativar rapidamente, proliferam, migram e se diferenciar, assim, imitando o processo regenerativo in vivo 1-3. O sistema pode ser utilizado para realizar uma variedade de ensaios, tais como o teste de inibidores químicos; expressão ectópica de genes de vírus da entrega; gene baseada oligonucleótido knock-down ou imagens ao vivo. Este artigo descreve o protocolo de vídeo utilizado atualmente em nosso laboratório para isolar miofibras simples do extensor longo dos dedos (EDL) músculos de camundongos adultos (6-8 semanas de idade).
O isolamento e cultura de miofibras individuais a partir de músculos intactos fornece um excelente modelo in vitro para estudar o processo de regeneração muscular. Uma característica única do presente sistema é a preservação de células satélites no seu ambiente fisiológico abaixo da lâmina basal. Mais importante, a técnica pode ser utilizada para investigar o comportamento de células estaminais musculares, tanto quiescência e estados activados. Ao longo dos últimos 20 anos, o sistema de cultura de células musculares forneceu introspecções significativas sobre a biologia da população de células satélite em relação a ambos os determinantes intrínsecos e extrínsecos. Por fibras musculares individuais de cultura, a heterogeneidade de células satélites em relação à fibra muscular, tipo de músculo ou potencial regenerativo foi abordada 15. Elaborar estudos usando imagens ao vivo de um único fibras cultivadas permitidos para as informações sobre o padrão de satélite ganhando a migração de células 16. A aquisição de dados é um quantitativoslso possível. Embora demorado, que fornece informações importantes sobre a distribuição e a ocorrência de eventos específicos (células estaminais rácio divisão proliferação, diferenciação e assimétrico, etc.) Juntamente com as aplicações acima descritas, a proteína ou a extracção de ARN a partir de fibras individuais é também possível, embora o isolamento da população pura de células satélites por FACS ou outros meios podem proporcionar uma melhor plataforma para investigar mudanças de expressão de proteínas ou genes num nível molecular. Em nossa experiência, o passo mais importante para o isolamento de fibra de sucesso é o "tendão para tendão" isolamento (passos 2,5-2,9 no texto do protocolo). Isto garante que, após a digestão do músculo, as fibras são libertadas a partir do EDL com danos mínimos ou sem aumentando assim o seu desempenho nas etapas seguintes.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Sarah Dick para a prestação de leitura crítica e comentários. MAR detém a Cátedra de Pesquisa do Canadá em Genética Molecular e é um estudioso de Pesquisa Internacional do Howard Hughes Medical Institute. Este trabalho foi financiado por doações para MAR dos Institutos Nacionais de Saúde, do Howard Hughes Medical Institute, dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, a Associação de Distrofia Muscular e do Canadá Research Chair Programa.
Reagent/Material | |||
Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130-1g | Prepare fresh all times for optimal results. Additional aliquots of undiluted collagenase can be stored at -20 °C. |
DMEM High Glucose + NaPyr | Invitrogen | 11995073 | Addition of Pen/Strep is necessary to minimize air contaminations |
Characterized Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | Lot #KUJ35152 |
Horse Serum | Hyclone | SH300.74.03 | Lot #AVJ82494 |
Chicken Embryo Extract | Accurate Chemical | CE-650-T, Batch B7035010 | Avoid freezing-thawing cycles. |
Matrigel | BD | Store aliquots at -20 °C. Avoid freezing-thawing cycles. Store diluted aliquots at 4 °C. | |
Equipment | |||
Cohann-Vannas Spring Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp | Fine Science Tools | 15000-02 | |
Extra Thin Iris Scissors- 10.5cm | Fine Science Tools | 14088-10 | |
Moria-Iris Forceps Curved | Fine Science Tools | 11373-12 | |
Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | 14672-200 |
Diamond Pen | VWR | 52865-005 | |
60*15mm Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
Acrodisc 0.22 μm Filter | VWR | CA28-145-477 | |
Dissecting Microscope StemiV6 | Zeiss | An additional light source may be required to have a better focus view |